抗生素耐药时代的新策略：噬菌体疗法
刘素玲，硕士，副主任技师，广东省人民医院检验科微生物室组长。广东省微生物与免疫协会常务委员、广东省医院感染质量控制中心专家组成员、中国老年感控分会-病原学监控学委会委员。主要从事感染性疾病诊断相关工作，擅长疑难菌鉴定，泛耐药菌分子流行病学及耐药机制研究、主持并参与课题 3项，在国内外发表论文20多篇。
顾兵，医学博士、教授、博士生导师。现任广东省人民医院检验科主任、学科带头人。兼任中华医学会检验分会青委会副主任委员、中国医学装备协会检验医学分会副会长。 主要从事重大传染病快速检测新技术与耐药菌感染防控研究，主持国家自然科学基金4项、省部级课题8项；参与国家科技部重点研发计划1项。一作/通迅作者发表SCI论文87篇，编写学术专著与教材35部，获授权专利5项；获江苏省科学技术奖二等奖1项、三等奖1项、新技术引进奖6项。
文丨刘素玲 赵云虎 张鑫强 顾兵
【摘要】抗生素耐药性流行率的增加是全世界关注的一个主要问题。据世界卫生组织（WHO）称，它是“全球十大公共卫生威胁之一”。越来越多的感染正变得越来越难以或无抗生素治疗，且发病率高、死亡率高和增加医疗支出。噬菌体（感染和杀死细菌的病毒）的治疗性使用非常适合作为对抗抗生素耐药性的多维策略的一部分。随着抗生素耐药性的增加，噬菌体疗法重新走入临床及科研中。本文总结了噬菌体疗法的发展过程及其在现代医疗中的作用，传统噬菌体疗法以及创新方法，包括噬菌体-抗生素组合，噬菌体衍生物，噬菌体抗性利用和噬菌体生物工程。
【关键词】抗菌素耐药性，噬菌体治疗，噬菌体
近些年来，泛耐药菌和多重耐药菌的检出率不断上升，针对一线抗生素的耐药率逐渐升高。特别是随着超级耐药菌的出现，抗感染治疗面临无药可用的局面。细菌耐药性的快速流行已成为一个亟待解决的全球性卫生问题。到2050年，每年将有1000万人因抗微生物药物耐药性而丧生，给世界经济造成的损失相当于100万亿美元。它是对全球健康的重大威胁，能够影响所有人，无论其年龄、社会经济地位。抗菌素耐药性的负担可以通过发病率和死亡率以及财务成本来衡量，但即使这些指标的组合也无法涵盖其严重程度。任何解决抗菌素耐药性问题的策略都必须是多维、多学科和全球性的。耐药菌感染治疗、防控等领域亟需新技术和新策略。
噬菌体是一种可以感染细菌、真菌等微生物的病毒，噬菌体广泛存在于自然环境，土壤、海洋、污水中，数量庞大、种类繁多，是地球上最丰富和最普遍的生物，自然界中噬菌体的数量达到1031，是细菌数量的10倍[1]，两者协同进化，共同推动了微生物群落的进化，维持了微生物的多样性[2]。噬菌体约在100年前被发现，并被用于治疗感染性疾病[3]，抗生素青霉素的发现和使用让噬菌体一度被冷落。但随着MDR、XDR、PDR[4]的增多，噬菌体又重新回到我们的视野。噬菌体疗法现在正在经历由抗生素耐药性危机推动的复兴。
噬菌体根据生活周期的不同可分为溶菌型噬菌体（烈性噬菌体），以及溶原型噬菌体（温和噬菌体）。烈性噬菌体是细菌的天然捕食者，能够在细菌细胞内快速完成自身基因组的复制和蛋白外壳的表达装配，通过大量复制子代噬菌体裂解宿主细菌，并进一步感染其他相邻的宿主菌，具备杀菌效率高、易于分离获取、不受抗生素耐药性影响，因而成为了解决耐药菌问题的重要新技术，受到越来越多科学家的关注[5]。2017年，美国科学家基于噬菌体治疗技术，将9株噬菌体进行组合制剂，用于治疗一名感染了多重耐药鲍曼不动杆菌的危重病人，使该病人完全康复[6]。该案例充分证明一些噬菌体在体内可以具有较强的生物学活性和良好的生物安全性，与细菌相互作用进而杀死耐药菌，体现了噬菌体在耐药菌治疗领域的巨大潜力。大多数与人类病原体相关的裂解噬菌体属于尾病毒目和微病毒科，并具有双链或单链DNA基因组[7]。但烈性噬菌体作为直接杀菌剂，仍然会在杀菌的过程中对菌群施加选择压力，导致噬菌体耐受突变被筛选出来，形成噬菌体耐受株。耐受株的出现往往非常迅速，实验室条件下，噬菌体铺板试验后1-2天内即可在噬菌斑内重新长出新的菌落。这些噬菌体耐药菌的形成严重抑制了噬菌体疗法的杀菌效果，造成噬菌体耐受。
