肝药酶CYP2C19变异体的体外酶学活性研究

2021-12-16

细胞色素P450 2C19（CYP2C19）又称为S-美芬妥英羟化酶，是细胞色素P450酶超家族中的重要一员，其占人微粒体CYP450的含量很少，约0.8%-1.4%^[1]。临床上通过CYP2C19代谢的药物约占10%-15%，这些药物包括质子泵抑制剂（如奥美拉唑、兰索拉唑）、抗癫痫药（如S-美芬妥英）、β-肾上腺素受体阻断药、抗感染药（如奈非那韦）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（如西酞普兰）、镇静催眠药（如地西泮）、抗血小板药（如氯吡格雷）和抗抑郁药（如氟西汀和丙咪嗪）等^{[2, 3]}。然而，在东方人群中该酶缺陷高达15%-23%^{[4, 5]}。P450酶的基因多态性，表现为酶活性的减小、增大、不变或酶表达数量的改变，而这些改变通常会对药物代谢产生影响。其酶活性可以分为四类：弱代谢型（PMs），中间代谢型（IMs），正常代谢型（EMs）及超速代型谢（UMs）^[6]。这些蛋白酶的基因多态性在一定程度上会改变药效或者引起不良反应，因此，对CYP2C19基因多态性进行研究具有重要的临床意义。

CYP2C19是由490个氨基酸组成的蛋白，它包含9个外显子和8个内含子，定位于10号染色体上（10q24.1-10q24.3）^[7]。目前，有较多的CYP2C19变异型被鉴定评估（http://www.cypalleles.ki.se/cyp2c19.htm）。CYP2C19*1为正常基因型等位基因，即野生型等位基因。*2是在CYP2C19基因外显子5，第681个碱基处的单碱基突变（G-A），导致蛋白的合成意外被终止，从而生成的CYP2C19蛋白无酶活性^[8]。*3是在CYP2C19基因外显子4，第636个碱基处的单碱基突变（G-A），从而产生了一个终止密码子，导致提前终止蛋白的合成，因此生成的蛋白没有功能^[9]。*4是起始密码子ATG→GTG突变，蛋白质的翻译受到抑制^[10]。*5在人群中的突变发生率较低，是在血红素结合区的第1297位发生C→T的突变，引起Arg433→Trp的改变，使得CYP2C19酶活性下降导致药物的代谢减慢^[11]。*6是野生型CYP2C19*1第3外显子的第395位发生G→A的突变，从而使得氨基酸变异Arg132→Gln，产生无催化活性的酶，因此，CYP2C19*6是弱代谢型等位基因^[12]。*17是提高酶活性的突变基因，在5'-侧翼区的两个单核苷酸多态性（g.-3402C＞T和g.-806C＞T），转录因子（g.-806C＞T）的突变，导致CYP2C19酶活性增强^[13]。

常见的CYP2C19等位基因变异型有种族差异，CYP2C19 *2型和*3型是被广泛认可的弱代谢型。先前的研究表明CYP2C19*2在欧洲和非洲是常见的变异型，在中国和日本该等位基因的频率也很高；CYP2C19*3是亚洲人的常见变异型，但这种变异型在欧洲和非洲人中很少见^{[14, 15]}。CYP2C19*3在中国汉族人群中出现的频率很高，约为5.41%，而在美国黑人种族群体和白人种族群体中携带这种缺陷基因的频率只有0.6%和0.2%^{[16, 17]}。对于中国人群CYP2C19基因

多态性的研究已有很多，主要集中在常见的缺陷型CYP2C19*2和CYP2C19*3上^{[18, 19]}。据有关报道统计这两种基因型出现的频率在亚洲人群中占CYP2C19弱代谢型（PMs）的90%以上^[20]。北京医院和温州医科大学联合研究团队前期对2127份中国汉族人群的DNA进行CYP2C19基因多态性分析，通过对全部9个外显子的测序分析，共发现了24种新的非同义突变，其中11种已被CYP450国际等位基因命名委员会命名，分别是CYP2C19*2E、*2F、*2G、*2H、*2J、*3C、*29、*30、*31、*32和*33，另外还有12个非同义突变和1个嵌入变异^[16]。在前期对2127名中国汉族人的调查中发现，野生型（CYP2C19*1）、CYP2C19*2和CYP2C19*3是中国人中分布最广泛的CYP2C19基因型，分别占研究人数的61.09%，33.24%和5.41%^[16]。白种人和非洲人群中约5%的人携带这2个CYP2C19缺陷基因，而亚洲人群中比例更高，约为20%^[21]。

