单分子免疫检测新技术实现路径与临床应用价值
官志超，硕士，苏州宇测生物科技有限公司总经理，2011年厦门大学化学系本科，2014年厦门大学化学系化学生物学专业硕士，主要从事单分子免疫检测技术研发和产业化。E-mail: zcguan@astra-biotech.com
董文飞，博士，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所所长助理，研究员，博士生导师，1996年浙江大学化学工程系化学工程专业本科毕业，1999年中国科学院长春应用化学研究所高分子物理化学专业硕士毕业，2004年获德国波兹坦大学自然科学博士学位，主要从事纳米生物医学工程及其在药物递送、在体成像和液体活检等方面的应用研究。
一、单分子免疫检测技术发展历史
蛋白质是人体组成的最重要的成分之一，绝大多数生命过程都有蛋白质参与。以检测蛋白质为主的免疫检测是目前临床体外检测领域最重要的组成部分。常规免疫检测技术按照发展历史和检测性能，依次为放射免疫[1]、酶联免疫[2]、化学发光技术[3]。此外，针对应用场景不同，研究者也开发出针对POCT（Point-of-care test）[3]应用场景的便携式免疫检测方法，例如侧向层析、微流控芯片等技术。化学发光技术由于自动化水平高，灵敏度高，精密度好，通量高，已经成为临床领域最主流的免疫检测技术。然而化学发光自诞生以来经过近50年的发展，已经达到技术瓶颈期，检测性能很难进一步提高。在临床领域，许多重要的生物标志物由于在人体内浓度极低（1fg/mL-1000fg/mL）[4]，仅能实现1pg/mL检测下限的化学发光技术难以有效检测出这些生物标志物，显著限制了新型生物标志物在科研和临床领域的应用。一种符合临床需求的新一代免疫检测技术急需开发应用。
单分子免疫检测技术由于检测灵敏度比化学发光技术高1000倍，被认为是下一代免疫检测技术。单分子免疫检测技术最早可溯源至1961年，由美国斯坦福医学院的Boris Rotman[5]将β-半乳糖苷酶及其底物溶液分散到油包水液滴中，在反应后观察液滴产生的荧光信号，从而实现单分子级别β-半乳糖苷酶检测。由于单分子免疫检测技术难度大，门槛高，早期的单分子免疫检测技术极大程度依赖于检测设备极高的检测灵敏度和精密度水平，因而一直难以真正产业化。随着检测技术的发展和新型检测路径的开发，直至2011年，美国Singulex公司利用激光共聚焦技术实现单分子信号扫描的方法，推出Erenna单分子免疫检测技术平台正式标志着单分子免疫检测技术进行产业转化。2014年，美国Quanterix公司基于“Digital ELISA”[6]技术路径推出全自动单分子免疫检测系统HD-1，将单分子免疫检测技术带入新高度。然而受限于单分子免疫检测技术路径，Erenna与HD-1都存在产品缺陷，在市场推广时遇到明显阻力。同时，由于两个单分子免疫检测系统设备、试剂、耗材远超常规化学发光系统，使其难以在市场上广泛应用。新型单分子免疫检测技术要在科研、临床领域真正实现价值，必须向更具鲁棒性、稳定性、更低成本的技术路径发展。
二、单分子免疫检测技术实现路径
1. 单分子荧光成像：目前主流的单分子免疫诊断方法主要使用全内反射显微镜或使用共聚焦显微镜等可以突破传统光学尺度限制的成像设备[7, 8]。由于这些设备通过光学系统的优化与改进，突破了光学衍射极限，可以实现10nm乃至10nm以下的分辨率，因此可以直接对单分子荧光染料进行成像分析[9, 10]。该技术路径的优势在于，由于使用了极其灵敏的光学检测设备，因此可以兼容普通荧光染料分子，例如常见的荧光染料分子FITC或是藻红蛋白等。其缺点在于成像系统极其昂贵，难以进行商业化应用，仅在科研领域被使用。其次，这些成像系统对成像表面光洁度、平整程度要求高，通常能兼容的都是基于硅片或玻璃表面的固相表面反应，会严重影响检测灵敏度水平。在实际应用过程中受到明显限制。
随着以受激发射损耗显微镜技术（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）、光激活定位显微镜技术（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）、随机光学重建显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）等超分辨荧光显微技术的发展，单分子检测技术发展进一步得到提升[11]。但是同样受限于检测技术路径，超分辨单分子检测技术难以真正应用在临床检测领域。
