无创产前检测技术的临床应用的规范化与遗传咨询的相关问题
【摘要】基于胎儿游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的无创产前检查（noninvasive prenatal testing，NIPT）作为一项产前筛查技术已经成功整合到了孕期保健服务之中。NIPT在13-三体、18三体和21三体的无创产前筛查方面表现出了高灵敏度和特异性，已经在临床上表现出了出色的临床应用效果。随着NIPT临床应用的推广，国际上相关专业组织已经发布了NIPT应用的指南和规范，并不断进行更新，我国也在2016年发布了《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》。各国在NIPT临床应用的范围、适应人群以及特殊人群检测方面有共同点但也有一些差异，本文依据目前国际组织NIPT相关指南和相关研究数据，并结合我国的国情，对于NIPT临床应用的目标疾病、适宜时间、适用人群以及特殊情况NIPT的应用进行了综述，并强调了遗传咨询在NIPT临床应用方面的重要性，为NIPT临床规范应用提供一定的依据。
【关键词】无创产前检查；染色体非整倍筛查；产前筛查；产前诊断
1997年香港中文大学的Lo等[1]首次报道可以在孕妇血浆中检测到胎儿的cfDNA。二代测序技术的发展，通过大规模平行测序技术可以对孕妇血浆中胎儿游离DNA的分析，从而实现了胎儿13-三体、18三体和21三体的无创产前筛查。2011年之后NIPT被应用于临床产前筛查，由于其相对于传统的血清学筛查方法，NIPT具有高灵敏度和特异性，2013年以来已经快速的被应用于临床染色体非整倍体筛查体系[2, 3]。目前NIPT已经在全球范围内大规模的开展，2018年接受NIPT的孕妇妊娠达到1000万人次以上，许多国家已经把NIPT作为临床服务流程的一部分。
随着临床应用数据的积累，国际上相关的主要学术机构也相继发布了NIPT临床应用的相关指南，并根据临床应用的研究进展进行更新[4-7]。各国指南主要在NIPT的目标疾病、临床应用范围以及特殊情况下的临床应用等方面给出了建议。国内在NIPT临床应用方面与国际同步开展，并将NIPT定位于“目标疾病明确，检测效果接近于诊断的产前筛查技术”[8]。为了更加规范将NIPT技术应用于临床，发挥其优势，国家卫生计生委于2016年组织全国产前诊断专家结合国际的临床研究成果制定了《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》（以下简称技术规范）。技术规范充分考虑我国产前筛查和诊断工作的国情，对于开展NIPT的基本要求、适用范围、临床服务流程、检测技术流程以及质量控制指标等内容进行详细的说明，为我国规范开展NIPT技术提供了指导意见。
NIPT临床应用已经过去了8年余，大量的临床应用数据显示NIPT在常见染色体非整倍体筛查方面具有明显的优势，被更多的临床医生和孕妇所接受。但是也面临一部分的问题，包括NIPT临床应用的目标疾病、适应人群以及特殊人群中NIPT应用现状等。本文结合NIPT相关指南及临床应用文献数据，对于国内外NITP临床应用的现状进行综述分析。
一、NIPT临床应用的目标疾病
1. 推荐的NIPT目标疾病是13、18和21三体综合征。国内外多项meta分析结果显示，NIPT对于21三体的检出率为99.5%，假阳性率为0.04%；18三体的检出率为97.7%，假阳性率为0.04%；13三体检出率为96.1%，假阳性率为0.06%[9-11]。2016年7月，美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG），更新了关于胎儿染色体非整倍体无创产前筛查的共识,明确指出：应告知所有孕妇，针对13、18和21三体综合征的产前筛查技术中，NIPS是目前最敏感的检测手段[4]。我国《技术规范》也明确NIPT的目标疾病是13、18、21三体综合征。
