POCT检测技术核心抗原和抗体原料研发技术难点与解决方案

作者:杨嘉慧 张杰 谢良志
作者单位:北京义翘神州科技股份有限公司 2021-12-16

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杨嘉慧美国塔夫茨大学分子生物学和遗传学专业博士,博士期间主要从事针对神经退行性疾病的分子机理研究,共有3篇SCI文献发表于国外核心杂志。现为北京义翘神州科技股份有限公司研发总监,负责重组表达和抗体开发平台建立,产品研发工作。

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谢良志博士,北京义翘神州科技股份有限公司董事长,北京神州细胞生物技术集团股份公司董事长、总经理,教授级高级工程师,国际知名生物药研发和产业化专家,博士毕业于美国麻省理工学院生物化工专业。曾首创化学计量控制的动物细胞高密度流加工艺技术,奠定了全球抗体和蛋白药物产业化的基础。是“国家特聘专家”、国家“新药创制”重大专项总体组专家,承担多项国家级重大专项课题。发表SCI论文30多篇,申请发明专利数十项。

体外诊断是在人体之外,检测机体血液、尿液、组织等样本,在临床实践中扮演着重要的角色,广泛应用于疾病发现、疾病监控,提供预测和预后的治疗效果[1]。体外诊断通过筛选合适治疗方式,有效的提升患者治愈效果[2]。此外,体外诊断可用于评估发生某种疾病的风险,有助于指导潜在患者提前开展针对特定疾病的预防措施[1]。对于一些疾病,医护工作者和患者需要在短时间内,通过简单的操作方式开展体外诊断检测,快速获得检测结果,这一需求大大促进了即时检验(point-of-care testing,POCT)的发展和技术进步[2]。这与在实验室环境下进行体外诊断检测不同,POCT可实现在采样原地进行检测的工作,通常不需要专业的临床检验师操作,一般在2个小时内完成检测。

POCT行业产业链主要由上游原材料,中游诊断试剂和仪器厂家以及下游需求市场组成。其中,上游原材料,特别是生物原材料,开发技术较复杂,研发周期较长,原料质量决定诊断试剂的有效性,是诊断试剂的核心组成。因此,本文将针对生物原材料,主要是抗原和抗体的开发技术特点,不同技术间的差异和如何解决研发过程中的技术问题等方面进行讨论和分析。

一、抗原重组表达技术的发展

抗原作为体外诊断试剂核心原料之一,可以作为诊断试剂中的标准品,质控品和校准品,同时还可作为免疫原用于制备抗体,因此对于免疫检测有着重要的作用。抗原获得主要来源于两种方法,天然提取和重组表达(表1)。天然抗原从天然机体样本中提取获得,较大程度的保留抗原的原始翻译后修饰和结构,在一些情况下,因为提取物包含了多种抗原物质,使用天然提取物的灵敏度优于重组抗原[3]。但是,不同天然抗原在天然样本中的表达丰度差异较大,纯化难度高,难以保证批次间质量的稳定性[4],因此天然提取的方法较适合于高丰度且稳定性较高的抗原品种。例如:过敏原检测中使用的天然提取物用于血清检测,有文献报道不同厂家的天然提取物差异较大,检测数据不能相互比较[5]

表1. 天然提取抗原和重组表达抗原对比

天然抗原

重组抗原

天然样本提取,来源有限

重组表达技术,易放大

批次间差异

批次质量可控

纯化分离工艺难度大

可添加蛋白标签,辅助纯化,提升抗原纯度

原始抗原序列

可改造和组合多个不同抗原的优势表位序列,提高检测覆盖率

存在生物安全性问题

可实现无动物源

天然活性

需优化工艺实现与天然抗原活性相当

重组抗原利用重组表达技术,在原核-大肠杆菌、酵母、昆虫-杆状病毒、哺乳动物细胞等表达系统中实现目标蛋白的表达。与天然提取技术相比较,重组表达技术在以下几个方面有明显的优势(表1):重组表达抗原可通过提高细胞培养体积,获得大量抗原,不受样本条件的限制;重组表达抗原往往会携带一个蛋白标签,有效的辅助下游纯化流程,获得高纯度的蛋白,此外,蛋白标签还具有提高抗原稳定性,促进抗原在表达系统内的可溶性等功能;重组表达技术可根据检测需求,组合优势抗原序列或者序列定点改造,提高抗原的表位覆盖度和稳定性。不能忽视的是,重组表达的抗原因为在工程细胞中完成翻译,翻译后修饰、折叠、分泌等环节,与天然抗原相比,会存在结构或者活性不一致的情况。因此,重组抗原需要严格与天然抗原进行质量比对,通过工艺优化尽可能接近天然抗原状态。随着重组表达技术的不断更新和成熟,对抗原分子的性能和原理理解,大多数符合诊断试剂应用的抗原物质可以通过重组表达技术获得。

