多色流式细胞术在糖尿病诊疗 中的应用现状和发展趋势
糖尿病是一组代谢异常的慢性病，病因主要是机体胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用不足，或两者因素兼有，患者以高血糖为典型特征 [1] 。根据2019年世界卫生组织（WHO）糖尿病分型诊断指南，糖尿病主要分为1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病、妊娠期首次发现高血糖、混合型糖尿病及未分类糖尿病等六大类型 [2] 。1型糖尿病和2型糖尿病是最常见的两类，我国95%的糖尿病患者为2型糖尿病，病因主要是胰岛素抵抗、胰岛素进行性分泌不足或两者兼有；1型糖尿病在我国较少见，常在幼年和青少年阶段发病，主要由环境因素如病毒感染、饮食等或免疫因素作用于遗传易感个体而导致的器官特异性自身免疫病。
长期高血糖使患者其他组织器官易受损病变，心脏病、周围动脉和脑血管疾病、视网膜病、肾病和神经病变等是糖尿病患者高发的并发症，也是引起患者死亡的重要原因。此外糖尿病还增加了某些传染性疾病如结核病、新型冠状病毒肺炎 [3] 等的患病险。
流式细胞术是一种通过流式细胞仪对单个细胞或单个微粒进行多参数、快速分析的生物医学检测技术，自20世纪70年代第一台流式细胞仪问世以来，流式细胞仪及相关的检测试剂和检测技术有了飞速的发展和提高，流式细胞术在临床医学、科研和工业上也得到了广泛的开发和应用。流式细胞仪结合激光技术、电子光学技术、电子计算机技术、荧光免疫等技术于一体，通过检测如骨髓、外周血、组织、体液等标本，可以对细胞成分、数量、活化状态、分化发育以及蛋白质和核酸等进行检测分析，临床上常用于自身免疫性疾病、代谢性疾病、感染性疾病、肿瘤及血液疾病等的分型诊断、治疗、疗效评估及预后监测。
本文根据流式细胞术常见的临床检测项目，结合糖尿病的发病机制、诊断与治疗、并发症及预后监测等内容，综述多色流式细胞术在糖尿病诊疗中的应用现状和进展。
一、免疫精细分型检测
1. 免疫异常与糖尿病：免疫细胞及其分泌的细胞因子的数量、比例、状态及功能的异常是多种疾病的发生、发展的重要原因，也是糖尿病发病的重要机制。如CD8+T细胞经MHC I类分子递呈的抗原激活并释放穿孔素和颗粒酶杀伤胰岛β细胞，引起胰岛β细胞破坏和功能衰竭，是致1型糖尿病的主要效应细胞；CD4+T细胞通过分泌细胞因子引发迟发型超敏反应炎症，导致胰岛细胞损伤 [4] ；另外B细胞、调节性T细胞、巨噬细胞及树突状细胞（DC细胞）等免疫细胞及其分泌的细胞因子IL-6、TNF-α等在糖尿病及并发症的病理发生机制中发挥重要作用。
2. 流式细胞术免疫精细分型：流式细胞仪结合荧光素标记单克隆抗体技术检测免疫细胞和细胞因子是评估机体免疫功能和状态的快速、准确、可靠的方法，其原理主要依据于免疫细胞特定的免疫表型及活化和发育不同阶段特定的免疫标志，如T淋巴细胞表型为CD3+，B淋巴细胞表型为CD3+CD19-，自然杀伤细胞（NK细胞）表型为CD3-CD16+CD56+等；CD25、HLA-DR、CD38和CD69等分别为细胞活化不同时期的标志 [5] ；Ki67、CFSE等可检测细胞的增殖 [6] 。
3. 免疫精细分型在糖尿病诊疗中的应用：监测机体免疫为糖尿病及其它代谢性疾病和免疫相关疾病的致病机理和发展机制提供免疫学参数，也为疾病的早期诊断与鉴别提供生物学指标。A.Oras等学者利用流式细胞术检测并比较新发1型糖尿病患者和健康人外周血51种免疫细胞及亚群的差异，结果发现：与健康对照组相比，新发1型糖尿病患者NK细胞，DC细胞和T细胞亚群在数量及比例上均有显著差异 [7] 。