2. 单分子信号扫描：该类型的技术以Singulex公司的产品为代表，其检测原理是将高功率激光以共聚焦形式[12]聚焦到艾里斑尺寸，在极小范围内激发荧光染料分子，实现单分子级别的信号检测。Singulex公司第一代产品Errena使用毛细管迫使染料分子逐个流过激发光检测窗口，实现对样本中染料分子的扫描检测。由于该系统使用的毛细管内径小，容易出现样本流速慢，容易堵塞的问题。为了解决该问题，该公司第二代产品SMCxPro通过旋转激发光窗口，对待检测溶液进行三维尺度的扫描，进而实现单分子信号的捕捉和检测。单分子信号扫描，需要将激发光聚焦到艾里斑尺度，以尽可能降低单分子信号交叠的可能性，实现真正单分子水平的信号检测，因此对光学系统精密度要求极高。Singulex公司在该策略上尝试的解决方案在一定程度上实现了单分子免疫检测商业化的问题，但是受限于设备精密度、稳定性、成本、自动化水平等因素，难以在市场有效推广。
3. 信号放大：该类技术方案以美国Quanterix公司开发的SiMoA技术[13]为主。该技术由2010年由美国双院院士David Walt等人发表的Digital Elisa技术转化而来。Digital Elisa技术沿用了Digital PCR的检测理念，将具有信号放大的酶分子对待测分子进行标记后，分散到极小尺寸的液滴内，在液滴内通过酶分子催化底物实现单分子信号放大。具体而言，在液滴外使用磁珠免疫反应在磁珠表面形成双抗夹心的三明治结构后，通过biotin和链霉亲和素的标记方法，将三明治结构标记上该体系特有的半乳糖苷酶。利用微流控芯片技术，将这些磁珠与底物溶液混合后分散入高通量的微孔阵列中。这些微孔尺寸略大于磁珠尺寸，一个微孔只能容纳下一个磁珠。最后使用油相将微孔密封进行物理隔离，形成十万数量级的独立液滴。捕获了抗原的磁珠由于含有半乳糖苷酶，可以催化底物产生荧光分子，从而使得含有抗原的微孔可以发出荧光信号。最终该系统通过发出荧光信号的微孔个数进行个数统计和占比分析，来实现极高灵敏度的定量检测分析。SiMoA系统通过信号放大系统，显著降低了检测系统对高精密度光学系统的依赖，提高了设备的稳定性，降低了设备的制造成本，使得大规模商业化成为可能。当然，需要注意的是，SiMoA系统在降低设备成本的同时，由于检测需要精密的微流控芯片辅助，因此试剂耗材的成本远超传统免疫检测技术。SiMoA系统尽管在科研领域已经实现了大规模应用，在试剂使用成本高度敏感的临床领域，依然难以有效推广。
三、单分子免疫检测技术应用现状
单分子免疫检测技术由于检测灵敏度比化学发光技术高了1000倍，因此被认为是下一代免疫检测技术，其核心价值在于新型生物标志物开发与临床应用。对检测灵敏度有高度需求的领域主要包括：神经科学领域、传染病检测、炎症感染、眼科等[14]。
1. 神经科学领域：血脑屏障的存在导致在脑脊液中含量相对较高的标志物在外周血中的丰度降低数百倍。对于神经领域的常规研究来说，能够运用超灵敏的检测方法，直接从较易获得的外周血中检测丰度极低的已知标志物的水平或探索未知的神经标志物，能够极大地提高研究效率。此外，研究人员还能够根据需求，测定脑部及外周血中标志物的含量差异，获得关于疾病本身以及血脑屏障相关的更有意义的研究成果。
血脑屏障的存在限制了脑组织中的特定神经系统相关标志物进入外周血，使其在外周血中的丰度极低，用传统方法难以对其进行精确检测。而越来越多的研究成果表明，多种相关蛋白标志物在外周血中的含量能够一定程度上反应多种神经系统疾病，如阿尔茨海默病（AD），Preische[15]等人利用单分子免疫检测平台和遗传性阿尔茨海默病家族族谱，证明脑脊液中NfL浓度水平（n=187）与血清中NfL浓度水平（n=405）的升高与家族性阿尔茨海默病具有良好的相关性。通过单分子免疫诊断技术检测血液中NfL含量，最早可以提前十六年预测家族性阿尔茨海默病症状早期的进展（图1）。
图1. 阿尔茨海默病早筛中的应用，（左）横向研究血清NfL水平；（右）纵向研究血清NfL年变化率