常见的几种重组表达系统在表达周期,配套实验试剂成本,目的抗原细胞内后翻译修饰等方面存在差异(表2),需针对不同的应用需求和抗原特点选择合适的表达系统。

表2. 常见重组表达系统特点

表达系统

原核-大肠杆菌

酵母

昆虫-杆状病毒

哺乳动物细胞

(HEK293细胞)

细胞增殖周期

+

++

+++

++++

实验成本

流程复杂性

简单

较简单

复杂

较复杂

翻译后修饰

有,高甘露糖修饰

有,缺乏复杂糖修饰

人源细胞修饰

适合表达抗原类型

低分子量/片段

多种

多种

分泌和胞外片段

1. 原核大肠杆菌表达系统:原核大肠杆菌作为表达外源基因的宿主细胞,其优势表现在多个方面。该表达系统的分子生物学等方面的机理已经被研究的比较透彻,被很多实验室使用,用于重组抗原研发;实验成本低,操作相对简单,市场上有很多成熟的配套表达体系供选择等[6]。但是因为缺少翻译后修饰和辅助外源抗原正确折叠的组件,一些抗原在使用大肠杆菌系统时出现包涵体,抗原聚集等问题,限制了原核大肠杆菌用于表达复杂抗原的应用。近30年来,有很多的实验进展和优化方案针对解决大肠杆菌表达重组抗原可溶性的问题,包括:降低表达温度[7],添加促溶蛋白标签,共表达分子伴侣[8],以及在纯化过程中添加一定的促溶剂提升抗原的稳定性等方法。同时,为了解决原核大肠杆菌系统缺少糖基化修饰的不足,很多实验通过菌株改造的方式,促使大肠杆菌表达寡糖转移酶,从而具备接近哺乳动物细胞的糖基化修饰能力[9]

还有一些新的尝试在原核大肠杆菌中进行,包括利用基因改造技术,如CRISPR-Cas9,将1个或者多个目的基因改造至大肠杆菌基因组中,通过筛选获得高表达菌株,无需在后续培养过程中添加抗生素[10]。实验利用CRISPR-Cas9技术,将弓形虫SAG2和GRA2组合抗原基因导入到大肠杆菌基因组中,产生的复合抗原可以识别血液样本中存在的弓形虫抗体。

2. 酵母表达系统:酵母,相比较大肠杆菌系统,属于真核表达系统,可进行蛋白翻译后修饰,酵母系统同样具备生长快,成本可控等优点,也被广泛用于诊断用抗原开发[11, 12]。酿酒酵母和毕氏酵母是两种常见的用于重组抗原表达的酵母,其中毕氏酵母被认为有更高的重组表达蛋白产量[13]。酵母系统具备蛋白翻译后修饰的能力,但是酵母系统的糖修饰类型与人源细胞的糖修饰有明显的差异[14],因此大量的工作集中在菌株改造,获得能产生接近人源细胞糖修饰的酵母。

3. 昆虫-杆状病毒表达系统:昆虫-杆状病毒表达系统是另一种常见的真核表达系统,利用杆状病毒作为目的基因的载体,侵染昆虫细胞,实现目的基因在细胞内的表达[15]。常用于重组表达的昆虫细胞包括:sf9和BTI-TN-5B1-4(商用名称High FiveTM),在多个抗原蛋白的表达实验中,BTI-TN-5B1-4比sf9细胞有一定的表达产量优势(内部数据)[16]。病毒类抗原[17, 18],和自身免疫性疾病抗原[19-22],多使用昆虫表达系统进行重组表达。昆虫-杆状病毒表达系统需要病毒包装后的杆状病毒作为表达载体,流程相对复杂,周期也相应延长,另外也有报道显示杆状病毒侵染细胞的过程对于分泌类蛋白的表达有负面的影响[23],因此有越来越多的研究关注于质粒转染昆虫细胞的方法[24]。实验通过改造表达质粒关键组件,筛选最佳表达时间和培养体系,获得与哺乳动物细胞相同产量的重组蛋白[18]

4. 哺乳动物细胞表达系统:哺乳动物细胞表达系统,常见的表达系统包括CHO和HEK293细胞,有完善的翻译后修饰和辅助蛋白折叠体系,有助于获得接近天然构象的抗原。奇昆古尼亚病毒(CHIKV)的E2抗原分别用原核-大肠杆菌和HEK293细胞表达,两种抗原均可以检测到样本中的IgM抗体,但是HEK293表达的抗原在检测灵敏度和特异性上都高于原核表达的E2抗原[25]。但相比较其他表达系统,外源基因在哺乳动物细胞中的表达量较低,增加了研发和生产成本[26]。因此,哺乳动物细胞表达系统主要的优化方向集中在提高表达量,通过表达载体改造,细胞改造和实验方案条件的组合,HEK293细胞瞬时转染可以实现1g/L重组抗体表达产量[27]。通过敲除HEK293细胞中促进凋亡的Bax和Bak基因,敲除的细胞株可与更好的适应反应器的培养条件,延长种子细胞的培养时间[28]

