甲状腺疾病生物标志物检测 与临床诊断价值
【摘要】甲状腺疾病患病人群日渐增加，对于快速诊断和鉴别甲状腺疾病就尤为重要，甲状腺疾病诊断的方法主要是通过实验室检查联合B超检查，其中实验室检查我们最为熟悉和重要的就是甲状腺功能的检查，其实还有很多敏感性和特异性都较高的实验室检查也在甲状腺疾病诊断中发挥重要的临床价值，故该综述主要总结了目前临床常用的12个甲状腺疾病实验室诊断项目，并列出其检测指标正常参考范围，最后对于甲状腺疾病实验室诊断方面进行总结归纳并指出未来仍需努力探讨的方向。
【关键词】甲状腺疾病；实验室检查；诊断
甲状腺疾病是非常常见的内分泌疾病，近年来，甲状腺疾病的患病率逐年增加，目前，我国的甲状腺疾病总患病率接近20%，同时全球甲状腺疾病患病率也在20%左右；调查结果显示，现在我国甲状腺功能亢进患病率为1.5%，欧洲甲亢患病率约0.8%，美国为1.3%[1]；甲状腺功能
减退患病率为13.95%，甲状腺结节患病率最高，达到了20.43%。且结节恶性率为5%-15%，即甲状腺癌[2]。随着实验检测技术的不断发展,甲状腺疾病实验室诊断能够在临床诊断甲状腺疾病中提供很好的依据，有着重要的临床价值。我们整理了常用的甲状腺疾病实验检测的项目，包括甲状腺功能检测、甲状腺相关自身抗体检测、甲状腺激素合成功能测定、甲状腺球蛋白测定、降钙素、甲状腺激素在机体组织中效应评价、下丘脑-垂体-甲状腺轴评价、尿碘检测、五肽胃泌素激发试验、血清微小RNA、白细胞分化抗原195（CD195）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）以及甲状腺细针穿刺活检12个方面。并列举了重点检测项目的主要检测方法，比较其优缺点。甲状腺疾病实验室诊断会由于国家、地区、年代、组织、年龄、性别、检测方法、检测仪器以及针对不同的甲状腺疾病等众多因素影响，而出现差别，所以各指标并未形成固定不变的正常范围标准，下面主要是2012年中华医学会检验分会达成的甲状腺疾病应用建议[3]及2015年美国甲状腺协会指南[4]或最新的接受度较高的正常范围。
一、甲状腺功能检测与临床诊断价值促甲状腺激素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT３)、游离甲状腺素（FT４)、三碘甲状腺原氨酸（T３）、甲状腺素（T４）、血浆中99%以上的三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine assay，T3）和甲状腺素（thyroxine concentration assay，T4）与血浆蛋白结合，发生可逆性的结合，由于只有游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine assay，FT3）和游离甲状腺素（free thyroxine concentration assay，FT4）才可以进入到靶细胞发挥作用，因此FT3、FT4值能很好地反映甲状腺功能。下丘脑-腺垂体-甲状腺轴调节甲状腺素的合成与分泌，FT3、FT4发生变化，负反馈调节下丘脑促甲状腺激素释放激素（Thyrotropin ReleasingH o r m o n e ， T R H）和垂体促甲状腺激素（Th y r o i dStimulating Hormone，TSH）释放。由于不同检测方法的存在，又可因样本检测过程中提纯不足或所采用检测信号不同或不同试剂盒有不同的二级标准品，由于这些因素共同作用，各指标并未形成固定不变的正常范围标准。
