样本处理对SARS-CoV-2抗原快速检测的影响：病毒灭活和VTM选择及样本保存

周海卫，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所，副研究员，硕士研究生导师。现任中华医学会医学病毒学分会青年学组副组长。主要从事传染病诊断试剂标准物质研制及试剂质量控制与评价工作。作为负责人研制了新冠病毒、流感病毒、TORCH类等超过20项体外诊断试剂国家标准物质，作为第一起草人制定了《呼吸道病毒多重核酸检测试剂盒》、《新型冠状病毒抗原检测试剂盒质量评价要求》等多项国家和行业标准。在Analytical  Chemistry、AIDS等杂志发表SCI及国内核心期刊论文近20篇，参编《体外诊断试剂检验技术》等专著。

COVID-19的全球流行已经对全世界的公共卫生构成了重大威胁，目前，实时逆转录聚合酶链反应（Real-time  Reverse Transcription-polymerase Chain  Reaction，RT-PCR）检测是COVID-19诊断的金标准。然而，RT-PCR分析需要特殊设备、训练有素的检测人员和一定的样品转运时间，不利于新冠疫情的及时防控[2-4]。相反，抗原快速检测 （RAD）操作简单，只需几分钟即可获得结果。而且研究表明，当样本处于高病毒载量时，新冠抗原快速检测具有与RT-PCR检测相当的灵敏度和特异性[5]，因此，为及时防控疫情，对新冠抗原快速检测的需求大幅增加。然而，市面上在售的新冠抗原快速检测的灵敏度在不同的研究中存在很大差异[6-10]。欧洲疾病预防与控制中心（ECDC）对于2020年10月23日前9种抗原快速检测试剂研究分析显示，它与RT-PCR方法对比，灵敏度为29%-93.9%，特异性为80.2%-100%[11]。根据世界卫生组织的技术指导，新冠抗原快速检测的有效性取决于几个因素，包括样本中病毒的浓度、患者发病的时间、采集样本的质量、样本的收集方式与样本处理方式，以及RAD试剂盒中试剂的精确配方。目前，关于样品处理方式，包括样品灭活、VTM的选择和样品保存方式对新冠抗原快速检测性能的影响还没有系统的研究。

本研究旨在确定样品不同处理方式对新冠抗原快速检测灵敏度的影响。此外，该研究还报告了不同样品保存条件对新冠抗原快速检测试剂性能的影响。

一、研究方法与结果

1.β-丙内酯可能是更为合适的病毒灭活方式：该研究为研究不同病毒灭活方法对新冠抗原快速检测试剂盒灵敏度的影响，选择了具有不同稀释比的两种SARS-CoV-2毒株培养物（分别为毒株1和毒株2），并将其分为三个组：未灭活组、β-丙内酯灭活组和热灭活组。结果显示，与未灭活组相比，热灭活组显著影响新冠抗原快速检测试剂盒的灵敏度；而β-丙内酯灭活组对新冠抗原检测试剂盒的影响较小（详见表1）。

表1. 各RAD检测试剂盒的Lod值

注：1结果表示为TCID50/mL；2计算BPL灭活与不灭活的LoD比率；3计算热灭活与不灭活的LoD比率。

2. 选择合适的VTM能保证新冠抗原快速检测试剂盒的性能：基于不同新冠抗原快速检测试剂的最低检测限，采用高（50×LoD）、中（10×LoD）、低（2.5×LoD）病毒载量样本，通过4种VTM试剂（Tryptose  Phosphate  Broth、麦瑞科林MANTACC、国盛医学一次性使用病毒采样管、友康），采用2种胶体金法新冠抗原快速检测试剂（广州万孚、北京金豪）和1种荧光免疫层析法抗原检测试剂（深圳易瑞）进行检测，评估不同VTM对于抗原检测试剂的影响。结果表明VTM2和VTM3显著影响新冠抗原快速试剂盒的灵敏度，尤其对低病毒载量（2.5×LoD）样品，而VTM1和VTM4影响较小（详见图1）。