CYP2C19的基因多态性会导致一些药物在个体之间的代谢存在差异性，这种差异可能会导致药物治疗效果不理想或者是药物在人体内蓄积增加不良反应的发生，严重的可能会导致毒性反应，因此研究CYP2C19基因变化因素对药物代谢的影响是极其重要的。北京医院和温州医科大学联合研究团队在前期研究的基础上选择了31种CYP2C19基因型（CYP2C19*1，*2E，*2F，*2G，*2H，*2J，*3，*3C，*29，*30，*31，*32，*33，35FS，L16F, R124Q，G91R, M255T，

R261W，R125G, R132Q，A161P，T130M，R329H，A430V，N403I，I331V，N277K, N231T，I327T和S303N），研究各个基因型对抗抑郁药氟西汀、作用于心血管药物奈必洛尔、抗真菌药伏立康唑以及镇痛药美沙酮的体外代谢活性的影响，为实现临床个体化给药提供相关的参考，为中国人群的药物精准应用提供基础数据。虽然这些突变基因的发生频率非常低（P＜0.1%），但考虑到中国的人口数量高达14亿多，对这些新突变基因的功能学特征进行研究仍然非常必要。

一、抗抑郁药

氟西汀是选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂，主要用于治疗重度抑郁症、恐慌、神经性贪食症、强迫症和经前焦虑等，该药已逐步替代阿米替林和丙咪嗪作为其他新型抗抑郁药的比较标准^[22]。该药主要在肝脏中代谢，通过CYP2C19和其他CYP450酶如CYP2C9、CYP2D6经N-去甲基化生成诺氟西汀，这种代谢产物的药理效应与原型相当；氟西汀和诺氟西汀会在肝脏中经葡萄糖醛酸化反应或经O-脱烷基反应生成三氟甲基苯酚，随后代谢成马尿酸消除^[23]。以氟西汀为底物，评估野生型CYP2C19和30种CYP2C19变异型的催化活性^[23]。两个变异体CYP2C19*3和35FS活性极弱或没有活性，检测不到代谢产物，无法评估它们的酶动力学参数。与野生型相比，其余28个等位基因表现出Km或Vmax值的改变，其中T130M具有较高的Vmax和Km，其内在清除率值与CYP2C19*1相似（97.04%）。而其他27个缺陷等位基因（CYP2 C 1 9 * 2 E ， * 2 F ，*2G，*2H，*2J，*3C，*29，*30，*31，*32，*33，R124Q，M255T，R261W，R132Q，A161P，I327T，A430V，I331V，N231T，S303N，G91R，R125G，R329H，N403I，L16F，N277K）的内在清除率（Vmax/Km）值与野生型的变异体相比降低，并可人工将其

分为三类：5个变异体CYP2C19*3C、L16F、G91R、N277K和N231T的相对清除率为63.06%-77.77%归为轻度抑制组。14个变异体CYP2C19*2E、*2G、*2J、*29、*31、*32、*33、M255T、R132Q、R329H、A430V、N403I、I331V和S303N与野生型变异体的相对清除率值分别为29.96%-51.03%，属于中度抑制组。8个变异体CYP2C19*2F、*2H、*30、R124Q、R261W、R125G、A161P、I327T的相对清除率最低（为9.56%-24.85%）归为重度抑制组。三个变异体M255T、R132Q和A161P的Vmax值与野生型CYP2C19*1相似，但由于Km值较高，相应的清除率值较低（*P<0.05）。5个变异体CYP2C19*3C、*29、L16F、G91R和N231T的Vmax值与野生型相比增加，并且Km值显著增加，最终导致氟西汀的内在清除率降低。结果显示，27个CYP2C19变异体的内在清除率值低于CYP2C19*1，其降低百分比为9.56%-77.77%。与CYP2C19*1相比，变异体R124Q和R261W内在清除率分别降低为9.75%和9.56%。具体酶动力学参数见表1，相对清除率比较见图1。