1. 促甲状腺激素（TSH）：由腺垂体分泌，腺垂体分泌促甲状腺激素，受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素（TRH）的促进性影响，又受到甲状腺激素负反馈性的抑制性影响，且二者互相拮抗，它们组成了下丘脑-腺垂体-甲状腺轴[5]。临床意义：血清TSH增高见于原发性甲状腺功能减退、伴有甲状腺功能低下的桥本病、TSH分泌瘤、缺碘性地方性甲状腺肿等疾病。TSH减低见于原发性甲状腺功能亢进症、各种垂体性疾病、TSH基因突变、各种甲状腺炎的损伤期等疾病。现在主要的测定方法有放射免疫测定法和化学发光免疫分析法；放射免疫测定法成本较低、操作也较化学发光免疫分析法简单，放射免疫测定法：取患者肘静脉血4ml，离心处理，时间10min，转速3000r/min，离心后将血清放置于标记的试管中，进行检测；化学发
光免疫法检测：取患者肘静脉血4ml，离心处理，时间10min，转速3000r/min，离心后将血清放置于标记的试管中，用全自动化学发光免疫分析仪行检测，在检测期间可以利用酶标记生物活性物质进行检查，免疫反应复合物上的发光底物和酶作用在信号试剂下发光，在发光信号检测器的引导下进行发光检测; 并用过氧化物酶标记抗体，免疫反应后，鲁米诺作为发光底物，最后使用增强发光剂，增强发光信号，这样可以在较长的时间中维持稳定，从而提高结果准确度，研究表明，通过化学发光免疫法检测出的TSH阳性检出率高于放射免疫测定法，且差异有统计学意义 ( P＜0.05)[6]。TSH建议正常参考范围是：0.3-5mIU/L[7]。
2 . 总甲状腺素( T T 4) 和总三碘甲状腺原氨酸
（TT3）：T3是主要发挥生物活性的甲状腺激素，其中10%-20%由甲状腺合成与释放，另外的80%-90%来自周围组织T4的脱碘；T4全部由甲状腺产生，每天约产生80—100ug。血清中99.96%的T4以与蛋白结合的形式存在，其中90%与甲状腺激素结合球蛋白（TBG）结合，
TT4测定的是这部分结合于蛋白的激素。临床意义：TT3增高：诊断甲状腺功能亢进最灵敏的指标，是诊断T3型甲亢的特异性指标；TT3降低：多见于甲状腺功能减低；TT4升高常见于甲状腺中毒症：突眼性甲状腺功能亢进症、无痛性甲状腺炎、亚急性甲状腺炎等；降低常见于：甲状腺功能减退症：慢性甲状腺炎、垂体性甲状腺功能减退症、克汀病、碘有机化障碍等；
建议正常参考范围是：TT3：1.2-2.9nmol/L，TT4：64-154nmol/L[7]。甲状腺激素的测定多采用免疫标记法来直接测定血液中激素的含量，其中放射免疫分析法（RIA）是激素等超微量的物质分析史上重大的突破,使曾经无法分析的极微量物质能够精确定量；后又在RIA基础上,发展了非放射性标记免疫方法：酶联免疫分析（EIA）、电化学发光免疫测定（ECLIA）等方法，由于RIA测定甲状腺激素,有放射性污染, 并且发现难以检测到丧失免疫活性的物质且假阳性与假阴性率比较高，故应用逐渐减少，ELISA与ECLIA测定无放射性污染，特异性、灵敏度也均有很大提高,并且其标志物的制备简易、有效期长，不过其自动化的程度不高，但随着自动化分析仪不断普及，全自动流水线化学发光法检测甲状腺激素也已经得到广泛的应用[8]。为了减少分析前标本收集整体误差发生，有研究指出可以使用促凝管，研究分析含促凝剂试管其血液凝固时间、1h血清析出率和血清分离效果优于普通硅化玻璃管, 加入促凝剂其高效的分离效果适合急诊标本的检测和大量自动化分析仪高效检测的需求[9]。3. 游离三碘甲状腺原氨酸（FT３) 和游离甲状腺素（FT４）：游离三碘甲状腺原氨酸（FT３）与游离甲状腺激素（FT４)是实现该激素生物效应主要的部分，与甲状腺激素生物效应有密切的关系，且含量不受甲状腺结合球蛋白的影响。因此在甲亢和甲减的诊断、病情评估及疗效监测方面起着重要作用[10]。临床意义：增高见于甲状腺功能亢进，甲状腺瘤，甲状腺中毒症；降低见于甲状腺功能减退症，低白蛋白血症，急慢性肾衰，肝硬化等。建议正常参考范围是：FT3：2.1-5.4pmol/L，FT4：9-25pmol/L[7]。测定方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法和荧光免疫分析法；与放射免疫分析和酶联免疫分析比较，化学发光免疫分析结合两者优势，能达到最佳检测效果，最快检测速度和最高检测精度，在临床应用广泛[11]。