另一方面，对自身免疫性疾病、自身炎性疾病以及接受免疫治疗和干预的患者进行免疫精细分型和动态监测，有助于为治疗方案制定、治疗靶点筛选、药物选择和剂量调节、药效及副作用监测提供可靠、灵敏的免疫学指标和生物标志物。Abatacept（CTLA-4-Ig单抗药物）可缓解1型糖尿病的疾病进展，其作用机理为通过与抗原递呈细胞上的CD80/CD86结合降低抗原递呈细胞（APC）传递共刺激信号和激活T细胞的能力。流式细胞术检测CD4+中央（Tcm）和效应记忆T（Tem）细胞的比例 [8] 和B细胞的活化水平 [9] 是评估Abatacept的治疗效果的可靠指标。一些临床试验显示，单独应用Abatacept，Teplizumab（抗CD3药物），Rituximab（抗CD20药物），或与小剂量G-CSF、抗胸腺细胞球蛋白（ATG）联合治疗1型糖尿病，CD8+T细胞耗竭、CD4+Tcm减少和调节性T（Treg）细胞增加被认为是预后较好的免疫学指标 [10-12] 。
二、细胞因子检测
1 . 细 胞 因 子 的 分 类 与 功 能 ： 细 胞 因 子（cytokine，CK）主要由免疫细胞（如活化的淋巴细胞）和某些非免疫细胞（如脂肪细胞）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，迄今为止已发现200多种细胞因子，可根据细胞因子的分泌细胞来源、功能、分子结构特点等进行分类。其中按照细胞来源分类见表1。
细胞因子的生物、生理学功能主要包括：调控免疫识别；参与免疫细胞增殖、免疫应答与调节过程；参与炎症反应、组织修复、造血等生理病理过程。炎症、肿瘤、免疫性疾病、代谢性疾病、移植排斥等多种疾病都伴随细胞因子表达的异常，因此，检测细胞因子可对疾病的发生、发展及预后提供生物学指标和代谢标志物。
2. 细胞因子的检测方法：目前细胞因子的检测方法主要有化学发光法、流式免疫荧光微球法、酶联免疫吸附法（ELISA）、液相悬浮芯片法等，其中流式免疫荧光微球法主要基于高通量流式细胞仪检测平台，利用聚苯乙烯微球等作为载体对血清、血浆、组织液或细胞培养液中的可溶性成分进行定量检测的技术。与传统的ELISA和化学发光法相比，流式免疫荧光微球法检测细胞因子所需要的样本量少、操作简单、检测浓度范围广、速度快、高通量等特点。
3. 细胞因子与糖尿病：细胞因子参与糖尿病的发病和病程进展。脂肪细胞和免疫细胞通过分泌多种细胞因子影响机体能量代谢、炎症反应和胰岛素敏感性 [13] ，如TNF-α参与杀伤胰岛素细胞，干扰胰岛素受体信号转导，降低外周组织对胰岛素的敏感性；IL-1、IL-6、IL-18等参与胰岛炎症反应；抵抗素、内脏脂肪素和RBP4等促进胰岛素抵抗 [14-16] ；血清纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）是一种由包括脂肪细胞在内的多种细胞分泌的促血栓细胞因子 [17] ，PAI-1升高与中枢性肥胖 [18] ，代谢综合征 [19] 和2型糖尿病等密切相关。Nam Han Cho等学者检测PAI-1、抵抗素、IL-6、瘦素、单核细胞趋化蛋白1（PAC1）、TNF-α、RBP4和脂联素等八种细胞因子，通过多项逻辑回归分析评估细胞因子作为预测糖尿病患病风险指标的性能。研究结果显示：发展为2型糖尿病患者血清中RBP4、PAI-1、瘦素、抵抗素水平与糖化血红蛋白（HbA1c）水平呈正相关，且显著高于健康对照组；脂联素水平显著低于健康对照组。因此高水平的RBP4、PAI-1、瘦素、抵抗素水平和低水平的脂联素是糖尿病发病的重要预测指标。监测血清脂肪因子和细胞因子的水平有助于预测患病风险，为临床早期诊断和及早干预提供指标 [20] 。