2. 性染色体非整倍（Sex Chromosome Aneuploidies，SCAs）不推荐作为NIPT的常规筛查，在充分遗传咨询的基础上可以作为额外的发现进行报告。美国妇产科学会（American College of obstetricians and Gynecologists，ACOG）在2015年发表的临床建议中指出：在有需要的情况下性染色体异常也可以作为NIPT的筛查目标[12]。2016年ACMG指南建议：作为NIPS检测前咨询内容，应告知所有孕妇NIPS应用扩展到性染色体非整倍体筛查的可行性[4]。一项纳入多个研究荟萃分析结果显示NIPT对于X染色体单体检出率达到90.3%，假阴性率为0.23%，对于性染色体三体（47,XXX；47,XXY；47,XYY）的复合检出率为96.2%，假阳性率为0.3%[13]。近期国内几项研究显示，NIPT对于SCAs复合阳性预测值（Positive Predictive Value，PPV）是32.42%～57.6%，其中45,X、47,XXX、47,XXY、47,XYY的PPV分别是18.39～21.4%、44.4%～75.0%、39.29%～90.9%和75.0%[14, 15]。虽然临床研究结果显示NIPT可以用于胎儿SCAs的筛查，但是其检测的准确性有待进一步提高，尤其对于45,X的PPV仍然处于较低的水平，因此需要在检测前进行充分遗传咨询，告知检测的准确性、后续的诊断方法以及临床表型的差异性[16]。现有的研究均存在临床随访方法和数据不完整的局限性，对于NIPT进行胎儿SCAs筛查的检出率、灵敏度和特异性等重要指标尚存在不确定性，因此在充分遗传咨询的前提下，可以将SCAs作为NIPT筛查的一部分。
3. 基于全基因组测序的NIPT技术可以发现除13、18、21三体之外的罕见常染色体非整倍体（Rare autosomal trisomies，RATs），一些实验室会将RATs作为意外发现报告[17，18]。大部分的RATs与早孕期的流产相关，但是中孕期的RATs主要由于胎盘嵌合体或者单亲二倍体造成。研究显示NIPT对于RATs的PPV仅为6%，假阳性结果主要是由于限制性胎盘嵌合（CMP）造成的[19]。虽然RATs与不良妊娠结局相关，但是对于嵌合性三体的临床表现尚缺乏足够的临床数据，妊娠结局预测存在难度，因此ACMG不建议将NIPT用于13、18、21号染色体之外的常染色非整倍的检测，以免给临床遗传咨询造成负担，同时增加孕妇的焦虑和不恰当的引产[4]。
4. 致病性明确的染色体微缺失/微重复综合征在充分告知的前提下可以作为NIPT结果的一部分进行报告，对于意义未明的染色体微缺失/微重复综合征不建议作为NIPT的目标疾病进行报告。研究证实胎儿染色体拷贝数变异（copy number variations，CNVs）作为NIPT扩展性筛查的一部分是可行的[20，21]，目前已经随着NIPT的大力推广进入了临床的应用。2015年ACOG指南认为由于CNVs的筛查的灵敏度和特异性仍然不明确，所以“微缺失综合征的常规筛查不应该被推荐”。2016年ACMG指南建议：应告知所有孕妇关于NIPS在筛查临床相关性CNVs的效率，但是需要在检测前和检测后给予充分的咨询，并需要告知检测CNVs的检出率、特异性、PPV、NPV等重要的指标。