临床众多研究表明，应该针对不同年龄阶段设立不同参考区间，例如年龄小于65岁（19-64岁）的人，FT3、FT4和TSH分别为3.40-6.44、10.26-19.25pmol/L和0.50-4.81μIU/mL。65～79岁的人，FT3、FT4和TSH分别在3.01～5.91、10.04～19.76pmol/L和0.54~5.51μIU/mL之间。80～100岁的人，FT3、FT4、TSH分别在2.82～5.57、9.79～21.22pmol/L、0.31
～6.28μIU/mL之间变化；妊娠期间TT3、TT4较正常范围升高1.5倍[3]。儿童TSH、T3、T4、FT3、FT4五项在7d～1岁时，含量高于成年人，在12岁之后逐渐下降并趋于成人正常范围[12]。
二、甲状腺相关自身抗体检测与临床意义抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、抗甲状腺过氧化
酶抗体（TPOAb）、促甲状腺素受体抗体（TRAb）[13,14]。马金莲选取168例甲状腺疾病患者，包括84例自身免疫性甲状腺疾病组，84例非自身免疫性甲状腺疾病组，另外选取80例健康体检者作为对照组。对比不同组间患者血清TPOAb及TGAb的浓度或阳性率。发现自身免疫性甲状腺疾病组的TGAb、TPOAb、TRAb水平明显高于对照组和非自身免疫性甲状腺疾病组，差异有统计学意义（P＜0.05)，具有很好的临床价值[15]。
1. 抗甲状腺球蛋白抗体（anti-thyroglobulinantibodies，TGAb）：是自身免疫性甲状腺疾
病患者血清中的一种常见自身抗体。甲状腺球蛋白（TG）[16]是TGAb的靶抗原，是一种由甲状腺上皮细胞合成和分泌的可溶性的碘化糖蛋白。抗甲状腺球蛋白抗体与甲状腺组织的损伤有密切关系，在一定程度上可以帮助检测是否患有甲状腺疾病。常用试验方法有间接免疫荧光法、酶联免疫分析法、放射免疫分析法、电化学发光免疫分析法；健康人TGAb为阴性。
2. 抗甲状腺过氧化酶抗体（TPOAb）：抗甲状腺过氧化酶抗体（TPOAb）[17]是指甲状腺组织自身抗体，与甲状腺组织免疫学损伤密切相关。TPOAb的主要临床应用：诊断桥本氏病（HD）和自身免疫性甲亢；毒性弥慢性甲状腺肿（Graves）。试验方法有间接免疫荧光法、酶联免疫分析法、放射免疫分析法、电化学发光免疫分析法；建议正常参考范围≤0.6U/ml[7]，黄海涛,陈婷婷等选取150例甲状腺疾病患者，包括30例甲状腺功能亢进症、30例甲状腺功能减退症、30例甲状腺炎、30例甲状腺囊肿、30例甲状腺瘤患者，另外选取35例健康人，比较各组间的T３、T４、FT３、FT４、TSH、TGAb、TPOAb的水平，研究发现：30例甲亢患者血清TSH水平低于对照组，T３、T４、FT３、FT４水平高于对照组，差异有统计学
意义（P＜0.05）；甲减组血清TSH水平高于对照组，T３、T４、FT３、FT４水平低于对照组，（P＜0.05）。甲状腺炎组TSH水平低于对照组，FT３水平高于对照组，（P＜0.05）；甲亢组、甲状腺炎组、甲减组、甲状腺瘤组TGAb、TPOAb的水平均高于对照组，（P<0.05）；所以甲状腺功能7项指标T３、T４、FT３、FT４、TSH、TGAb、TPOAb联合检测可以很好地反映患者甲状腺功能，利于诊断及鉴别甲状腺疾病[7]。
