临床微生物检验标准化质量控制与值得注意的问题

病原学诊断是感染性疾病诊断的金标准，病原学诊断的质量保证贯穿了检验的全过程，从分析前临床标本的采集、运送，到实验室的接收；分析中从标本的预处理、检测；分析后结果报告，只有每个环节都做好标准化的质量控制，才可能为临床提供准确的病原学诊断和抗菌药物治疗提供依据，为临床感染性疾病的诊治发挥重要作用。

一、分析前质量控制

我国临床微生物检验尚存在诸多问题，其中突出问题是临床病原学检验的标本送检率低，更具诊断价值的无菌部位标本送检率更低，严重影响了对感染性疾病的病原学正确诊断，临床上经验性治疗是常态，无疑加长了住院时间、医疗费用甚至危及生命。

国家卫生健康委办公厅关于《印发2021年国家医疗质量安全改进目标的通知》（国卫办医函[2021]76号）文件发布了十个改进目标，其中目标四：“提高住院患者抗菌药物治疗前病原学送检率”，提升无菌性样本送检比例，可有效提高抗菌药物使用的科学性和规范性，对遏制细菌耐药、提升治疗效果和保障人民群众健康权益具有重要意义^[1]。在进入医改付费方式已完成了试点阶段，推进疾病诊断相关分组（Diagnosis Related Groups，DRGs）DRG支付模式下，质量改进目标的提出起到了支持作用。

此项医疗质量安全改进目标，突出了对临床抗菌药物治疗前做病原学检验的重要意义，明确提出了提升无菌样本的送检比例，随之而来的对标本从分析前的采集、运送，到分析中病原微生物鉴定和药敏试验，分析后结果报告全流程的质量控制和规范，对临床微生物实验室专业能力提出了更高的要求。与临床充分沟通也是实验室非常重要的能力，提供临床标本采集、运送的规范化培训，分析中的问题沟通，分析后的报告解读等。除了提出改进目标，文件还有明确的监督管理策略，需要医院的相关部门的同力协作。

此项目标的核心策略是：医疗机构成立由医务、药学、临床科室、检验、院感、护理等部门组成专项工作小组，根据实际情况制订本机构抗菌药物治疗性用药前病原学送检制度与监管程序，建立治疗性应用抗菌药物前病原学送检情况监测及评价机制，明确相关质控指标数据采集方法与数据内部验证程序，按季度、分科室进行本机构数据分析、反馈，并将目标改进情况纳入绩效管理，建立激励约束机制^[1]。设定质量目标，建立监测及评价机制，相信上级管理部门的举措必定会给临床微生物检验和抗感染治疗带来有利的支撑。

二、临床微生物检验流程的标准化进程

2000年初，全国临床检验中心（现国家卫生健康委临床检验中心）开始对微生物室间质评方案做了重大改进，模拟临床标本，逐年项目改进做到渐进式与国际接轨。通过室间质评活动发现的突出问题是微生物实验室操作流程缺乏统一的标准化。2009年我们邀请到国际知名的CLSI鉴定流程和药敏标准分委会的两位主席，分别是斯坦福大学医学中心Ellen Jo Baron教授和加州大学洛杉矶医学中心（UCLA）Janet Hindler教授，从人体各个系统的标本采集，标本处理，涂片镜检，培养方法，致病菌的报告，药敏试验规范和质量控制等做了全国范围的系统化培训，使实验室人员与国际知名专家直接交流互动，现场解疑答惑；同时，国内外专家在专业的理念和最新进展、标准发展等层面上进行了交流；国内同行对国际上最大的两个药敏标准委员会的运作和标准制定有了深入了解，专家介绍了欧洲EUCAST药敏标准和规则，两个标准体系取长补短的解决方案。促进我们的深入思考：全国临检中心、中华医学会检验分会临床微生物学组考虑合作编写最新、实用的专业指南。

随后几年的质评年会，我们分别邀请了我国港、澳、台地区的学术团体组团交流，分享他们与标准化检验流程、药敏方法及最新标准、质量控制以及实验室认可的经验，交流突发感染性疾病的诊断技术、分享各种疑难病例等。配合卫生部“抗菌药物临床应用专项整治活动”，我们邀请了数位澳大利亚临床微生物学及抗菌药物学专家，进行了药敏试验、抗感染病例、耐药菌的爆发流行分析及解决办案，以及耐药监测的系统性培训。每年的质评年会持续介绍CLSI药敏更新进展，包括苛养菌和少见菌药敏标准，细菌和酵母菌的简略鉴定等。近几年又和美中临床微生物学会（CAACM）密切合作，在临床微生物新技术方面给全国微生物检验同行带来了最新进展。