梁德生教授等[17]对国内94,085例孕妇扩展性NIPT（NIPT-Plus）结果显示NIPT-Plus对于已知致病性的微缺失/微重复综合征（microdeletion/microduplication syndromes，MMS）的阳性预测值（PPV）分别可以达到93%（DiGeorge综合征），68%（22q11.22 microduplication综合征），75%（Prader-Willi/Angleman综合征）和50%（猫叫综合征）；在全基因组范围内的MMS的复合阳性预测值为32%（CNVs≥10Mb）和19%（CNVs＜10Mb）。近期的几项临床研究也进一步证实了，NIPT在胎儿CNV检测方面的有效性[22, 23]。但是由于CNVs中部分良性或者临床意义不明的CNVs并不致病，而致病性CNVs也可以出现在没有任何超声异常的胎儿中，而临床遗传咨询的不足将会给胎儿CNVs的NIPT带来更多的伦理学问题[24]。ACMG指南建议：应告知所有孕妇关于NIPS在筛查临床相关性CNVs的效率，但是需要在检测前和检测后给予充分的咨询，并需要告知检测CNVs的检出率、特异性、PPV、NPV等重要的指标。
5. 单基因遗传病不作为常规NIPT的目标疾病。自从研究报道孕妇血浆中胎儿游离DNA可以作为单基因遗传病的诊断以来，NIPT就被应用于单基因遗传病的诊断[25]。单基因遗传病的NIPT是通过靶向扩增结合高通量测序技术，针对目标基因序列或者位点进行检测，再结合相对剂量分析（Relative haplotype dosage，RHDO）的方法，可以对于常染色体显性、常染色体隐性和X连锁遗传病等进行产前诊断，所以也称为无创产前诊断（noninversion prenatal diagnosis，NIPD）[26]。前期的研究报道采用不同的NIPD方法对于β地中海贫血[27]、肝豆状核变性[28]和苯丙酮尿症[29]等单基因遗传病成功进行了产前诊断。近期一项临床研究采用新的靶向捕获测序方法，成功对422例孕妇进行30个常染色体显性遗传病基因无创产前诊断，随访研究证实20例真阳性，127例真阴性，未发现假阳性和假阴性[30]。临床应用结果显示基于靶向捕获测序和RHDO分析的单基因遗传病无创产前筛查（NIPD）具有高的灵敏度和特异性[31, 32]。但是目前单基因NIPD的方案是基于目标疾病的靶向测序分析，常规的基于全基因组低深度测序分析的非整倍NIPT方案并不适合单基因遗传病。
二、适宜时间
胎儿游离DNA在孕8周后可以在孕妇血浆中检测到，孕10-21周达到稳定水平，平均浓度为11-13.4%，可以满足NIPT对于胎儿游离DNA浓度的要求[33, 34]。随着孕周增加cffDNA浓度增加，孕21周后cffDNA浓度增加更加明显，约每周增加1%。ACMG和ACOG均建议在孕10周后可以进行NIPT，没有设定孕周的上限，但是建议各个医疗机构可以根据自身的情况，结合随后产前诊断的方式和孕周，综合制定适合的NIPT孕周。结合当前国内孕期保健服务的流程，我国2016发布的《技术规范》确定NIPT的适宜孕周为“12+0周～22+6周”，孕周过大将错过后续产前诊断的最佳时机。
三、NIPT的适用人群
NIPT技术临床应用之初，大部分研究数据是针对高风险人群检测，普通人群NIPT临床数据较少，所以2015年ACOG指南和SMFM指南均提出鉴于传统血清学筛查的表现和NIPT的局限性，及低风险人群筛查数据的缺乏，传统血清学筛查仍然是低风险人群的一线筛查方案[7, 12]。随后的两项大规模的临床应用数据显示，对于低风险人群NIPT对于唐氏综合征筛查的阳性预测值（PPV）是50-81%，高风险人群中是94%[3, 35]。与传统血清学筛查的PPV（3.4%）相比NIPT具有更高阳性预测值（80.9%），唐氏综合征的阴性预测接近100%，而且NIPT很大程度降低了有创性产前诊断的使用率[3, 36]。有研究报道基于早孕期联合筛查结果，将孕妇风险分为低风险、中间风险（1/150-1/1000）、高风险，并为中间风险孕妇提供NIPT检测，这种酌情筛查的方案可以提高整体的医疗质量并满足一定范围的成本效益预期[37]。