3. 促甲状腺素受体抗体（TRAb）：TRAb是反映甲状腺患者是否康复的重要指标。提示毒性弥漫性甲状腺肿病可能。建议正常参范围＜0.09-0.55U/L[18]。
甲状腺相关自身抗体同甲状腺激素一样，全自动化学发光免疫分析亦在临床应用广泛且优势突出。
三、甲状腺激素合成功能测定
甲状腺吸131I试验原理：甲状腺是具有高度聚碘能力的，其程度能够达到血浆浓度的25~500倍。并且甲状腺摄取碘离子数量与速度与甲状腺本身的功能状态有十分密切的关系。试验方法：予受试者一定剂量的131I，之后在不同时间用探测器在甲状腺部位测量131I的放射强度,如2h、3h、4h、6h、24h，后计算出吸收率，以判断甲状腺的吸碘功能。若甲状腺吸131I升高，常见于甲状腺功能亢进、缺碘性甲状腺肿、单纯性甲状腺肿及应用较强的利尿剂等情况。甲状腺吸131I减低，常见于原发性甲状腺功能减退症、急性亚急性甲状腺炎、肾上腺皮质功能减退、垂体功能减退等疾病。建议正常范围：口服碘后,甲状腺吸131I功能曲线逐渐上升，24h达高峰。正常值会因为不同地区食物、水源、食盐等含碘量的情况而有所差别，用盖格计数管，在3小时为5%-25%，24小时为20%-45%[19]。
四、甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）测定甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）属于糖蛋白，分子量约660kD，由两条蛋白链构成，TG绝大多数由甲状腺细胞合成并释放进入甲状腺滤泡残腔中，对于外周甲状腺激素T3、T4的合成起着决定作用，健康人群血液中可有低浓度的TG存在，有低浓度的TG存在表明有甲状腺组织的存在，甲状腺全切除术后TG就测不出。TG的临床意义：一是甲状腺体形态完整性的特殊标记物，二是鉴别亚急性甲状腺炎和假甲状腺毒症，三是可以监测分化的甲状腺癌患者在甲状腺全切除术后和经放射碘治疗后的病情[20]，四可以用作甲状腺癌的血液指标参考。建议正常参考范围：3-40μg/L[3]，由于碘摄入会影响TG的水平，所以各地区的标准并不相同[3]。比较电化学发光免疫分析法（electroch（immunoloradiometricassay，IRMA和ECLIA）两种方法，显示两方法所测结果的判读一致性较好，经过秩和检验分析显示,使用IRMA检测的TG结果比ECLIA低，也有研究表示RIA法检测TG受TGAb的干扰使TG检测结果较真实值偏高，故临床更推荐ECLIA法[21]。
五、降钙素（calcitonin，CT）
降钙素（calcitonin，CT）是由甲状腺滤泡旁细胞（C细胞）分泌的一种多肽激素，主要的生理功能是抑制破骨细胞的生成，增强成骨过程；使骨组织释放的钙盐减少，促进骨盐沉积；增加尿磷，降低血钙和血磷；降钙素临床意义是用于诊断和监测甲状腺髓质癌的特异且敏感的肿瘤标志物。建议正常参考范围：＜10ng/L[3]。检测方法可用时间分辨免疫荧光法与电化学发光
法，研究分析两者具有很好的一致性，且时间分辨免疫荧光法（time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA），用稀土金属（Eu、Tb等）作为长效荧光标记物，
在关闭激发光后测定荧光强度，操作简便、易实现自动化，可以有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度[22]。
六、甲状腺激素在机体组织中效应评价
1. 基础代谢率[23]：基础代谢率是人体在基础状态下的能量代谢，其中基础状态是指人没有受到环境温度、肌肉活动、食物及精神紧张等因素影响，处在清醒而又安静的环境时，并且要至少12小时未进食，室温20℃，静卧半小时，保持清醒状态，不进行脑力和体力活动的情况下。不超出或不低于正常值的15%，均是正常的。基础代谢率是诊断甲状腺疾病的主要辅助方法，甲状腺机能亢进时，基础代谢率可明显升高，可比正常值增加40%-80%；甲状腺机能低下