二、重组抗原研发难点和解决方案

抗原的重组表达需要将携带目的抗原基因的表达载体利用表达系统对应的转染方式(转染试剂,病毒侵染等)转入到表达系统(细胞)中,转染后细胞在培养基中完成目标基因在体内表达,经过粗纯(捕获),精纯等步骤获得高纯度重组抗原。常见的重组抗原/蛋白表达问题包括,表达量低,无表达,抗原在表达过程中不稳定,出现降解,聚集等情况。

原核-大肠杆菌在表达一些含有稀有密码子的外源基因序列时,易出现表达量低甚至抗原无表达的情况。鸡贫血病毒VP1抗原的N端序列是富含稀有密码子的功能性区段,在原核表达系统中不能成功表达全长VP1抗原,但是N端的序列属于有功能的区域,因此通过密码子优化的方式,可以实现抗原表达[29]

抗原降解会降低抗原纯度,可以利用纯化的手段去除降解片段,但会影响抗原量的产量。抗原在宿主细胞表达和纯化的过程中发生的降解,可能是由宿主细胞内的蛋白酶造成的。如果降解发生在表达,即培养环节,尝试降低表达温度,缩短表达时间的方法,有助于减少抗原降解;如果降解发生在纯化过程中,在纯化样品中添加一定的蛋白酶抑制剂,抑制降解的进一步发生。

抗原聚集由多种因素造成,结合不同的原因使用相应的优化条件解决。如果表达抗原的序列中存在连续的疏水性序列,往往会造成抗原表达后聚集,如果该段疏水序列不属于诊断检测中重要的序列表位,可以在表达序列中不包含该段序列或者位点突变一些疏水氨基酸;对于二硫键错配造成的聚集,可以适当在实验过程中添加一定量的还原剂;此外,培养基中添加防聚集物质,细胞裂解和纯化过程中,选择温和条件和适合的缓冲体系,缓解聚集;如果聚集情况不能完全解决,可以通过下游的纯化方法进一步去除聚集体的部分。

三、抗体研发技术的发展

抗体,诊断试剂另一种核心生物原料,是一种能特异性结合抗原的糖蛋白。目前在诊断领域,主要应用的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体,两种类型的抗体在特定检测品种中有各自的优势和特点。多克隆抗体识别同一抗原的多个表位,在一些表位被破坏,遮蔽以及抗原表达量低的情况下,也不会影响检测的结果[30]。在免疫组化诊断西尼罗病毒感染器官组织的实验中,多克隆抗体在检测灵敏度上明显优于单克隆抗体(灵敏度:100%对应72%)[31]。此外。多克隆抗体开发周期短、成本低,与单克隆抗体制备相比较,不需要特殊操作技能,也常应用于诊断抗体开发[32]。但是需要关注的是,多克隆抗体生产重复性较差,存在批次间差异。单克隆抗体,来源于单一B淋巴细胞克隆,特异性高,生产工艺恒定的情况下,每批次生产获得的是完全一致的抗体,保证了后续检测的可重复性。但是对于单一表位破坏的情况下,会有不能检出的风险。自1975年杂交瘤单克隆抗体技术的发现,越来越多的单克隆抗体被广泛应用到诊断,治疗,科研等多个领域[33]

从筛选到合格的抗体到应用组装成诊断试剂,还需要多种实验的验证,包括:检测覆盖度[34],抗体配对,能否区分正常与阳性样本等。在通过杂交瘤克隆筛选后,获得8株高特异性和满足多种检测的抗体用于后续的实验,初步通过抗体组合找到高灵敏度,覆盖率好的抗体对,进行后续样品扩大,工艺优化等方面的实验[35, 36]

因为多克隆抗体开发的流程相对单一,分离免疫后动物血清,一般经过一步纯化的方法即可获得多克隆抗体。因此本文仅针对常见的单克隆抗体的研发技术分析比较和讨论。杂交瘤(1975年)、抗体噬菌体文库(1990年)、单个B细胞抗体序列克隆(1996年)是常见的几种单克隆抗体开发技术(表3)[37]

表3. 单克隆抗体开发技术特点

技术平台

杂交瘤

抗体文库-噬菌体

单B细胞克隆

抗体重轻链天然配对

开发周期(免疫后)

