拉曼光谱检测技术在侵袭性真菌 病临床诊疗中的重要价值

【摘要】随着广谱抗生素和免疫抑制剂的大量应用、艾滋蔓延以及器官插管术的广泛开展，侵袭性真菌病已位居我国院内感染第2位，且出现越来越严重的耐药现象，严重威胁人们的生命安全。对真菌的快速鉴定及其抗生素药敏的快速检测，对高效诊断和治疗相关疾病至关重要。拉曼光谱可以提供致病菌的指纹图谱信息，是一种非常有前景的真菌快速鉴定及药敏检测工具。本文综述了拉曼光谱技术在侵袭性真菌病诊疗中的最新研究进展，包括真菌快速鉴定、快速药敏检测及光激活技术治疗真菌感染等，并对该领域未来的发展进行了展望。

随着广谱抗生素和免疫抑制剂的大量应用、艾滋蔓延以及器官插管术的广泛开展，侵袭性真菌病（Invasive Fungal Disease，IFD）的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，且出现越来越严重的耐药现象。中国医院感染监测网数据显示IFD现已位居我国院内感染第2位[1]。2019年，爆发“超级真菌”耳念珠菌感染。一旦感染这种真菌，死亡率超过60%，近50%的感染者会在90天内死亡。因此，精准、特异的IFD诊断具有必要性和紧迫性。

目前，临床上常用的IFD体外诊断方法包括组织病理学诊断法、影像学检查法、直接镜检和培养法。但是，上述方法均存在不足之处。组织病理学检测法除了灵敏度低外，很少能鉴定菌株至属的水平，且标本采集困难，重症患者难以忍受。直接镜检通常灵敏度低，存在一定的假阳性和假阴性。真菌分离培养尽管可以鉴定大部分感染的病原真菌，但培养往往需要很长时间，费时费力、阳性率低，且存在主观性和局限性。因此，开发快速、精准的侵袭性真菌病诊断方法十分必要。

拉曼光谱技术是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。由于拉曼光谱技术测试样品具有非接触性、非破坏性、所需样品量小、检测灵敏度高、分析速度快、灵敏度高的突出优势，已广泛应用于生物化学、安检安防、考古勘探、精密加工、珠宝文物鉴定以及医药检测等众多领域[2-4]。此外，拉曼光谱技术检测不受水分干扰，非常适用于生物体系的检测与鉴定。将拉曼光谱技术应用于侵袭性真菌病的临床诊断，为真菌病的检测与诊断提供新策略和新方法，具有非常重要的临床意义。因此，本文就拉曼光谱技术在侵袭性真菌病诊疗领域的研究进展做如下综述。

一、IFD流行病学概况

根据GAFFI（Global Action Fund for Fungal Infections）统计，全球有3.1亿人受真菌感染影响，1150万人受致死性真菌感染，超过150万感染患者死亡。流行病学研究显示，肾、心、胰、肝等实体器官移植后IFD的发病率为5%-42%，骨髓移植后的发病率为15%-25%，重症监护病房中的发病率为17%[1]。

1. 念珠感染流行病学现状：侵袭性念珠菌感染（Invasive Candidiasis，IC）依然是目前院内感染和社区感染最常见的侵袭性真菌病，具有发病率高、死亡率高、诊疗困难且治疗费用昂贵等特点。调查显示，在ICU中IC发病率约是普通病房的10倍[1]。来自全球76个国家、1265个ICU的EPICⅡ调查报告显示，IC发病率约为0.69%。2013年中国的一项多中心研究报告显示，ICU中IC的发病率约为0.32%。研究显示，导致IC发生的危险因素主要包括广谱抗生素的不合理使用、早产儿存活率升高、ICU住院时间延长、新的免疫抑制剂或化疗药物的应用、侵入性手术、血管内医疗器械的使用、接受移植治疗的患者增加以及存在其他慢性疾病等[5]。

2. 曲霉感染流行病学现状：侵袭性曲霉菌病（Invasive Aspergillosis，IA）是重要深部真菌感染之一。IA是一种机会性真菌感染，诊断困难、死亡率高。近年来由于各种免疫抑制剂的广泛使用、器官移植、HIV人群的增多，IA的发病率呈上升趋势，已成为仅次于侵袭性念珠菌病的第2位深部真菌感染。据不完全统计，全球有29万例慢性肺曲霉病（Chronic Pulmonary Aspergillosis，CPA）患者和484万例过敏性支气管肺曲霉病（Allergic Broncho Pulmonary Aspergillosis，ABPA）患者，其中中国约有4万例CPA患者和49万例APBA患者。IA的死亡率非常高，全球IA的死亡率为30%-95%，中国的死亡率为39%-100%[6]。