三、血小板检测
1. 血小板活化与糖尿病并发症：糖尿病并发症以心、脑、肾等累及为主，加强对并发症的实验室诊断和管理以及治疗监测至关重要 [21] 。长期高血糖和高血脂是公认的引起动脉粥样硬化和和微血管病变的危险因素，也是导致糖尿病患者并发心血管疾病（CVD）的高危因素 [22] 。并发CVD的糖尿病患者病情更重、预后更差，且术后并发症患病风险更高 [23] ，是糖尿病患者重大的死亡原因 [24] 。血小板的数量、功能和活化参与机体正常的止血和凝血。大量研究表明，血小板过度活化和功能亢进参与动脉粥样硬化、急性动脉粥样硬化血栓性疾病如心肌梗死、中风等的病理发展过程[25] 。
2. 流式细胞术检测血小板：流式细胞术可检测血小板的数量、结构、功能及活化状态，具有灵敏度高、影响因素少、高通量、客观的优势，临床上常用于血栓和止血性疾病的监测和治疗，辅助判断患者是否需要抗血栓治疗以及监测抗血栓治疗的效果与毒副作用。
动态监测血小板活化水平，一方面可对糖尿病病情和并发症发生风险进行评估和预测。1型糖尿病血小板表面CD62P和CD36表达率、血小板-单核细胞聚集体均显著高于健康对照组，且与HbA1c水平呈正相关 [26] 。2型糖尿病患者血小板表面CD36的过表达与动脉粥样硬化密切相关 [27] ，研究表明血小板表面CD36可作为监测CVD潜在的标志物 [28] ；另外血小板CD36表达水平与糖尿病微血管并发症特别是肾病的发生有关[29] 。血小板微粒可促进血小板聚集、血栓的形成，在一些炎症性疾病、心血管疾病、糖尿病等患者中均可检测高水平血小板微粒 [30, 31] 。
另一方面，临床上控制CVD主要通过降压、调脂、抗血小板治疗等。抗血小板治疗药物主要包括环氧合酶-1（COX-1）抑制剂、GPIIb/IIIa抑制剂和二磷酸腺苷（ADP）P2Y12受体拮抗剂。由于部分糖尿病患者对抗血小板药如阿司匹林和P2Y12受体拮抗剂反应较差，导致糖尿病患者心血管并发症发生率高。因此检测血小板活化可以评估抗血小板治疗的效果。有学者通过流式细胞仪检测血小板活化标志CD62P和PAC-1评估丹酚酸A（SAA）的抗血小板作用，结果发现SAA可以抑制2型糖尿病患者的血小板活化和聚集 [32] 。因此，将血小板活化与常规血糖、血脂和血压及其它代谢指标结合，可以为临床早期敏感预测并发症、评估抗血小板治疗疗效与副作用、降低心血管并发症发病风险提供指标；同时可以为开发新型抗血小板药物提供治疗靶点和数据支撑。
四、胰岛移植监测
胰岛移植可增加1型糖尿病患者胰岛细胞的数量，恢复胰岛素、胰高血糖素等激素的分泌，减少并发症的发生。胰岛移植的主要风险与手术、免疫抑制治疗和超敏反应等有关。器官移植的成功需要机体免疫功能和免疫状态保持在合适的范围，一方面维持免疫耐受，避免移植排斥反应；另一方面保护机体，防止继发或机会性感染。