表1 CYP2C19*1和30种CYP2C19变异型体外代谢氟西汀的酶动力学参数

Variants	V_max (pmol/min/pmol P450)	K_m (μM )	Clearance V_max/K_m	Relative clearance (% of wild type)
CYP2C19*1	5.221±0.042	97.58±2.842	0.0535±0.008	100
CYP2C19*2E	2.557±0.063*	147.6±11.67	0.0173±0.001*	32.38*
CYP2C19*2F	0.9157±0.018*	122.2±8.367	0.0075±0.004*	14.01*
CYP2C19*2G	1.497±0.019*	92.53±4.22	0.016±0.005*	30.24*
CYP2C19*2H	3.085±0.051*	318.4±13.18*	0.0097±0.002*	18.11*
CYP2C19*2J	3.01±0.066*	172.1±11.58	0.017±0.001*	32.69*
CYP2C19*3	ND	ND	ND	ND
CYP2C19*3C	14.41±0.582*	423.1±38.52*	0.034±0.001*	63.65*
CYP2C19*29	18.11±0.596*	786.5±46.75*	0.023±0.001*	43.04*
CYP2C19*30	4.598±0.068	403.9±13.67*	0.023±0.001*	21.28*
CYP2C19*31	4.435±0.087	290.7±14.69*	0.015±0.0002*	28.51*
CYP2C19*32	3.598±0.099	192.5±15.68	0.019±0.0006*	34.93*
CYP2C19*33	2.743±0.033*	110.1±4.698	0.025±0.0002*	46.56*
35FS	ND	ND	ND	ND
L16F	24.7±1.276*	622.7±63.03*	0.04±0.006*	74.14*
R124Q	1.499±0.03*	287.4±15.07*	0.005±0.0001*	9.75*
G91R	21.82±0.12*	524.53±6.14*	0.0416±0.0003*	77.77*
M255T	4.778±0.086	298.1±13.74*	0.016±0.0006*	29.96*
R261W	2.668±0.042*	521.4±17.03*	0.005±0.0002*	9.56*
R125G	3.701±0.129	399.7±31.13*	0.0093±0.00008*	17.31*
R132Q	6.269±0.235	312.9±29.47*	0.02±0.00024*	37.45*
A161P	5.532±0.143	431.8±24.98*	0.0128±0.00037*	23.94*
T130M	12.3±0.156*	236.9±8.309*	0.052±0.001	97.04
R329H	1.611±0.037*	79.57±6.889	0.0203±0.0017*	37.84*
A430V	2.666±0.081*	97.65±10.68	0.0273±0.0004*	51.03*
N403I	2.165±0.043*	121.7±8.215	0.0178±0.0001*	33.25*
I331V	2.179±0.03*	89.51±4.521	0.0244±0.001*	45.50*
N277K	3.366±0.043*	99.77±4.53	0.0337±0.00026*	63.06*
N231T	6.694±0.073*	193.3±6.048	0.036±0.00028*	67.33*
I327T	1.116±0.021*	83.92±5.893	0.0133±0.00053*	24.85*
S303N	2.654±0.053*	125.3±8.377	0.0213±0.0029*	39.59*