3-4周

4-5周

1-2周

直接获得抗体序列

全长/片段抗体

全长

片段

全长

免疫流程

必需

非必需

非必需

抗体生产起始材料

杂交瘤细胞(不稳定)

抗体序列(稳定)

抗体序列(稳定)

人力投入

杂交瘤技术是将动物免疫后B细胞(脾细胞)与骨髓瘤细胞(sp20细胞)融合形成杂交瘤细胞,通过筛选获得杂交瘤细胞能分泌与抗原结合的抗体,因此杂交瘤细胞分泌的全长抗体具有天然抗体的重轻链配对[38]。杂交瘤技术应用广泛,容易掌握,但存在明显的技术劣势,细胞融合效率低,筛选周期长,为了获得单克隆杂交瘤细胞,需要经过多轮的有限稀释,人工投入大。常用的细胞融合是通过PEG试剂,效率较低,为了提升融合效率,实验人员尝试电融合技术,细胞融合效率有明显的提升,特别是针对不同种属来源的B细胞和骨髓瘤细胞的融合实验[39]。近年来一些单细胞分选的仪器逐步解决人工投入较大的单克隆化环节,流式分选仪是比较常见的实验仪器,通过荧光标记的抗原,分选出表达与抗原特异性结合抗体的杂交瘤细胞,大大减少人力投入[40]。杂交瘤因为长期储存,有序列突变,染色体丢失等情况出现,通过抗体基因克隆的方法,获取杂交瘤抗体序列,避免杂交瘤细胞丢失造成的核心抗体不能生产的风险[41]

抗体噬菌体文库技术和单B细胞抗体克隆技术均可直接获得抗体序列。噬菌体文库技术从外周血或者脾脏,淋巴结,骨髓等组织中分离提取B细胞mRNA,通过分子生物学技术获得抗体可变区片段,建立抗体文库,因此不保留天然抗体重轻链原始配对。一般情况,无论是免疫文库还是天然文库,文库的库容在109-1011,通过后续淘洗过程可以获得结合抗原的阳性抗体序列[42]。因为原核大肠杆菌转染效率的限制,即使优化实验或者多轮电转也比较难获得库容超过1011的抗体库[43]。淘洗实验的过程需要高质量的抗原作为阳性克隆筛选原材料,对于一些难以获得抗原或者正确结构抗原的情况,可以选择细胞作为筛选物[44]。噬菌体文库的另一个优势在于,不需要重复免疫和建库,同一个抗体库,一般多指天然文库,可以筛选分别识别不同抗原的抗体。

单B细胞抗体克隆技术是基于单细胞分选和抗体序列提取两个实验环节。在完成动物免疫后,使用单细胞分离仪器可选择分离抗原特异性单个B细胞,或者随机分离单个B细胞样品,经过细胞裂解,基因提取等分子生物学手段直接获得抗体序列[45]。常用的单细胞分选的仪器和技术包括:流式分选仪(FACS),微流控技术,磁珠细胞分选(MACS),激光捕获显微切割(LCM)等,流式分选仪是使用率较高的技术手段[46, 47]。近年来更多的新技术应用于抗体发现,基于光电定位和纳流技术的仪器,用于单B细胞分离,并在原位纳升级小室中完成多种抗原抗体检测,筛选出阳性克隆,用于后续抗体序列提取[48, 49]。为了提高后续的阳性克隆比例,通过体外B细胞短期培养的方法,检测培养上清,筛选出候选克隆,再进行后续的抗体基因提取[50]。免疫后整个试验周期可以控制在1-2周内,进一步缩短了抗体研发周期。但是该技术往往依赖价格昂贵的实验仪器,在常规实验室中推广还需要一定的时间。

四、小结

抗原和抗体是诊断试剂的核心组成,多种成熟的平台技术有效地支持这两种核心原料的研发。重组表达技术和抗体发现技术经过多年的验证,有大量的文献和经验积累。但是具体到某个特定的抗原或者抗体,需要结合具体的POCT应用,分子的基础特性,开发周期需求等方面制定合适的研发方案。同时,也需要持续关注新的相关技术,比如:无细胞体系[51]。无细胞表达体系在几个小时内完成全部重组表达流程,一般情况,产量高于细胞表达,大幅缩短抗原开发流程,对于紧急需求的POCT项目,有明显的优势。目前可以实现抗原表达,后续的研发方向在于重组全长抗体表达和规模化放大生产等方面。此外,纳米抗体等其他新型抗体,在抗体稳定性上,特殊表位识别上,生产成本等方面与常规抗体有一定的区别和优势,也期待在诊断领域中有进一步的使用可能[52]

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作者单位:北京义翘神州科技股份有限公司,单克隆抗体上游研发技术北京市重点实验室

通讯作者:谢良志,Email:liangzhi_xie@sinobiological.com