宏基因组二代测序技术在病原微生物感染诊断中的临床应用
【摘要】感染性疾病仍然是危害人类健康和全球公共卫生安全的重要问题。宏基因组二代测序技术作为一种迅速发展的分子检测方法，具有快速、准确、不依赖于培养等优点，在临床病原微生物诊断方面具有独特的优势，尤其是在罕见及新型病原体检测中发挥了重要的作用。本文就宏基因组二代测序技术在病原微生物感染诊断中的应用进展进行综述。
【关键词】宏基因组二代测序；病原微生物；感染性疾病
感染性疾病在全球范围内依然是威胁人类健康且致死率高的疾病[1]。近年随着高耐药性病原体的出现，如耳念珠菌、耐碳青霉烯类肠杆菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）等，为感染疾病的治疗增添了难度。尤其是2019年新型冠状病毒的出现，进一步强调了在诊断以及治疗感染性疾病方面不断面临的挑战。目前常用的实验室病原体诊断技术，如培养、核酸扩增、血清学检测等，仍存在周期长、阳性率低等缺点，无法满足临床对于病原学诊断的需求，约有60%的中枢神经系统感染[2]、20%-60%的肺部感染[3, 4]以及50%的血流感染[5]不能得到明确的病原体诊断。
在过去30年间，分子技术的发展已经极大地提高了实验室诊断病原体的能力，下一代基因测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术又称第二代测序技术或高通量测序技术，可以快速准确同时对大量DNA片段进行测序，且近年来成本呈指数型下降，为临床实验室感染性疾病的诊断和防治提供了新的方法。而宏基因组二代测序技术（metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS）是基于下一代基因测序技术的一种应用，mNGS是直接对临床标本中（包括脑脊液、呼吸道分泌物、粪便、尿液、血液和组织等）所有DNA或RNA序列进行扩增测序，无需预先假设病原体或分离培养，无差别扩增标本中宿主和病原体的核酸序列，通过对获得基因组信息进行分析比对得出致病病原体，指导临床诊断和治疗，在诊断复杂和严重感染方面显示出巨大的优势[6]。本文综述mNGS在病原微生物感染中的诊断优势和临床应用进展。
一、mNGS简介及发展现状
宏基因组也称元基因组，是一种不依赖于培养技术，以样本中微生物和宿主基因组总和为研究对象，通过测序分析和基因筛选，检测样本中可能存在的微生物的新型研究方法。mNGS最早被用于研究土壤、酸性废水等环境中无法培养的微生物[7, 8]，随着mNGS操作流程简化[9]、周转时间（TAT）缩短[10]、灵敏度提高[11]且成本降低，逐渐被应用于临床实验室微生物鉴定。mNGS于2008年3月首次应用于临床微生物鉴定[12]，Palacios等利用mNGS在三名接受同一供体器官移植的患者样本中发现了一种新型沙粒病毒（arenavirus）。在此之后mNGS应用于临床的研究及报道呈现指数型增长，最常用于中枢神经系统感染、呼吸系统感染、血流感染的病原体诊断。其中大多数临床样本mNGS检测是基于第二代测序技术（大规模并行短读测序），近几年间基于第三代测序（单分子实时测序）进行的病原体鉴定也已经实现临床运用[13]。一系列研究已经表明，它与传统的基于培养的方法相比，mNGS具有更好的诊断性能[11, 14, 15]。例如，一项包含了511个临床样本的mNGS病原体诊断的队列研究表明，mNGS的检测灵敏度（50.7%）高于传统培养（35.2%），并且受先前使用抗生素的影响较小[11]；Parize等人的研究结果显示[16]，在免疫功能低下的患者中，mNGS检测到致病微生物的比例明显高于传统方法（36%vs.11%，p＜0.001）；在Street等人的一项研究中[17]，对于人工关节感染的患者，mNGS相较超声处理后的组织培养显示出更高的种水平敏感性（88%）和特异性（80%）。
此外，mNGS的应用也为临床感染性疾病诊断提供了新的检测思路。例如，Zhang等人[14]在三名不能承受或拒绝接受支气管镜的患者中，通过mNGS在其外周血样本中检测到了吉氏肺孢子菌；Mai等人[18]首次报道了通过使用mNGS在尿液标本中检测病毒性脑炎的病例。因此，mNGS可以被视为一种非侵入性的诊断手段，通过血液、尿液等易于获得的临床样本对无法经受侵入性操作的重症感染病例做出诊断，但这一方面的应用仍需进一步的研究和临床实践。
二、mNGS在病原体感染诊断的应用