1. 移植前流式细胞术HLA组织配型：胰岛移植前可利用流式细胞术进行HLA组织配型。流式细胞术交叉配型（FCXM）检测受者抗HLA的抗体滴度，以确定受者是否具有抗供体的特异性抗体；群体反应性抗体（PRA）检测血清中抗HLA抗体的强度和特异性。阳性FCXM预示移植效果差，而移植排斥的风险主要与HLA特异性抗体相关；因此移植前FCXM和PRA检测可帮助临床评估患者体内的抗体水平，从而降低超急性、急性排斥反应风险，提高移植物存活率 [33, 34] 。
2. 免疫排斥反应监测：免疫排斥反应是造成移植物丢失或功能丧失的主要原因，急性排斥反应是由适应性免疫激活引起的免疫反应，参与适应性免疫应答的免疫细胞主要有NK细胞、单核细胞-巨噬细胞和中性粒细胞等 [35-37] 。先天免疫识别引起T细胞活化在免疫排斥中起着核心作用，除T细胞及亚群（如Treg等）外，B细胞及亚群（如记忆性B细胞）和DC细胞等也参与急性排斥反应的免疫应答过程。通过流式细胞术研究免疫细胞亚群、细胞因子含量和比例，有助于监测和评估排斥反应风险、免疫抑制治疗和免疫耐受 [38-40] ，为临床及时给与免疫抑制治疗提供参考。
3. 移植后免疫抑制治疗、病情与感染监测：移植后的免疫抑制治疗很大程度上决定了临床移植术的成败，应用免疫抑制剂是防治移植排斥的主要策略。临床常用的免疫抑制剂包括真菌性大环内酯类（如环孢素A、FK506）、化学类免疫抑制剂（如糖皮质激素、硫唑嘌呤等）、FTY-720和生物制剂（如抗淋巴细胞球蛋白、抗CD3单抗等）。免疫抑制剂作用机制主要包括：通过抑制T细胞、巨噬细胞等免疫细胞的增殖、活化和功能；调节免疫细胞的分化和抗炎抑炎等，从而预防和治疗器官移植排斥反应。
动态监测移植后患者免疫指标，根据免疫细胞、细胞因子等的变化，可为临床监测移植排斥反应的发生、及时救治、制定免疫抑制治疗策略、调整免疫抑制剂剂量、评估药效和副作用、监测疾病的复发、评估糖尿病或与免疫抑制有关的并发症（机会性感染和肿瘤等）的发生以及评价胰岛移植恢复代谢平衡的有效性提供代谢组学和免疫学指标。Elvira Jimenez Vera, Yi Vee Chew等学者设计和优化外周血白细胞及免疫细胞表型分型方案（见表3） [41] ，用于监测胰岛移植受者及参与移植临床试验受试者的免疫重建，通过多色流式细胞术对白细胞分类计数、粒细胞、单核细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、NK细胞、T细胞、Tregs和NKT等亚群和状态进行定量分析，监测排斥反应、免疫抑制治疗效果。
五、外泌体检测
1. 外泌体简述：外泌体是直径为30-150nm的膜囊泡，通过传递微RNA（miRNA）、长链非编码RNA、蛋白质和DNA等介导相邻或远端细胞或器官之间的信号转导，在炎症、肿瘤、自身免疫病等方面发挥重要的生物学功能 [58] 。检测外泌体一方面可为代谢性疾病如糖尿病 [59] 、阿兹海默症等的早期诊断和治疗靶点提供稳定、新型的代谢标志物 [60, 61] ，另一方面可为疾病的病理发生机制、病因研究提供新思路 [62] 。
2. 外泌体与糖尿病及并发症的发病：外泌体通过信号转导影响能量代谢、胰岛素分泌和抵抗、细胞活力以及免疫应答和炎症反应等机制参与糖尿病的病理发展过程 [63] 。几乎所有细胞都可分泌外泌体，不同来源的外泌体由于携带的信号分子不同，在糖尿病的发病和疾病进展中发挥不同的作用。淋巴细胞来源的外泌体介导miR-142-3p、miR-142-5p和miR-155等作用于胰岛β细胞，导致胰岛素β细胞选择性死亡，促进1型糖尿病的发展 [64] ；血管平滑肌细胞来源的外泌体介导miR-155从平滑肌细胞转移至内皮细胞，破坏内皮屏障增加内皮通透性，导致动脉粥样硬化等血管病变和并发病的发生 [65] 。与常规的血清或尿液代谢指标相比，外泌体作为糖尿病早期监测、疾病进展、并发症发生的生物标志物具备稳定性更强的优点。