3. 隐球感染流行病学现状：隐球菌通常感染免疫功能低下的患者，荚膜多糖是其主要的致病因子，隐球菌主要通过肺进入机体从而引起肺隐球菌病，但因其嗜神经的特性，中枢神经系统也是隐球菌的主要靶器官。隐球菌感染的主要危险因素包括HIV感染和器官移植。由于感染部位的不同和患者的免疫功能的差异，其临床症状也多种多样，轻者无症状，重者危及生命。治疗方案主要由患者的免疫状态和病情的严重程度决定，主要包括多烯类和咪唑类抗真菌药物的治疗。即使经过抗真菌治疗，HIV患者隐球菌病的病死率仍较高，而隐球菌脑膜炎/脑膜脑炎（Cryptococca Meningitis/Meningoencephalitis，CME）患者的临床治疗失败率之高让人难以接受[7]。据统计，在HIV阳性人群中，全球每年约有10万例新发隐球菌感染病例，已有约62.5万例死亡源于隐球菌性脑膜脑炎。其中，并发隐球菌感染的器官移植患者死亡率高达49%。在我国，约70%的隐球菌病为无明确免疫功能抑制因素的人群。隐球菌病也存在爆发与流行风险，格特隐球菌（Cryptococcus gattii，C gattii）曾在加拿大温哥华岛和美国西北部地区引起隐球菌病大爆发，而患者是免疫功能健全的人群。

二、拉曼光谱技术在侵袭性真菌病诊疗中的应用

拉曼光谱是1928年印度科学家拉曼在实验中发现的。当一束单色光照射在某些物质上时，会产生一些不同于单色光、频率发生变化的散射光。这部分散射光的波长与原激发光的波长总是相差一个恒定的数量。这种散射后频率发生变化的现象称为拉曼效应（图1）。这一发现在当时立即引起了轰动，并被英国皇家学会称为“20年代实验物理学中最杰出的发现之一”，拉曼本人也因此获得了1930年诺贝尔物理学奖。

图1. 拉曼散射原理

拉曼光谱（Raman Spectra），是基于拉曼效应，对入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。由于拉曼散射光非常微弱，很难被检测到，导致拉曼光谱技术的发展非常缓慢。直到20世纪90年代，随着光纤样品探头、组合光学设计、计算机以及数据获取、处理、分析等技术的发展，解决了仪器的一些局限，从而使拉曼光谱仪的性能得到很大提高，使其更具有实际应用价值。

拉曼光谱技术在IFD领域的应用主要包括真菌快速鉴定、快速药敏检测、光激活技术治疗真菌感染等三个方面。

1. 真菌快速鉴定：表面增强拉曼散射光谱（Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS）技术，能生成微生物唯一的生物分子“指纹”光谱。1993年，Magee提出了“全生物体指纹图谱”的概念，阐明可以利用整个生物体的指纹图谱对病原微生物进行识别和检测。因此，可以利用SERS技术捕获检测病原微生物的本征谱，从而实现对其快速检测。

Zukovskaja等[8]采用紫外-拉曼光谱研究与呼吸系统疾病有关的8种不同真菌。采用主成分分析和线性判别分析相结合的方法建立了属、种和菌株水平的分类模型，并采用留一交叉验证进行评价。在属水平上的分类准确率为97.5%，而在种水平上的分类准确率为100%。最后对3株烟曲霉进行了分类，准确率为89.4%。Strycker等[9]采用785nm位移差分拉曼光谱技术测量了10种霉菌分生孢子的拉曼光谱，包括黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、米曲霉、黑葡萄穗霉、C产黄青霉等。鉴定准确率在99%以上。Maquelin等[10]采用共聚焦拉曼光谱技术对42株临床常见5种念珠菌进行检测。多变量统计分析表明，拉曼光谱鉴定准确率高（97%-100%）。以上研究结果显示，拉曼微光谱技术为临床真菌鉴定提供了一种快速、准确、易于使用的方法。

2. 快速药敏检测：药敏试验是指导临床医师合理选用抗生素、提高疗效并避免抗生素滥用的重要手段。目前，临床微生物实验室的药敏试验需经人工培养后检测微生物对抗生素的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）或最小抑菌直径，耗时长达3～7天。由于费时费力，医生无法在第一时间获得最有效抗生素信息。因此，发展快速药敏检测方法和设备对临床医疗和公共卫生意义重大，而拉曼光谱技术具有解决这个难题的巨大潜力。