不同的国家在NIPT临床应用方案方面有所不同。近期一项针对欧洲、澳大利亚和美国的调查研究报道，在欧洲有14个国家将NIPT纳入了本国卫生政策/计划，比利时和荷兰为所有的孕妇提供NIPT服务，但是大部分其他欧洲国家将NIPT作为孕早期传统筛查高风险孕妇的二级筛查方案。在澳大利亚，早孕期联合筛查（combined first trimester screening，cFTS）或者NIPT都是可以作为首次产前筛查的方案；在美国对于NIPT的临床应用没有统一的医疗卫生政策，但是NIPT却得到了广泛的应用[38]。
加拿大的研究者评估了NIPT在普通风险预付中的成本效益，相对于传统产前筛查方案，NIPT作为二线筛查可以检出更多的13、18、21三体，而且显著减少了侵入性产前诊断的数量，产前筛查的年总费用有明显的下降。与二线NIPT方案相比，NIPT作为一线方案可以检测到更多的染色体异常病例，但成本要高得多[39]。复旦大学Xu等[40]评估了传统血清学筛查策略、酌情筛查策略（传统血清学筛查高风险孕妇进行NIPT）和普遍筛查策略的成本/效益比，虽然NIPT具有更大的有效性和安全性的优点，但由于NIPT成本较高，目前传统血清学筛查不太可能被NIPT替代，酌情筛查可能是平衡新基因检测技术的有效性和成本因素的适当策略，如果NIPT的成本降低到76.92美元，普遍筛查策略的成本-效益比将低于传统血清学筛查策略。
2016年我国发布的《技术规范》明确NIPT的适应人群为：“血清学筛查显示胎儿常见染色体非整倍体风险值介于高风险切割值与1/1000之间的孕妇”，“早、中孕期产前筛查高风险”孕妇被列入“慎用人群”[41]。
四、特殊情况下的NIPT建议
1. 高龄孕妇：孕妇年龄与胎儿染色体非整倍发生率显著相关，预产期年龄≥35岁作为胎儿染色体非整倍体异常的高风险因素[42]。相对于低龄孕妇，在高龄孕妇中NIPT的PPV有明显的增加[43, 44]，而且NIPT较少有创性产前诊断给孕妇带来的风险。临床大规模的临床回顾研究和前瞻性结果显示，NIPT在高龄孕妇和低龄孕妇中具有相似的灵敏度和特异性[44, 45]。ACMG指南明确指出，应告知所有孕妇，包括高龄孕妇，NIPT是目前筛查21、13、18三体综合征最敏感的方案。2016年《技术规范》将高龄孕妇列为NIPT检测的“慎用人群”，但是我国颁布的《母婴保健法实施办法》和《产前诊断技术管理办法》均明确规定，对于高龄孕妇应进行产前诊断。在这种情况下，临床医生需要在检测前充分告知高龄孕妇NIPT与产前诊断的区别和优缺点，知情选择。
2. 肥胖孕妇：孕妇体重的增加与孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度（fetal fraction，FF）下降相关，FF过低会导致NIPT假阴性的结果，所以大部分的NIPT服务机构把FF≥3%-4%作为NIPT结果报告的切割值，如果FF低于切割值会报告检测失败（no-call）[33, 46-48]。研究结果显示，体重指数（BMI）在正常范围内的（18.5-24.9kg/m2）的孕妇no-call率为0-4.2%，而体重指数达到Ⅲ级肥胖时no-call率也高达5.4%-70.1%[49]。各国相关机构的指南中也提到了孕妇体重对于NIPT影响，丹麦胎儿医学会将体重90公斤作为NIPT的上限[50]，加拿大妇产科学会指南提示孕妇体重超过110公斤，NIPT的no-call率会超过10%以上[51]。ACOG指南和SMFM指南均提示对于病态肥胖的孕妇提供其他的筛查方案，但是这两个指南均未对肥胖做出明确的定义，也没有推荐可选择的其他筛查方案，但是均明确病态肥胖的孕妇中有FF降低而导致no-call率显著升高。2016年我国发布的《技术规范》将重度肥胖孕妇（体重指数＞40）纳入了NIPT慎用人群：“这种情况的孕妇进行检测时，检测准确性有一定程度下降，检出效果尚不明确”。