注：所有数据均以三组数据的Mean±SD表示；*p<0.05表示相比于CYP2C19*1有显著性差异；ND表示未检测到代谢产物

二、心血管药物

奈必洛尔是一种高选择性的第三代β-肾上腺素能受体拮抗剂，与其他β-受体相比该药疗效更

好，耐受性更佳，不良事件发生率更少^[24]。奈必洛尔还表现出显著的一氧化氮介导的血管舒张作用，这在目前临床上在用的β受体阻滞剂中是独一无二的^{[25, 26]}。大多数研究表明CYP2D6基因型对奈必洛尔的临床反应和代谢是呈多态性的^[27]。然而，我们的研究表明CYP2C19和CYP3A4在一定程度上也可以影响奈必洛尔4-羟基化代谢的途径^[27]。与奈必洛尔代谢相似，如氟西汀^[28]、美沙酮^{[29, 30]}和西酞普兰也经过多种CYP450酶代谢^{[31, 32]}。CYP2C19具有多态性，且参与许多药物的代谢，其表型变异性会影响治疗效果^[16]。研究评估31种CYP2C19变异体对奈必洛尔代谢的影响[^33]。CYP2C19在用等位基因变体转染的Sf21细胞中未检测到蛋白质CYP2C19*3（W212X）和35FS，这一发现与之前的研究结果相似^{[30, 34]}。此外，Sf21细胞中表达的两种变体的蛋白质水平CYP2C19*29（K28I）、CYP2C19*23（G91R）远低于野生型蛋白。在中国汉族人群中鉴定的31个CYP2C19等位基因中，野生型CYP2C19*1B等位基因在中国汉族人群中最为普遍（占CYP2C19*1等位基因的90.04%）^[16]。此外，基因型CYP2C19*1B/1B是中国汉族人口中最常见的野生基因型（占CYP2C19*1/1基因型的81.54%）^[16]。因此，CYP2C19*1B的酶活性在本研究中被当作一个对照。同时，因为CYP2C19*1A 是人群中较常见的等位基因，构建CYP2C19*1A表达载体并描述了其对奈必洛尔的酶活性。野生型CYP2C19*1B对奈必洛尔4-羟基化代谢中的Km、Vmax和Clint值分别为13.2μM，1.6pmol/min/pmol和0.12μL/min/pmol。大多数重组CYP2C19蛋白对奈必洛尔羟基化的Clint值表现出明显降低（p＜0.05），特别是CYP2C19*6（R132Q）、R261W、R124Q、CYP2C19*2H（H396D）和CYP2C19*2G变体（D360V）的Clint相比野生型降低＞90%。然而，CYP2C19*29（K28I）、L16F、CYP2C19*1A和CYP2C19*23（G91R）蛋白表现出比野生型更高的Vmax值，导致其Clint值增加（279.63%，242.71%、192.55%和146.44%）。具体酶动力学参数见表2，相对清除率比较见图2。

表2 不同CYP2C19 基因型重组酶微粒体体外代谢奈必洛尔的酶动力学参数

Variants	Vmax (pmol/min/pmol P450)	Km (μM )	Clearance Vmax/Km	Relative clearance a (% of wild type)	Relative clearance b (% of wild type)
2C19*1B	1.6±0.1	13.2±1.7	0.12±0.01	100.00	51.93
2C19*1A	4.8±0.1*	20.7±0.6	0.23±0.00*	192.55	100.00
2C19*2E	1.6±0.2	31.3±5.6	0.05±0.00*	41.23	21.41
2C19*2F	0.9±0.0	24.7±2.2	0.03±0.00*	28.57	14.84
2C19*2G	0.5±0.1*	76.1±12.0	0.01±0.00*	5.90	3.06
2C19*2H	0.8±0.1	172.8±34.0	0.005±0.00*	3.91	2.03
2C19*2J	1.2±0.0	36.7±1.0*	0.03±0.00*	26.45	13.74
2C19*3	ND	ND	ND	ND	ND
2C19*3C	2.9±0.2*	55.8±5.4*	0.05±0.00*	42.97	22.32
2C19*29	6.5±0.0*	19.3±0.2	0.34±0.00*	279.63	145.20
2C19*30	0.9±0.0	26.0±2.2*	0.03±0.00*	27.77	14.42
2C19*31	0.9±0.0	18.3±0.6	0.05±0.00*	42.33	21.99
2C19*32	1.7±0.0	16.7±1.8	0.10±0.01	82.12	42.65
2C19*33	1.5±0.0*	22.8±1.7	0.07±0.00*	55.69	28.92
L16F	5.5±0.0	18.7±0.2	0.29±0.00*	242.71	126.05
35FS	ND	ND	ND	ND	ND
R124Q	0.3±0.0*	67.8±4.2*	0.004±0.00*	3.25	1.69
R125G	0.8±0.1*	23.6±3.3	0.03±0.00*	27.60	14.33
T130M	3.3±0.1*	34.9±3.5*	0.10±0.01	78.53	40.78
N231T	1.9±0.1	18.6±1.4	0.10±0.00	82.17	42.67
M255T	0.9±0.0	34.7±0.6*	0.03±0.00*	22.45	11.66
R261W	0.3±0.1*	91.9±37.1	0.003±0.00*	2.43	1.26
N277K	2.1±0.0	27.2±1.3*	0.08±0.00	65.00	33.76
S303N	3.3±0.3	28.1±4.4	0.12±0.01	96.60	50.17
I327T	0.7±0.0	26.1±1.4*	0.03±0.00*	21.78	11.31
N403I	1.3±0.0	19.7±2.4	0.07±0.01*	55.62	28.89
A430V	1.5±0.2	21.1±4.5	0.07±0.01*	59.01	30.64
2C19*23	6.3±0.8	37.1±11.5	0.18±0.03	146.44	76.05
2C19*6	0.3±0.1*	114.2±48.5	0.002±0.00*	1.81	0.94
2C19*2C	0.6±0.0	31.7±3.6	0.02±0.00*	15.60	8.10
2C19*18	1.4±0.1	17.2±0.2	0.08±0.00	65.84	34.19