1. mNGS在常见病原体感染中的应用：对于大部分临床常见病原微生物，在常规检测手段基础上mNGS可以弥补其灵敏度低、TAT长等缺点。Wang等人[19]利用mNGS在脑脊液标本中成功检测并诊断了18/23例结核性脑膜炎，极大地缩短了TAT时间且敏感性高于PCR和涂片抗酸染色；Zhang等人[20]在135名细菌性脑膜炎患者中应用mNGS诊断病原体为肺炎链球菌，敏感性和特异性分别达到了73.1%和88.1%；Pendleto等人[21]在1例细菌性肺炎患者的肺泡灌洗液标本中，在9小时内利用mNGS确诊了病原体为铜绿假单胞菌，远快于实验室传统培养技术所需的23小时。对于情况复杂的重症感染患者，mNGS也显示了出其独有的优越性，例如Li等人[22]的一项研究称，mNGS在一位持续高热而培养和血清学检测均为阴性的男性患者尿液中检测到了粪肠球菌，后续经qPCR和诊断性治疗证实后好转。
2. mNGS在罕见病原体感染中的应用：由于mNGS不依赖微生物培养，因此其对于难以分离以及无法培养的罕见病原体检测具有独特的优势。2014年，Wilson等人[23]报道了一例罕见中枢神经系统感染钩端螺旋体病，传统实验室检测方法包括脑脊液培养、血清学检测以及PCR检测等均未发现致病病原体，而使用mNGS在脑脊液样本中检测到了桑塔罗赛钩端螺旋体特异性序列，且后续的血清学检测和PCR均验证了这一病原体；2015年Sakiyama等人[24]报道了4例常规手段均无法确诊的脑脊髓炎病例，通过mNGS检测发现了从未报道过的古细菌嗜盐菌感染；近三年的几项研究或报告也都利用mNGS成功诊断出了其他检测手段所无法确认的罕见病原体，Fung等人[25]在一个异基因造血干细胞移植后状态的患者血浆标本中检测到了沙眼衣原体感染；Wang等人[26]通过mNGS诊断出一例原发性阿米巴脑膜炎的致病病原体为福氏耐格里阿米巴；Wollants等人[27]通过mNGS诊断一名老年患者为西尼罗河病毒感染。
3. mNGS在新型病原体感染中的应用：mNGS通过无偏移性地获得样本中的核酸序列可以检测未知病原体，在诊断新型病原体感染方面具有重要的作用。Paintadosi等人[28]报道了通过mNGS在一例脑炎患者中快速识别出一种新型蜱传播黄病毒——玻瓦桑病毒；Ai等人[29]首次报道了一例眼内感染伪狂犬病毒的患者，并证实感染源为养殖场污水；Wylie等人[30]利用mNGS揭示了痤疮丙酸杆菌这一皮肤正常定植菌可以引起慢性脑膜炎的发生；杂色松鼠博尔纳病毒[31]、裂孢蛙粪霉菌[32]、卡奇谷病毒[33]等新型微生物或是未曾报道引起过人类感染的微生物，均通过mNGS检测发现并确诊。值得一提的是，mNGS对新型冠状病毒的检出也有重要贡献。在武汉疫情暴发之初，Chen等人[34]利用mNGS在2名有疫区接触史的患者肺泡灌洗液中快速鉴定出一种新型冠状病毒（COVID-19），并根据系统发育分析推断出其可能为动物传染人类的新型病毒。由此可见，这与传统微生物检测技术相比，mNGS更有利于发现新型病原体及新发传染病，有助于更快更好地应对疾病爆发流行。
三、mNGS在病原体检测中的问题与不足
mNGS在病原体诊断方面展现的优势使其近年来受到广泛关注，但mNGS目前仍未成为实验室常规检测方法，是因为其具有以下几点问题与不足：（1）样本中宿主基因组数量远大于病原体，可能导致假阴性的出现，mNGS的敏感性还需进一步提高；（2）对于呼吸道分泌物等非无菌标本，难以界定病原体感染与定植的界限；（3）mNGS缺乏标准化的样本前处理及检测流程，尚未建立统一的指南；（4）mNGS产生大量测序结果，且病原体基因组数据库不完善，对于数据的存储和分析需要专业的生物信息团队；（5）mNGS对病原体的检测仍停留在定性阶段，缺乏定量方面的研究；（6）mNGS在检测病原体的同时可以获得大量患者的遗传信息，可能涉及伦理问题。
四、小结
mNGS技术不依赖于病原体分离培养，针对临床常见、罕见病原体均可获得快速准确的诊断结果，有助于辅助临床诊断以及控制传染病流行；随着mNGS技术的不断发展与完善，其已经逐渐成为传统检测方法的补充，在临床病原体检测方面得到了越来越多的成功应用。在未来的研究中，mNGS技术应建立科学严谨的操作指南，加快病原体尤其是罕见病原体的基因组数据库建设，进一步降低成本，更好地服务于临床实验室检测以及患者的治疗。
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