由于微生物在抗生素作用后，会产生一定的生化反应，如自身组成变化、代谢产物变化、同化速率变化等，通过拉曼光谱技术对这些变化进行检测，从而确定抗生素对微生物是否有效。Tao[11]、Yang[12]等人发展出基于单细胞拉曼和重水标记的病原菌快速药敏检测新方法，并用于临床尿液病原菌的直接药敏检测。通过快速过滤去除人体细胞及杂质干扰，并经过离心快速富集和转移尿液细菌直接进行药敏检测，克服冗长尿培养限制；利用单细胞拉曼对低至单个细菌进行检测的优势，解决了临床样品细菌数量少的难题，实现在2.5小时内完成接收尿液到产出药敏结果，全过程远快于标准药敏检测所需的48小时，可为临床快速诊断提供依据（图2）。Karanja等[13]利用受激拉曼散射成像在单个细胞水平上探索氟康唑敏感菌株和耐药菌株之间的代谢差异。结果显示氟康唑敏感和耐药白念珠菌在脂肪合成方面存在显著差异，有望成为快速药敏检测新的标志物。

图2. 临床尿液样本的快速拉曼药敏检测流程[12]

它与传统自动化药敏检测系统相比，基于拉曼光谱的快速药敏检测技术具有如下显著优势：（1）无需培养，即时检测：该方法通过快速富集和转移病人样本中的病原微生物（仅需15分钟），直接对低至单个微生物进行药敏检测，克服了临床样品中致病微生物数量少、需要冗长培养的难题；（2）样本处理简单快速：由于水的拉曼光谱很弱，谱图又很简单，因此拉曼光谱能在接近自然状态、活性状态下来对生物样本进行研究，获取相关的结构及其变化信息。操作非常简便，仅需加入重水进行1小时内的孵育即可；（3）检测时间大大缩短：与传统的基于纯培养的药敏性检测方法需时3-7天相比，联用单细胞拉曼和重水标记，利用抗生素作用下，耐药菌和敏感菌“饮用”重水活性不同，在仅标记重水0.5-1小时后，即可根据氘相关拉曼特征峰判断细菌对抗生素的活性响应，筛选出有效抗生素。该方法从接收样本到药敏结果读出的全流程，全程仅需2.5小时，为临床迅速诊断和选择合适抗生素进行感染治疗提供依据，尤其为危急感染提供了宝贵的黄金诊疗窗口时间。（4）适用于不可培养微生物的测定。这些优势表明拉曼光谱是一种非常有前景的快速药敏检测工具。

3. 光激活技术治疗真菌感染：He等[14]设计了以中空金银纳米材料为基底的多功能诊疗一体化纳米药物，并引入高灵敏、高分辨率的SERS成像技术，用于精准拉曼影像监控下的耐药菌感染伤口的灭菌与促愈合研究。该纳米药物在近红外激光的辅助下，可以实现光热效应、银离子以及活性氧等多种途径的协同杀菌作用（图3）。通过系统的体内和体外实验研究证明，该纳米药物具有超强的光谱抗菌效果，既可有效清除普通的革兰氏阳性菌和革兰氏阴菌，又可有效杀死多种难以治疗的耐药菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌。在细菌感染的小鼠皮肤慢性伤口试验中，该药物具有高效的灭菌效果。低浓度纳米药物处理伤口后可以快速高效灭菌，从而进一步促进慢性伤口的愈合，同时减少了银离子过量摄取带来的毒性问题。Gao等[15]构建了一种多功能等离激元金芯片，用于微生物的早期诊断和高效杀灭。该芯片不仅可以有效区分革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌，而且具有优异的光热抗菌活性（98%），能原位灭活革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，具有很大的抗菌应用潜力。Wang等[16]设计了一种基于表面增强拉曼散射（SERS）的多功能芯片，该芯片由纳米银修饰的硅片经4-巯基苯硼酸（4-MPBA）标记而成，可以有效地捕捉、识别和灭活病原菌。该芯片在低浓度（500-2000CFU/mL）下病原菌捕获率约60%，抗菌率达97%。以上结果说明，拉曼光谱技术在临床感染疾病治疗上具有较高的研究价值与临床转化前景。

图3. 光激活技术治疗微生物感染[14]

三、总结与展望

由于拉曼光谱相对于其他检测方法具有非接触性、非破坏性、检测灵敏度高、时间短、样品所需量小及样品无需制备等优点，已经成为生物医药领域的研究热点，越来越多的研究人员将拉曼光谱用于IFD诊断研究中。基于上述拉曼检测技术在IFD诊疗中的诸多应用和拉曼检测的优势，拉曼检测技术在IFD的早期诊疗中具有良好的应用前景。然而，目前的研究大多处于实验室研究阶段，距离临床应用还有很长的路要走。

为尽快实现拉曼光谱技术在IFD诊疗中的临床应用，可考虑从以下几个方面发展快速、高效的拉曼光谱检测方法：（1）开发特异性强、SERS活性高的拉曼探针；（2）建立致病真菌标准拉曼光谱库；（3）研发小型化、自动化拉曼光谱设备；（4）研发便携式拉曼检测仪，并结合快速诊断技术（如侧向流免疫层析、微流控等），用于病原菌的现场快速检测。

相信随着拉曼光谱技术的不断发展和完善，该技术一定会在IFD诊疗领域大放异彩。

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