注：所有数据均以三组数据的Mean±SD表示；ND表示未检测到代谢产物。^a表示数据以野生型CYP2C19*1B的百分比表示。^b表示数据以野生型CYP2C19*1A的百分比表示。*p<0.05表示相比于CYP2C19*1B有显著性差异

三、抗真菌药

伏立康唑作为一线可获得的第二代抗真菌三唑类药物，在临床上对一些重要的病原体有广谱抗真菌活性，包括侵袭性和肺曲霉菌病、氟康唑耐药的念珠菌引起的严重侵袭性感染（包括克柔念珠菌），以及由新兴病原体引起的感染，如Scedosporium和Fusiumspp^[35]。伏立康唑的缺点是不可预测的、非线性的药动学和广泛的的个体差异性。伏立康唑的副作用与它较高的血药浓度有关，因此在服用伏立康唑时，治疗药物监测是必不可少的^{[36, 37]}。体外研究表明，CYP2C19和

CYP3A4都参与了伏立康唑的代谢^[38]。事实上，伏立康唑在体内的药代动力学很大程度上受CYP2C19基因型的影响^[39]。也有多项研究表明伏立康唑血药浓度与基因型的关系，其不仅与等位基因CYP2C19*2有关^{[40, 41]}，也与CYP2C19*3有关^[42]。专门研究野生型CYP2C19*1和30个

突变体对伏立康唑代谢的影响^[43]。四个变异体（CYP2C19*2H、*3、35FS和R124Q），

伏立康唑的代谢物浓度低于检测限，无法测定其动力学参数。与野生型CYP2C19*1

（100%）相比，其中25个等位基因变异体对伏立康唑的代谢能力显著降低。具体而言，22个变体（CYP2C19*2E、*2F、*2G、*2J、*3C、*30、*31、*32、*33、R125G、N231T、M255T、R261W、S303N、I327T、N403I、A430V、I331V、*23、*6、*2C和*18）的内在清除率（Vmax/km）显著降低，从1.11%到49.29%。其余三个变异体（CYP2C19*29、T130M和N277K）的内在清除率表现出轻度减少（60.90%-83.78%）。R261W变异体的Vmax值显著降低，Km值显著增大（约为CYP2C19*1的2倍），导致其Vmax/Km值降低到1.11%。同样的结果也在CYP2C19*2G和*2C中发现，Vmax/Km值分别降为5.61%、6.37%。相反的是，L16F的Vmax值显著增加，但Km值与CYP2C19*1相近，其Vmax/Km值增加到135.68%。具体酶动力学参数见表3，相对清除率比较见图3。