多发性硬化病（MS）是最常见的一种中枢神经脱髓鞘疾病，由多种因素共同导致的结果，包括局部炎症、慢性神经损伤和缺乏有效的恢复等。Disanto[16]等人利用单分子免疫诊断技术测量血液中NfL的浓度，通过对比健康组与MS阳性组血中NfL浓度发现，阳性对照组血液中NfL浓度显著提高。同时数据显示，随着MS损伤程度增加，NfL浓度亦随之提高。同时该文章还对不同类型靶向药物治疗过程中，患者血液中NfL浓度进行跟踪观察，从而对药物有效性进行评估（图2）。
图2. 多发性硬化症诊断的应用，（左）脊索损伤或脑部损伤患者血清中NfL浓度高于对照组，且随损伤程度增加而升高；（右）使用不同类型的靶向药物能够监测到患者血清中NfL浓度的变化
具有超高检测灵敏优势的单分子免疫检测技术为血清/血浆中实时监控这些标志物提供了技术支撑，为脑损伤和神经退行性疾病的更简便诊断方法提供了可行性。因此对于神经领域的病程进展，甚至能够在早期症状发生前对疾病发生进行预判。
2. 传染病检测：单分子免疫检测技术可在传染病潜伏期和出现免疫反应前检测到生物标志物，实现更早期的诊断，显著降低传染病传播概率，从而为传染病筛查、治疗开发以及疾病监测提供帮助。基于单分子免疫检测技术，可提高灵敏性，有希望将这些检测项目的窗口期显著缩短。在针对SARS-Cov-2的检测中[17]，利用单分子检测技术将血液中N蛋白的检测灵敏度提高至RT-PCR的检测水平（1zmol/L），可作为核酸检测的有效补充手段，对于感染的早期诊断及病情进展监测具有重要意义。
3. 炎症感染：单分子免疫技术能够检测到早期感染者血清中含量很低的降钙素原，从而能够提早进行针对性治疗。PCT是目前临床上比较常用的用于感染炎症诊断的重要标志物。然后目前临床的一些免疫诊断方法，例如电化学发光，仅能实现20pg/mL的检测灵敏度下限，远未达到正常人的PCT浓度基线水平。Carcamo[18]等人通过单分子免疫检测技术，将检测灵敏度提高至1pg/mL水平，可以准确检测出正常人血清和脑脊液中的PCT含量，并对感染早期PCT的细微提升做出精确反应。
艰难梭菌是一种革兰氏阳性菌，厌氧，可引起严重肠道感染，可能危及生命。临床金标准上，通常通过艰难梭菌分离培养实现精确诊断。然而受限于培养周期长，室间培养条件区别大，难以形成统一标准，并广泛应用。传统免疫检测方法通过测量艰难梭菌毒素进行诊断，具有较高的准确性。然而受限于检测灵敏度水平，难以对早期感染者进行有效检测。因此需要一种高灵敏度、快速、简单的免疫检测方法对艰难梭菌感染进行有效诊断。Pollock[19]等人利用单分子免疫诊断技术平台，对艰难梭菌感染者粪便样本中艰难梭菌毒素的含量进行测定。单分子免疫技术相比血液筛查，能够更高效地对细菌感染毒素进行检测。
4. 眼科：眼科疾病，特别是眼底病变的诊断[20]，目前主要依赖于眼科成像设备以及医生根据成像结果给出的经验判断，缺少一系列基于疾病标志物精准的定量诊断手段。受限于采样难度及采样量，能够用于标志物检测的眼科样本主要有泪液、房水、玻璃体等，该类样本的采样量在几微升到几十微升之间，而疾病相关的标志物蛋白则有十数种，传统方法显然无法覆盖该类样本的检测需求。因此，灵敏度极高的单分子免疫检测手段能够从降低样品需求量的角度，独占性地满足眼科疾病诊断的特殊需求。
图3. 苏州宇测生物科技有限公司开发的全自动单分子免疫检测产品线
四、国产单分子发展现状与展望
单分子免疫检测技术由于比化学发光技术灵敏度高1000倍，被认为是未来免疫检测技术发展的主流方向。单分子免疫检测技术具有较高的开发壁垒，全球范围内能真正将单分子免疫检测技术产业化的案例并不多。目前国内单分子免疫检测技术起步晚，尚处于起步阶段，但极大程度受益于近十年来国内化学发光技术的快速发展，全自动免疫检测系统从原材料到关键部件到功能结构的开发都已处于相对成熟状态，国内已经可以看到一些企业进行相关技术的开发和转化，并已初具规模。例如苏州宇测生物科技有限公司开发的科研级全自动单分子免疫检测系统Sc-Ulti、Sc-Lite与临床级全自动单分子免疫检测系统Dx-90。单分子免疫检测系统由于使用的技术路径通常与传统免疫检测技术完全不同，因此配套的试剂盒天然具备全封闭特性。单分子免疫检测技术在市场的推广既依赖于检测设备的自动化水平、用户体验和使用成本，也需要足够大的单分子免疫检测试剂盒清单支持，国内企业尚需努力。
参考文献
[1]Kahn CR, Roth J. Berson, Yalow and the JCI: the agony and the ecstasy. J Clin Invest, 2004, 114(8): 1051-1054.