3. 超声筛查异常：早孕期NT增厚（≥3mm或者相应头臀长第99百分位数）增加胎儿患遗传综合征风险和结构畸形的风险，包括染色体非整倍体、先天性心脏病、染色体微缺失综合征、单基因遗传病及流产和死胎等[52]。因此对于NT增厚的孕妇建议进行产前遗传学诊断，并建议在18-22周进行胎儿系统超声检查，排除重要的结构畸形。
近期的一项研究回顾性分析226例NT增厚的胎儿，结果显示NIPT检查漏检11-19%的遗传学异常（CNV和单基因异常）的胎儿，占全部NT增厚胎儿的4.4-7.1%，因此对于NT增厚的胎儿NIPT并不是一种适合的检测方法[53]。在另外一项研究中纳入了110例NT增厚的孕妇，结果显示在60例遗传学异常的胎儿中，NIPT只检出了44例（73.3%），16例没有被检出（26.7%），而且在高龄和NT≥3.5的胎儿中NIPT检出效率更低[54]。
关于中孕期的超声软指标发现，2016年[5]和2020年[6]ACOG/SMFM在关于胎儿非整倍体筛查的指南中均给予了建议。发现中孕期非整倍的超声软指标是，应当有目的进行超声检查，排除胎儿其他异常并回顾或提供胎儿染色体异常的筛查和诊断。孕中期孤立性的超声软指标（如心室内强回声光点、脉络丛囊肿，肾盂增宽，股骨或者肱骨长度偏短）发现，如果孕妇没有进行非整倍筛查，应该建议孕妇进行遗传咨询并提供NIPT或者四联血清学非整体筛查，以及羊水穿刺。如果非整倍体筛查结果低风险，则不需要进一步的风险评估。但是对于侧脑室增宽（10-15mm）的发现，建议进一步详细的超声检查和遗传咨询，并提供产前遗传学诊断，CMV和胎儿核磁检查[55]。肠管回声增强与21三体、羊膜腔内出血、囊性纤维化、巨细胞病毒（CMV）以及宫内发育迟缓等相关，建议进行详细的胎儿异常检查，并提供CMV，CF和染色体非整倍的检查[56, 57]。
4. 双胎妊娠：相对于单胎妊娠而言，双胎或者多胎妊娠的NIPT准确性尚缺乏充分的证据，2016年ACOG/SMFM在关于胎儿非整倍体筛查的指南提出，NIPT不推荐用于多胎妊娠的非整倍体筛查。我国《技术规范》将双胎或者多胎妊娠作为NIPT的慎用人群。近几年也有几项研究显示NIPT进行染色体非整倍筛查的灵敏度和特异性与单胎相似[58-60]，2019年一项meta分析结果显示：双胎的NIPT检测中21三体的合并加权检出率（DR）和假阳性率（FPR）分别为98.2%（95%CI 83.2-99.8%）和0.05%（95%CI 0.01-0.26%）；18三体并合并加权DR和FPR分别为88.9%（95%CI 64.8-97.2%）和0.03%（95%CI 0.00-0.33%）；13三体的FPR为0.19%。双胎妊娠cfDNA检测21三体与单胎妊娠相似，优于妊娠早期联合检测或孕中期生化检测，但是三体18和13的病例数太小，无法准确评估cfDNA检测的预测性能[61]。中国医科大学附属盛京医院刘彩霞教授团队对于1160对双胎孕妇NIPT分析结果显示，NIPT在双胎孕妇13、18、21三体及X染色体异常筛查的准确性是可靠的，单胎妊娠NIPT的产前诊断标准可在双胎妊娠中发挥良好的作用，可作为双胎妊娠的常规产前筛查推广应用[58]。
五、遗传咨询的相关问题