表3 CYP2C19*1和其他30个CYP2C19变异体对伏立康唑N-氧化代谢的酶动力学参数

Variants	V_max (pmol/min/pmol P450)	K_m (μM )	Clearance V_max/K_m	Relative clearance(% of wild type)
CYP2C19*1	4.85±0.08	4.31±0.38	1.13±0.12	100
CYP2C19*2E	1.26±0.01*	5.24±0.41	0.24±0.02*	21.38
CYP2C19*2F	0.99±0.06*	5.89±1.48*	0.17±0.03*	15.25
CYP2C19*2G	0.43±0.01*	6.84±0.15*	0.06±0.00*	5.61
CYP2C19*2H	ND	ND	ND	ND
CYP2C19*2J	1.59±0.02*	6.80±0.38*	0.23±0.02*	20.78
CYP2C19*3	ND	ND	ND	ND
CYP2C19*3C	1.84±0.03*	6.62±0.54*	0.28±0.02*	24.63
CYP2C19*29	5.37±0.10*	5.68±0.10*	0.95±0.03*	83.78
CYP2C19*30	0.73±0.00*	5.32±0.38	0.14±0.01*	12.17
CYP2C19*31	0.93±0.01*	4.51±0.19	0.21±0.01*	18.36
CYP2C19*32	1.26±0.02*	4.22±0.38	0.30±0.02*	26.57
CYP2C19*33	1.36±0.03*	5.70±0.74*	0.24±0.03*	21.25
L16F	7.15±0.10*	4.67±0.18	1.53±0.04*	135.68
35FS	ND	ND	ND	ND
R124Q	ND	ND	ND	ND
R125G	0.62±0.01*	4.18±0.63	0.15±0.03*	13.36
T130M	2.76±0.03*	3.73±0.07	0.74±0.01*	65.65
N231T	2.78±0.05*	6.62±0.25*	0.42±0.02*	37.19
M255T	0.92±0.02*	5.48±0.03	0.17±0.00*	14.92
R261W	0.11±0.00*	8.50±1.22*	0.01±0.00*	1.11
N277K	3.26±0.06*	4.74±0.15	0.69±0.02*	60.90
S303N	2.56±0.03*	7.38±0.54*	0.35±0.02*	30.80
I327T	0.83±0.04*	5.56±0.88	0.15±0.02*	13.43
N403I	1.91±0.04*	7.58±0.54*	0.25±0.01*	22.34
A430V	2.54±0.08*	4.57±0.60	0.56±0.06*	49.29
CYP2C19*1B	1.98±0.01*	5.19±0.28	0.38±0.02*	33.84
CYP2C19*23	3.08±0.07*	8.70±0.39*	0.35±0.01*	31.40
CYP2C19*6	0.22±0.00*	2.90±0.40*	0.08±0.01*	6.89
CYP2C19*2C	0.41±0.01*	5.76±0.23*	0.07±0.00*	6.37
CYP2C19*18	1.54±0.02*	5.54±0.21	0.28±0.01*	24.59

注：所有数据均以三组数据的Mean±SD表示；*p<0.05表示相比于CYP2C19野生型有显著性差异；ND表示未检测到代谢产物

四、镇痛药

美沙酮（MTD），是一种合成的µ-阿片类受体激动剂，用于治疗严重的疼痛，特别是亚急性和慢性疼痛，以及阿片样物质依赖患者的维持治疗，在许多国家被用作阿片成瘾者的替代疗法。美沙酮是治疗阿片类物质依赖的有效手段，可以减少毒品滥用，降低艾滋病感染风险，降低死亡率，甚至减少失业率，维护社会稳定^[44]。现在美沙酮用于阿片类成瘾性治疗已经很普遍，而它作为止痛剂的作用越来越少被提及，但在治疗癌症痛、神经痛等其他慢性疼痛方面仍旧很受关注。美沙酮几乎完全由肝脏代谢，该药的N-去甲基化代谢产物为EDDP^[45]。美沙酮是发挥作用的活性主体，EDDP为它的无活性代谢产物^[46]。代谢途径中起主要作用的是CYP450酶，主要包括CYP3A4，CYP2D6和CYP2C19^{[47, 48]}。通过评价31种CYP2C19等位基因对美沙酮体外代谢活性的影响，为临床个体化给药提供相关的参考^[30]。