时基础代谢率则明显降低，可比正常值低40%-50%。测量方式有直接测热法、间接测热法以及公式推测法，计算公式有：基础代谢率%=1.28×（脉率+脉压差）-116（Kosa）；基础代谢率%=0.75×（脉率+脉压差×0.74）-72（Reed）；基础代谢率%=（脉率+脉压差）-111（Gale法）；基础代谢率%=0.75×（脉率+脉压）-72；正常值：-10%~+15%。
2. 跟腱反射松弛时间测定：骨骼肌收缩松弛速度可以间接地反映甲状腺功能，可以用专门的仪器测定，甲亢时跟腱反射松弛时间会缩短，甲减时时间延长，正常成年人为230-390ms，跟腱反射松弛时间受到很多因素影环境、年龄、性别、运动状态、妊娠等。
3. 无创性心功能检查：可以利用心电图、超声心动图获得心脏收缩时间，甲亢时，时间缩短，甲减时，时间延长。
七、下丘脑-垂体-甲状腺轴评价
1. 促甲状腺激素兴奋试验：垂体分泌的TSH对于甲状腺细胞有起兴奋作用，使甲状腺功能活跃，聚碘的能力也增强，使甲状腺激素释放增加，予外源性TSH，观察甲状腺激素水平的变化，可以鉴别甲状腺功能低下是继发垂体的病变还是甲状腺自身的病变，若病变在于垂体，TT3、TT4会增加。
2. 促甲状腺激素释放激素兴奋试验[5]：下丘脑分泌的TRH促进垂体TSH的合成释放，予外源性TRH后，观察血清TSH变化，可以反映垂体TSH分泌细胞储备功能及其对于TRH的敏感性。正常值：注射TRH后20分钟，血浆TSH升高会达到高峰，能够在基础值上平均增加5-30mU/L。
3. 甲状腺激素抑制试验[24]：健康人群服用外源性T3后，血中T3的浓度升高，负反馈抑制垂体TSH细胞，使TSH分泌减少，使得甲状腺摄碘被抑制，为甲状腺激素抑制试验阳性，若患有Graves病，则T3、T4过多的分泌，并不是由于TSH刺激引起的，而是因为甲状腺兴奋性自身抗体（TSAb）所引起的，所以，在服用外源性T3后，甲状腺摄碘能力并不被抑制。检测方法：首先记录患者摄131I率，第一次摄131I后，服用T3，20μg/次，tid，连续服用6天，在第7天测试第二次摄131I率，计算T3抑制率：（第一次摄131I率-第二次摄131I率）/第一次摄131I率*100%；正常范围：健康人群，摄131I率在服用外源性T3后，会出现明显的抑制，T3抑制率＞50%，＜25%定义为未被抑制。
八、 尿碘检测
测定尿碘反映最近几天碘摄入情况，碘摄入过多，则可能造成碘甲亢（HH）和自身免疫性甲状腺疾病（AITH），然而碘摄入不足，可能会导致地方性甲状腺肿，克汀病等；尿碘的检测方法有：干灰化法和湿灰化法；推荐标准：尿碘中位数在100-199μg/L时，说明碘摄入适宜，若尿碘中位数在200-299μg/L，说明碘营养水平超过适宜量，超过300μg/L，则说明碘摄入过量，若尿碘中位数在50-99μg/L，说明存在轻度碘缺乏，尿碘中位数在20-49μg/L，说明存
在中度碘缺乏，尿碘中位数＜20μg/L，则为重度碘缺乏[25]。
九、五肽胃泌素激发试验
甲状腺髓样癌[26]或C细胞增生的患者与正常人相比，注入五肽胃泌素之后，降钙素会出现大幅度的增高，采集静脉血5ml，测定降钙素（CT）记录基础值，后根据体重注射0.5μg/kg五肽胃泌素，在2分钟和5分钟分别采集5ml静脉血，测定降钙素。五肽胃泌素激发后，女性CT最高可以达到50ng/L，男性最高可以达到79ng/L，对于明确诊断甲状腺髓样癌的患者手术前人降钙素（hCT）水平可能会增高正常的10-10000倍，在手术后hCT会在数小时内降低。
十、血清微小RNA