1. NIPT的定位是产前筛查技术，高风险结果需要进行产前诊断。NIPT低风险结果仅仅说明胎儿罹患目标染色体异常的的风险较低，并代表胎儿染色体是正常的。如果NIPT检测结果异常，应进行遗传咨询，并提供产前诊断。对于传统唐氏筛查结果提示异常的孕妇，NIPT结果低风险时应告知孕妇，染色体异常的风险为2%，这些染色体异常不能被NIPT检出[6]。
2. 虽然相对于其他筛查方法，NIPT假阳性的发生概率较低，但是也是存在的。假阳性结果的因素包括胎儿/胎盘嵌合体，染色体区域重复，双胎之一消失[62]和母源性恶性肿瘤[63]等。产前诊断的方法可以明确胎儿是否存在染色体异常，而且对于胎盘和母体的分析可以发现一部分的NIPT假阳性原因[64]。但是对于胎儿或者胎盘嵌合体的咨询确实存在很大的难度，转诊到专门的遗传咨询门诊是非常有必要的[6]。
3. NIPT筛查结果阴性的孕妇应告知其目标染色体异常的风险降低，但并不意味着胎儿一定是正常的。NIPT筛查结果阴性的孕妇不应该推荐进行非整倍体的额外筛查，这会增加假阳性的概率，不推荐采用多种方法进行联合筛查，这不符合经济高效的筛查原则[65, 66]。NIPT结果低风险的孕妇在孕期发现超声异常时应推荐进行产前诊断，超声结果异常的胎儿可能存在染色体拷贝数变异（copy number variation，CNV）或者单基因异常[67]。
4. NIPT检测失败或者无报告（No-call）与实验室处理过程、孕周过早（＜9-10周）、实验方法、胎儿遗传学因素有关，尤其是高BMI、高龄、体外受精和药物暴露（低分子肝素使用）的孕妇No-call发生率更高[68, 69]。近期一项多中心的研究结果显示初次采血的孕妇中NIPT的No-call率为0.32%，其中20%是由于cfDNA浓度低（＜4%），16.4%由于母体肿瘤引起，11.8%接受了低分子肝素的治疗，其中大概一半的孕妇是由于Z值处于临界无法报告结果。在由于基因组范围内分布异常的因素导致的no-call病例，接受第二次采血后成功率相对很低，只有25.0%-33.3%。研究显示在由于cfDNA浓度低导致的no-call病例中胎儿发生染色体非整倍体的风险增高[3]。2020年ACOG/SMFM在关于胎儿非整倍体筛查的指南中再次强调：cfDNA筛查结果为no-call的孕妇应被告知检测失败与非整倍体风险增加有关，需要接受进一步的遗传咨询，并提供全面的超声评估和诊断性检查[6]。
六．结论与分析
产前筛查和产前诊断是预防出生缺陷重要的手段，是常规医疗体系中重要的一部分。NIPT技术的引入在一定程度上提高了产前筛查和诊断的效率，也改变了胎儿染色体异常的筛查的现状，但是任何技术都有其优势和局限性。国际上重要的学术组织ACOG、SMFM、ISPD和ACMG等定期更新NIPT临床相关的指南，对于NIPT的临床提出很多有价值的指导和建议。我国发布的《技术规范》更进一步的起到了规范NIPT临床应用的作用，由于各国的国情不同，在临床应用中应以国内的《技术规范》为主要的指导，并跟进国内外最新临床应用成果。
虽然NIPT技术大大提高常见染色体非整倍异常的检出效率，但是随着NIPT应用范围的不断扩大，带来很多检测前和检测后遗传咨询的问题。目前我国缺乏足够的专业遗传咨询人员，接受NIPT检测的孕妇不能获得及时充分的遗传咨询，导致严重的心理问题，甚至于不恰当的人工流产或者引产的发生。因此急需要建立一个临床遗传咨询的系统，每一个接受NIPT的孕妇应该接受遗传咨询，使其充分了解NIPT对于先天疾病的检测能力以及不足，并鼓励孕妇独立做出适合自身的决定，而非基于商业的推广[70]。
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