Vmax，但Km比野生型低，所以清除率比野生型高，达到121.58%，这可能是因为L16F的cDNA发生点突变（46C＞T），酶活性得到了一定的加强。而N277K的Vmax和Km都低于野生型，且降低的幅度差不多，所以清除率与野生型相似，为105.41%，无统计学意义。除此以外的26个变异型（CYP2C19*2E，*2F，*2G，*2H，*2 J，*3C，*29，*30，*31，*32，*33，R124Q，M255T，R261W，R132Q，A161P，I327T，T130M，A430V，I331V，N231T，S303N，G91R，R125G，R329H和N403I）的清除率与野生型相比都有不同程度的降低，清除率范围在1.48%至80.40%之间。我们实验室此前的研究显示，在新发现的CYP2C19变异型中，

2C19*2F，*2G，*2H，*29，*30，*33，M255T，R261W和I327T这几个变异型的基因发生了点突变，使得这几个基因的蛋白表达量下降，表现出酶活性有一定程度的降低。而我们的实验结果正好与之相符，于是我们推测这些重组酶的cDNA发生点突变导致酶的构型和稳定性发生变化，从而对酶的催化反应能力产生影响。在26个变异型中，CYP2C19*2H，*29，R124Q，R261W，R132Q和A161P Vmax值表现出明显的降低而Km值升高，最后清除率只为野生型的10%不到。特别是CYP2C19*2H和R124Q的清除率降至野生型的5%以下，其中*2H的Vmax只为野生型的11.17%，Km却为野生型的5.4倍，最终清除率仅为野生型的2.11%。R124Q的

Vmax只为野生型的4.96%，Km却为野生型的3.5倍，最终清除率降低至1.48%。携带CYP2C19*2H，*29，R124Q，R261W，R132Q和A161P这几种基因型的患者在接受MTD治疗时一定要格外注意给药剂量和方案的调整。具体酶动力学参数见表4，相对清除率比较见图4。

31个CYP2C19基因型中，以CYP2C19*1野生型作为对照，CYP2C19*3和35FS两个变异型无活性，其余28个变异型的Vmax和Km都有所改变，从而引起清除率的改变。CYP2C19*3在636位碱基处C突变成A，导致提前终止并产生剪短蛋白，因此无法检测到完整蛋白的表达，同时该基因表现出缺陷的酶活性。35FS由于101和102位碱基中间插入CCTAC片段，从而导致蛋白翻译的框架位移，同样无法检测到完整蛋白的表达并表现出缺陷的酶活性。L16F与野生型有相似的Vmax，但Km比野生型低，所以清除率比野生型高，达到121.58%，这可能是因为L16F的cDNA发生点突变（46C＞T），酶活性得到了一定的加强。而N277K的Vmax和Km都低于野生型，且降低的幅度差不多，所以清除率与野生型相似，为105.41%，无统计学意义。除此以外的26个变异型（CYP2C19*2E，*2F，*2G，*2H，*2 J，*3C，*29，*30，*31，*32，*33，R124Q，M255T，R261W，R132Q，A161P，I327T，T130M，A430V，I331V，N231T，S303N，G91R，R125G，R329H和N403I）的清除率与野生型相比都有不同程度的降低，清除率范围在1.48%至80.40%之间。我们实验室此前的研究显示，在新发现的CYP2C19变异型中，2C19*2F，*2G，*2H，*29，*30，*33，M255T，R261W和I327T这几个变异型的基因发生了点突变，使得这几个基因的蛋白表达量下降，表现出酶活性有一定程度的降低。而我们的实验结果正好与之相符，于是我们推测这些重组酶的cDNA发生点突变导致酶的构型和稳定性发生变化，从而对酶的催化反应能力产生影响。在26个变异型中，CYP2C19*2H，*29，R124Q，R261W，R132Q和A161P Vmax值表现出明显的降低而Km值升高，最后清除率只为野生型的10%不到。特别是CYP2C19*2H和R124Q的清除率降至野生型的5%以下，其中*2H的Vmax只为野生型的11.17%，Km却为野生型的5.4倍，最终清除率仅为野生型的2.11%。R124Q的Vmax只为野生型的4.96%，Km却为野生型的3.5倍，最终清除率降低至1.48%。携带CYP2C19*2H，*29，R124Q，R261W，R132Q和A161P这几种基因型的患者在接受MTD治疗时一定要格外注意给药剂量和方案的调整。具体酶动力学参数见表4，相对清除率比较见图4。