3. 外泌体与糖尿病及并发症的治疗：外泌体作为一种微囊泡可以作为蛋白质、miRNA等成分和药物的良好药物载体 [66] ，具有低免疫原性、高靶向的优点。目前通过外泌体传递药物或信号分子调节靶细胞的功能，在糖尿病及其并发症和其他疾病如肿瘤等的治疗中具有强大的潜力和广泛的前景。动物模型和体外研究均成功利用脂肪干细胞来源的外泌体介导STAT3治疗2型糖尿病 [67] 、心肌细胞来源的外泌体介导HSP20治疗糖尿性病心肌病 [68] 。
4. 外泌体的检测方法：由于体积小、构造特殊、异质性等特点，目前检测和分析外泌体存在一定的困难和挑战。流式细胞仪可在单细胞水平对外泌体的组成成分进行精确分析和测量 [69] 。跨膜蛋白（CD9，CD63和CD81等）、HSP70、MHC和TSG101等常被用来作为标记和检测外泌体的标志物 [70] 。为了促进流式细胞术检测外泌体标准化，提高检测结果的重复性、可靠性和可比性，来自国际细胞外囊泡协会（ISEV）、国际流式细胞协会（ISAC）和国际血栓与止血学会（ISTH）的科学家成立工作组并发布流式细胞术检测外泌体的指导建议（MIFlowCyt-EV Reporting framework），该建议对分析前变量和实验设计、样品制备、分析控制、仪器校准和数据采集、外泌体表征、数据报告和数据分享等内容进行了建议和规范 [71] ，为流式细胞术检测外泌体提供参考。
六、总结与展望
国际糖尿病联盟（IDF）报道指出，2019年全球约4.63亿20-79岁成人患糖尿病；预计到2030年，糖尿病患者会达到5.784亿。近期在《英国医学杂志》发表的中国人群糖尿病流行病学调查结果显示，我国成人糖尿病患病率已将近13%，糖尿病及并发症对人民健康、医疗系统造成巨大的威胁和挑战 [72] 。临床上亟需早期、灵敏的代谢标志物和免疫学指标，以对易患人群患病风险评估、糖尿病及其并发症的发病和进展、治疗效果评估、副作用监测、新型治疗药物研发及靶点筛选，以减少糖尿病及并发症的患病率，控制糖尿病的发生和发展，提高患者生存率、存活时间和生活质量。多色流式细胞术可以通过免疫精细分型、细胞因子、外泌体及其它代谢标志物的检测为糖尿病的诊治提供代谢标志物和免疫学指标。
流式细胞检测技术是临床不可或缺的一项高科技技术，在肿瘤、感染、免疫、生殖医学、血液等疾病的诊治和基础医学研究中提供重要的信息和指标。随着检测技术的发展和临床及科研的需求增加，流式细胞仪也逐渐由单/双参数分析向多参数、由定性逐渐向定量检测、由人工向自动化发展，近几年发展起来的磷酸化流式细胞、质谱流式细胞、成像流式细胞、病毒流式细胞及体内流式细胞等，使我们能从免疫学、病理学和代谢组学层面更精细和深入地探究病理发生机制、药物作用机理等。随着新型荧光染料的开发、荧光标记单克隆技术的进一步发展以及流式荧光捕获微球技术的开发和推广，我们可以通过少量的检测样本获取高通量的信息，使得结果更为客观、准确。但同时，高通量的数据也给我们临床检验和科研工作带来挑战，标本处理和数据分析的标准化、仪器的质控和调节、标准品和对照品的开发和设立、新型标志物的临床意义与应用等有待进一步开发和完善。
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