注：（A）广州万孚，（B）北京金豪，（C）深圳易瑞，（D）胶体金平台和免疫荧光平台标准色卡

图1. 不同VTM溶液对RAD检测试剂盒的影响

3. 合理的样本保存条件对新冠抗原快速检测试剂盒灵敏度的影响较小：基于不同新冠抗原检测试剂最低检测限，采用高（50×LoD）、中（10×LoD）、低（2.5×LoD）病毒载量样本进行不同保存条件处理，采用2种胶体金法抗原检测试剂（广州万孚、北京金豪）和1种荧光免疫层析法抗原检测试剂（深圳易瑞）进行检测，评价不同保存条件对于新冠抗原快速检测试剂的影响。结果发现，随着保存时间和冻融次数增加，抗原检测的灵敏度下降，LOD略有升高。但即使对于低病毒载量（2.5×LoD）样本，大多数RAD检测试剂盒（如广州万孚、深圳易瑞）仍然在检测范围内（详见图2）。

注：（A）广州万孚，（B）北京金豪，（C）深圳易瑞

图2. 不同病毒保存方式对RAD检测试剂盒LoD的影响

二、讨论与结论

本研究探讨了不同灭活方法、VTM溶液和样品保存方式对四种新冠抗原快速检测试剂盒灵敏度的影响。根据研究结果，不同病毒灭活方式和VTM溶液对于新冠抗原快速检测试剂的性能会产生明显差异，需选择适宜的灭活方式与VTM溶液保存，而对于大多新冠抗原快速检测试剂，在不同保存条件下仍可保持稳定。这一发现与先前一项研究结果一致，该研究报告称热灭活会影响RT-PCR对SARS-CoV-2的检出率，且热灭活可能是RT-PCR检测假阴性结果的可能因素之一[12-13]。这可能是由于热灭活会破坏SARS-CoV-2的RNA和蛋白质结构，而RT-PCR检测的是SARS-CoV-2的RNA，新冠抗原快速检测试剂盒检测的是SARS-CoV-2抗原。因此，热灭活可能也会显著影响新冠抗原快速检测试剂盒的灵敏度。

化学灭活剂可以使含SARS-CoV-2的临床样本失去活性，从而保证检测人员的安全性[14]。而部分VTM   溶液中可能存在一些可以使蛋白质变性和失活的化学物质，从而影响新冠抗原快速检测试剂盒的性能。VTM溶液对新冠抗原快速检测试剂盒的影响主要来自其对试剂盒中所使用的检测抗体的影响，这些抗体利用不同抗原表位识别临床样本中的特定抗原，从而检测临床样本是否含SARS-CoV-2。当样品在VTM溶液保存过程中，VTM溶液中的一些化学物质可能会改变试剂盒中抗原的三级结构，并使其降解。因此，选择合适的VTM溶液保存可以保证新冠抗原快速检测试剂盒的性能不受影响。

本研究表明随着保存时间的延长和冻融循环次数的增加，新冠抗原快速检测试剂盒的最低检测限略有下降，但大部分仍在检测范围内。先前一项研究也表明，十个冻融循环后DNA靶标的拷贝数下降，这影响了液滴数字PCR的性能[15]。此外，当全血在EDTA管或血浆制备管中在25℃下储存超过6h时，也无法进行 HIV病毒载量测试[16]。因此，合理的样品储存温度和保存时间也是保证检测结果准确性的必要措施。

综上所述，选择合适的样本灭活方式和VTM溶液保存样本是很有必要的，这能保证新冠抗原快速检测试剂盒的性能不受影响。

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注：本文译自Biosafety and Health杂志发表的篇文章[1]，该文章为研究型文章，供国内同行学习和研究提供更多的资料与借鉴。

作者单位：100050北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂2 室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室