表4 31种不同CYP2C19微粒体基因型体外代谢美沙酮的酶动力学参数

Variants	V_max (nmol/min/nmol of CYP2C19)	K_m (μM )	Clearance V_max/K_m	Relative clearance(% of wild type)
CYP2C19*1	3669±42.6	199±8	18.418±0.548	100
CYP2C19*2E	2310±120.2*	620±46.4*	3.726±0.092*	20.23*
CYP2C19*2F	776±25.2*	417±21.8*	1.860±0.037*	10.10*
CYP2C19*2G	749±10.2*	346±16	2.167±0.088*	21.20*
CYP2C19*2H	410±49.6*	1076±248.7*	0.389±0.052*	2.11*
CYP2C19*2J	1412±39.9*	320±20.1	4.421±0.415*	24.00*
CYP2C19*3	ND	ND	ND	ND
CYP2C19*3C	2410±37.6*	202±4.9	11.930±0.102*	64.77*
CYP2C19*29	535±15.8*	299±27.3	1.796±0.110*	9.75*
CYP2C19*30	961±50.3*	327±37.8	2.953±0.199*	16.03*
CYP2C19*31	1161±28.8*	266±21.4	4.376±0.243*	23.76*
CYP2C19*32	1113±14.4*	161±20.9	6.991±0.885*	37.96*
CYP2C19*33	1122±8.4*	264±9.7	4.249±0.135*	23.07*
35FS	ND	ND	ND	ND
L16F	3599±22.8	160±7.4	22.393±0.894*	121.58*
R124Q	182±35.2*	697±244.3*	0.272±0.043*	1.48*
G91R	2624±39.6*	283±13.7	9.269±0.309*	50.33*
M255T	925±24.5*	214±16.4	4.330±0.227*	23.51*
R261W	453±24.4*	600±115.4*	0.768±0.097*	4.17*
R125G	1181±3.1*	180±6.4	6.545±0.249*	35.53*
R132Q	382±1.2*	448±17.9*	0.854±0.032*	4.64*
A161P	578±8.1*	315±7.4	1.833±0.024*	9.95*
T130M	3205±75.4*	216±13.2	14.808±0.645*	80.40*
R329H	1538±58*	235±21.8	6.557±0.357*	35.60*
A430V	1927±38.7*	157±4.4	12.221±0.097*	66.35*
N403I	1304±12.5*	162±8.3	8.023±0.397*	43.56*
I331V	1447±28.6*	142±14.9	10.221±0.848*	55.49*
N277K	2049±5.5*	105±1.5	19.415±0.236*	105.41
N231T	2070±13*	165±3.7	12.555±0.356*	68.17*
I327T	985±24.3*	257±26.7	3.858±0.344*	20.95*
S303N	2307±73*	391±19.5*	5.902±0.136*	32.05*

注：数据结果均用mean± SD 来表示，ND表示未检测到代谢产物；*p＜0.05 表示变异型与野生型相比较在统计学上有显著性差异

五、总结

从以上各个药物的结果中可以看出，31个CYP2C19基因型中，以野生型作为对照，不同的变异体代谢相同的药物其清除率存在显著性差异；相同的变异体代谢不同的药物同样存在差异性（相对清除率比较见图5）。大多数CYP2C19变异型重组酶的基因突变会导致相应蛋白酶表达量和/或酶活性的下降，因此需要将CYP2C19变异体的酶代谢动力学特征纳入到药品说明书，临床用药时可以根据患者的药物代谢酶遗传基因的分析结果，预测药物的疗效和调整给药剂量，设计相应的个体化给药方案，以充分发挥药物的疗效以及减少不良反应，减少患者的医疗成本，避免药物给患者造成不必要的伤害。药物代谢酶基因多态性的研究使得临床个体化治疗变得更加的科学合理，最终实现临床用药的安全，有效和经济。

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