[2]林影, 叶茂, 韩双艳, 等. 免疫检测技术的研究进展. 食品与生物技术学报, 2007, 26(4); 117-120.
[3]Nichols JH. Quality in point-of-care testing. Expert Rev Mol Diagn, 2003, 3(5): 563-72
[4]Srinivas P R, Kramer B S, Srivastava S. Trends in biomarker research for cancer detection. The Lancet Oncology, 2001, 2(11): 698-704.
[5]Rotman B. Measurement of activity of single molecules of beta-D-gal-actosidase. Proc Natl Acad Sci USA, 1961, 47: 1981-1991.
[6]Rissin D M, Kan C W, Campbell T G. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nature Biotechnology, 2010, 28(6): 595-599.
[7]Pohl D W, Denk W, Lanz M. Optical stethoscopy image recording with resolution lambda/20. Applied Physics Letters, 1984, 44(1): 651-653.
[8]Binning G, Rohrer H, Gerber C, et al. Surface studies by scanning tunneling microscopy. Physical Review Letters, 1982, 49(1): 57-61.
[9]Betzig E, Chichester R J. Single molecules observed by near-field scanning optical microscopy. Science, 1993, 262(5138): 1422-1425.
[10]Funatsu T, Harada Y, Tokunaga M, et al. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution. Nature, 1995, 374(6522): 555-559.
[11]Toru K, WeiJia C, Gabriela S, Schlau C. Single molecule fluorescence spectroscopy of photosynthetic systems. Chemical Review, 2017, 117 (2): 860-898.
[12]Rainer Heintzmann, Paul Munroe,Quentin S. Hanley,et al. Resolution enhancement by subtraction of confocal signals taken at different pinhole sizes.Micron: The international research & review journal for microscopy, 2003, 34(6).
[13]Wilson D H, Rissin D M, Kan C W, et al. The simoa HD-1 analyzer: A novel fully automated digital immunoassay analyzer with single-molecule sensitivity and multiplexing. Journal of Laboratory Automation, 2016, 21(4): 533-547.
[14]Cohen L and Walt DR. Single-molecule array for protein and nuclei acid analysis. Annu Rev Anal Chem(Palo Alto Calif), 2017, 10(1): 345-363.
[15]Preische, Oliver, et al. Serum neurofilament dynamics predicts neurodegeneration and clinical progression in presymptomatic Alzheimer’s disease. Nature Medicine. 25. 2(2019): 277.
[16]Disanto G, Barro C, Benkert P, et al. Serum Neurofilament light: a biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 2017,81:857-870.
[17]Ogata A F, Maley A M, Wu C, et al. Ultra-sensitive serial profiling of SARS-CoV-2 antigens and antibodies in plasma to understand disease progression in COVID-19 patients with severe disease. Clinical Chemistry, 2020, 66(12): 1562-1572.
[18]Carcamo Yañez, et al. Development and Validation of an Ultrasensitive Procalcitonin Sandwich Immunoassay. High-Throughput, 2017, 6(4), 18.
[19]Pollock NR. Ultrasensitive Detection and Quantification of Toxins for Optimized Diagnosis of Clostridium difficile Infection. J Clin Microbiol, 2016, 54(2): 259-64.
[20]Jens C Gopfert, Astrid Reiser, Viviana A Carcamo Yanez, et al. Development and evaluation of an ultrasensitive free VEGF-A immunoassay for analysis of human aqueous humor[J]. Bioanalysis, 2019, 11(9), 875-886.
作者单位：苏州市，苏州宇测生物科技有限公司（官志超，李力，从瑛哥）
通讯作者：苏州市，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所（董文飞）
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