在近十余年来，在国家卫生健康委员会的领导下，同行专家们的共同努力下，标委会已颁布了9项微生物检验的行业标准，包括血培养、下呼吸道、尿道、消化道感染细菌培养、侵袭性真菌感染操作指南，以及标本采集和药敏行业标准、真菌药敏的参考性方法标准^[2-10]。目前，有关临床微生物检验性能验证和临床微生物基本技术两个行业标准正在制定之中。2016年标准化流程的行标即将颁布，我们组织行标撰写专家组成宣讲团队，在全国培训会之后，又与近10个省的临检中心、医学分会合作，在省质评年会/学术会上做系统的行业标和脑脊液及无菌体液培养、泌尿生殖系统标本培养及伤口/脓液及皮肤软组织标本培养操作流程培训。在历年的全国质评年会上，还对实验室生物安全、实验室能力建设^[11]、实验室认可、临床微生物及突发感染性疾病的诊断技术、分享各种疑难病例、药敏方法及最新标准、质量控制等内容进行培训。为了帮助参评实验室加强室内质控，随着室间质评质控品，我们向全国参评实验室免费发放常用质控标准菌株。

三、全国室间质评活动反映的部分问题

参加全国临床微生物室间质评活动（EQA）的实验室逐年增加，高级项目参评实验室从2000年的489个，到2021年增加至2338个，其中三级医院、二级医院占比分别为78.87%和8.89%，第三方实验室占5.13%；2016年开展了临床微生物中级项目，主要针对三级专科、新升三级医院和二级医院，今年参加实验室932个，三级医院、二级医院占比分别为53.86%和32.61%，第三方实验室占3.54%。目前参加微生物EQA项目的三级医院和二级医院分别达到2346和512个，详见图1。

图1. 2021年参加全国临床微生物EQA高级/中级项目实验室数

1. EQA活动对实验室能力的检验：新冠疫情爆发后，公立医院发展迅速，据2021年3月统计，公立医院数量分别为三级3044个，二级10483个，同比去年分别增长8.7%和6.5%。截至今年，三级医院、二级医院参加微生物EQA分别占77.07%和4.88%。预计明年参评实验室数量还将增加。

（1）认识未知病原微生物，发现鉴定系统存在的问题：截至到目前，EQA参评微生物实验室装备MOLDITOF时间飞行质谱有800余家，进口产品占比83.9%，鉴定药敏系统全自动超过1200家，半自动400余家，其中国产半自动占72.8%。常规的病原微生物鉴定主要依靠这些设备，当然，不同类型的设备鉴定病原谱范围有很大不同，也代表了实验室检测平台的硬件水平。实验室引进质谱仪对少见菌和新发病原菌的鉴定起到重要作用。

2019年4月china.com健康报网报道了全球30多个国家出现“超级真菌”耳念珠菌感染超过600例，死亡率为33-60%，并且是容易引起院内爆发性感染的超级耐药菌，引起了社会广泛关注。3月初，我们第一次质评活动就已经设计了来自血液感染的耳念珠菌标本。经统计，使用质谱方法鉴定正确率97.85%（364/372），其中一个质谱系统需要在科研模式下才能正确鉴定；某自动鉴定系统，69.99%（513/733）的实验室升级到最高版本时才可正确鉴定耳念珠菌，三成实验室未及时升级的设备及其他全自动、半自动鉴定系统几乎都鉴定为其他念珠菌。同时在总结时向实验室介绍了CLSI肉汤微量稀释法和MIC临时折点及MIC50和MIC90浓度分布范围相关知识点。

通过这次质评活动，使实验室了解到正确的鉴定方法，认识到准确鉴定耳念珠菌非常重要，一旦确认结果，需要严格执行手卫生和实验室生物安全操作，错误的鉴定结果将严重影响正确治疗和可能引起院内感染及传播。同时，这次质评活动也暴露了很多实验室未得到及时的软件升级，也促使厂家和代理商加快软件升级的速度，使实验室认识到新发重要病原菌的临床和公共卫生意义。

（2）仪器设备是手段，技术人员的能力才是根本：提升三级医院对病原菌的鉴定能力，MOLDI-TOF质谱系统是最重要的平台，大大拓展了微生物室鉴定病原谱的种类，如对奴卡菌、非结核分枝杆菌、厌氧菌、丝状真菌等常规设备难以鉴定的微生物。但也暴露出实验室过度依赖仪器，传统手工方法鉴定能力不足，在审核报告时缺乏简便、快速的确认结果的办法。对于重要的临床致病菌，对于仪器报告的结果需要审核结果人员有“火眼金睛”识别能力，既鉴定结果是否正确，也判断是否是病原菌。

质评活动发放的模拟标本，肺部感染患者的肺泡灌洗液分离的肺炎链球菌，用现有任何设备都存在错误鉴定为草绿色链球菌（是上呼吸道正常菌群，不引起下呼吸道感染），这些实验室的问题是没有用手工奥普托辛敏感试验或10%胆盐溶菌试验确认。另一个血培养阳性标本，正确结果是溶血嗜血杆菌，很多实验室都忽略了菌株的生长特征（溶血性），鉴定正确率只有35.31%（576/1631）。每一种鉴定系统都存在局限性，质谱仪和自动系统等也不例外。质谱对肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌可能鉴定错误；会将志贺菌鉴定为大肠杆菌；对非伤寒沙门菌可能报告伤寒沙门菌等^[12]。实验室必须建立有针对性的确认方法SOP，才能保证最大程度发放正确的病原学结果报告。