血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1是肿瘤细胞释放到体液中的以及其本身细胞内的微小RNA（miRNA），不编码蛋白质，对RNA酶不敏感，是癌症的潜在生物标志物。甲状腺肿瘤最常见的类型是甲状腺乳头状癌（PCT），研究发现，联合血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1检查对于PCT早期诊断有很好的临床价值。例如程燕等收集70例健康体检者，70例
甲状腺乳头状癌患者，70例良性甲状腺结节患者，用实时荧光定量PCR检测血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1，用酶联免疫吸附法检测血清甲状腺球蛋白（TG），发现三组的miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1和TG水平存在统计学差异（P＜0.05），并且联合检
测miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1和TG诊断早期甲状腺乳头状癌的敏感性能够达到94.29%，特异性能够达到88.57%[27]，正常参考范围：miR-451a阳性临界值1.029，miR-25-3p阳性临界值1.046，GAS8-AS1阳性临界值0.7135。
十一、外周血液白细胞分化抗原195（CD195）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）
白细胞分化抗原（Cluster of Differentiation，CD）是不同谱系白细胞在正常分化成熟的不同阶段及其活化的过程中，出现或消失的细胞表面标记；趋化性细胞因子是一个蛋白质家族，这些蛋白在氨基端多含有一个或两个半胱氨酸，MCP-1可趋化单核细胞；CD1 9 5 和M C P -1被认为其参与甲状腺免疫活性紊乱的病理过程，茹平等研究发现甲减患者的MCP-1水平和CD195阳性细胞百分比比健康人显著增高（P=0.000），CD195和MCP-1水平与桥本甲状腺炎（HT）的发生发展密切相关，对于HT早期诊断有很好的临床价值[28]，正常参考范围：CD195＜25%，MCP-1＜30%。
十二、甲状腺细针穿刺活检（ f i n e n e e d l easpiration biopsy；FNA）
FNA是在超声引导下对可疑甲状腺结节进行穿刺，并取部分结节组织进行病理活检，根据病理结果判断甲状腺结节的良恶性。在术前可以鉴别甲状腺结节的性质，为甲状腺疾病的个体化精准治疗提供依据，是甲状腺诊治决策的关键。FNA的适应症包括所有甲状腺肿大Ⅰ度以上患者及有甲状腺结节者，FNA诊断的结果分为未诊断、良性病变、可疑病变和恶性。研究展望：有研究表明，联合应用各项实验室指标对甲状腺疾病进行联合诊断时，特异性和敏感性均高于单项检测结果[15]，现在实验室检测项目与方法日新月异，有单一检测特异性高者，亦有联合检测敏感性增加者，查阅文献后能够发现全自动化学发光免疫分析仪在甲状腺疾病实验室诊断中现有很高的临床价值，具有准确度高且操作简便、快速等多种优点，但因为多种因素的影响，并未确定好明确的指标正常范围，例如邱玲等运用临床大数据研究发现年龄和性别因素对于TSH、FT3、FT4有显著的影响，女性和高龄TSH分布范围更宽，FT3、FT4更低，并且季节因素也对TSH有影响，冬季TSH水平最高；这仅仅是年龄、性别、季节因素的影响，我们还应考虑民族、地区、碘摄入量、昼夜、身体质量指数、是否生育等因素的影响，进行临床大数据统计分析后，建立个性化的正常范围参考区间[29]。综上所述，根据多种因素划分更细的分组建立各指标的正常范围，是我们今后研究的重点，有待我们进一步探讨。