（3）鉴定结果影响药敏报告的正确性：肠球菌属对万古霉素存在获得性耐药（含VanA和VanB基因）和天然（固有）耐药（含VanC基因），鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌万古霉素MICs为8～16μg/ml（中介）是固有的中介水平耐药，自动药敏系统就难以检测出来，而菌株鉴定需要通过动力试验（手工）及产生黄色素（肉眼观察）确认，以区别感染控制目的之万古霉素耐药肠球菌（屎肠球菌或粪肠球菌VRE）。EQA参评实验室对铅黄肠球菌万古霉素药敏错误报告敏感或中介的占8.17%。部分肠杆菌属细菌，如变形杆菌属、普罗威登菌属、枸橼酸杆菌属等不同种的细菌，对抗菌药物天然耐药谱不同，菌种鉴定错误容易导致药敏结果的错报，EQA活动看到药敏结果错报的情况时有发生。

（4）参评实验室的血清鉴定分型能力不足：微生物中级EQA项目中，对于鉴定的霍乱弧菌需经血清学凝集试验排除01群、O139群血清型，因为这两种血清型可引起爆发流行。非O1群非O139群报告正确率只有25.4%（67/264），只能报告非01群不能排除非O139群霍乱弧菌的实验室占9.5%（25/264），只能鉴定到弧菌属的实验室占52.7%（139/264）。

高级EQA项目参评实验室情况好很多，不过正确报告肠炎沙门菌血清型占78.3%（1444/1844）。由于日常经费紧张或重视程度不够，很多微生物室缺少鉴定分型的凝集血清，导致对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌等病原菌缺少确认和分型手段。

2. 加强临床微生物学思维，正确报告病原学结果：近两年发放的来自正常菌群部位质评模拟标本，正确报告正常菌群的实验室，高级项目占84.7%（1740/2056），中级项目只占13.7%（32/264），其余实验室将定植菌/非致病菌作为有临床意义的结果报告；过去历年的质评活动的例子还很多，如除了报告皮肤感染的致病菌，也把正常菌群表皮葡萄球菌和药敏试验也报告；扁桃体化脓咽拭子标本，把咽部定植菌也当成致病菌报告，等等。经过历年的标准化培训和室间质评活动的配合，参评实验室在对定植菌部位标本的检验如何正确报告方面的认识在不断提高。

四、实验室信息化可促进微生物检验流程标准化

要做到对各种来源标本的标准化流程操作绝非易事，虽然培训和监督是必须的环节，但只有在实验室信息化助力下方能真正实现操作流程的标准化。将行业标准中规定的分析前、中、后全流程的要求和内容做到实验室的信息系统LIS和HIS中，如标本合格如何判断，什么情况拒收标本；什么情况需要复核结果，做什么试验复核结果，哪些是致病菌必须报告，对条件致病菌在什么情况下应该报告，定植菌简单报告等，都是LIS在控制，不是常规操作人员的主观意识决定。已经有微生物室在尝试做这样的信息系统。这确实是个系统工程，需要医院领导层面和信息管理、临床、检验科等各部门通力合作来实现，并不断改进提升以适应临床的需求。今年已进入“十四.五”医改进程，DRG支付方式对检验和临床微生物室都将是很大的挑战，我们必须加强自身实验室能力建设，改进工作流程，尽量缩短标本周转时间，加强全检验流程的质量控制，为保证临床抗感染治疗提供准确的病原学诊断及个体化治疗依据而不懈努力。

参考文献

[1]《印发2021年国家医疗质量安全改进目标的通知》（国卫办医函[2021]76号）

[2]《临床微生物实验室血培养操作规范》WS/T 503-2017.

[3]《下呼吸道感染细菌培养操作指南》WS/T499-2017.

[4]《尿路感染临床实验室诊断》WS/T 489-2016.

[5]《细菌性腹泻的临床实验室诊断操作规范》WS/T 498-2017.

[6]《临床微生物学检验标本的采集、转运和处理指南》WS/T 640-2018.

[7]《抗菌药物敏感性试验的技术要求》WS/T 639-2018.

[8]《抗丝状真菌肉汤稀释法药物敏感性试验》WS/T 411-2013.

[9]《抗酵母样真菌肉汤稀释法药物敏感性试验》WS/T 421-2013.

[10]《侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南》WS/T497-2017.

[11]马筱玲, 胡继红, 徐英春等. 临床微生物学实验室建设基本要求专家共识. 中华医学检验杂志. 2016, 39(11), 820-823.

[12]胡继红, 马筱玲, 王辉等. MALDI-TOF MS在临床微生物鉴定中的标准化操作专家共识. 中华医学检验杂志. 2019, 42(4), 241-249.