溶原型噬菌体（温和的噬菌体）丰富且更容易分离，溶原型噬菌体整合到细菌宿主的基因组中并处于休眠状态。溶原型噬菌体的受体可能位于革兰氏阳性或阴性细胞壁上，也可能位于多糖荚膜上，甚至位于菌毛和鞭毛等附属物上[8]。噬菌体和细菌受体之间的锁匙关系将通常确定病毒能够感染的宿主范围。吸附后，病毒会将其遗传物质喷射到宿主体内。为了利用这些溶原型噬菌，Amany M.等利用已知的压力源来唤醒这些休眠的整合噬菌体。温和噬菌体HK97与亚抑制浓度的抗生素环丙沙星联合给药在体外根除细菌[9]。但温和或溶原性噬菌体进行噬菌体治疗，不仅因为它们的杀伤能力受到同种免疫迅速出现的阻碍，而且还因为溶源性转化可能产生的有害后果。通过溶原性转化，细菌可以获得新的、通常是致病性的遗传特征，例如能够大大增强其毒力的噬菌体编码的毒素，甚至可能是抗生素耐药性决定因素[10]。
噬菌体疗法分为传统噬菌体疗法和新兴噬菌体疗法，传统噬菌体疗法即在细菌感染过程中，仅将噬菌体作为治疗药物应用于患者被称为传统噬菌体治疗，分为单噬菌体和多噬菌体治疗[11]。新兴噬菌体疗法包括噬菌体-抗生素协同疗法、噬菌体衍生物的利用、噬菌体抗性的利用以及噬菌体与生物工程结合等。
将噬菌体和抗生素结合起来作为针对MDR感染的治疗也取得成功。噬菌体-抗生素协同作用（PAS）首先由Comeau等人发现抗生素亚致死浓度可大大增加裂解噬菌体自身产量的能力[12]，PAS的这种传统概念可以大大扩展，因为已经发现了噬菌体和抗生素之间发生协同作用的其他机制。当噬菌体和抗生素结合时，可能会产生"有序"效应，从而在抗生素之前用噬菌体治疗可以达到最大杀灭效果，优化联合治疗的给药时间增强其疗效[13, 14]。抗生素和噬菌体的联合疗法可以很好地对抗复杂的感染。这种联合疗法治疗疾病源于“两种足够不同的选择压力可能比单独使用任何一种压力更有效”[15]。将噬菌体和抗生素结合起来作为针对MDR感染的治疗策略是可行的。
噬菌体在感染细菌时产生许多蛋白质和酶，其中包括相关肽聚糖水解酶和多糖解聚酶[16]。肽聚糖水解酶是噬菌体的结构组分，可局部降解肽聚糖层，其他主要蛋白质是噬菌体编码的解聚酶，其靶向细菌细胞包膜的多糖成分，例如细菌荚膜，革兰氏阴性脂多糖或生物膜的细胞外基质。噬菌体解聚酶活性通过降解结构多糖组分来促进进入位于细胞壁的次级宿主受体，并且可能对生物膜的降解具有更广泛的作用[17]。使用噬菌体衍生的解聚酶来靶向和去除细菌荚膜和生物膜结构是一种可行的治疗选择。贝迪等人[18]采用单噬菌体疗法和阿莫西林根除肺炎克雷伯菌生物膜，归因于噬菌体编码的解聚酶分解生物膜的细胞外基质，从而可以更好地渗透抗生素和噬菌体。Mushtaq等人[19]观察到使用噬菌体衍生的解聚酶作用于大肠埃希菌的荚膜，增加巨噬细胞的吞噬作用并防止大鼠模型中的菌血症。另外，内溶素的细胞壁裂解特性使它们具有作为抗菌剂的巨大潜力[20]，主要用于治疗革兰氏阳性菌感染。但如果同时使用使外膜通透性增加的抗生素，例如多粘菌素，氨基糖苷类或螯合剂，如EDTA[21]，内溶素也可用于革兰氏阴性MDR病原体（如鲍曼不动杆菌和铜绿假单菌）的感染。
细菌为了应对噬菌体的压力，遵循Torres-Barceló和Hochberg提出的进化原理[22]（进化具有遗传限制），细菌获得对噬菌体的抗性需要付出代价，例如细菌耐药性的降低等。这个进化权衡原理已经在许多研究中得到证实。噬菌体和细菌的自然进化为我们提供了许多利用细菌获得噬菌体抗性而丢失部分特性的机会，我们使用选定的噬菌体，迫使其细菌产生进化成本，用于抗感染治疗。Gómez和Buckling使用土壤中荧光假单胞菌实验表明，噬菌体抗性的获得降低了细菌的适应性，通过将裂解噬菌体与其相应的细菌宿主共同孵育生长减少了36%[23]，Capparelli等人能够获得具有生长速率降低且包膜多糖产生受损的噬菌体抗性金黄色葡萄球菌突变体[24]和肠道沙门氏菌血清型副伤寒B突变体，它们已经完全失去了毒力，寿命较短[25]。Chan等人证明将噬菌体的选择压力施加到铜绿假单胞菌上，导致细菌选择抗生素敏感性显着增加，噬菌体的受体结合位点是两种多药外排系统的一部分，噬菌体耐药性导致外排泵功能丧失，恢复了抗生素敏感性[26]。研究表明，噬菌体耐药性可以重复和可预测地发生[27]，需要进一步的研究来评估这些进化机制在治疗环境中对关键MDR细菌病原体的广泛适用。
另外，噬菌体的生物工程可以显着增加其治疗潜力，生物学和工程学的原理被结合在一起，设计、创造或修改现有的噬菌体[28]，包括扩大宿主范围，切换宿主向性，外源基因的递送或噬菌体衣壳的修饰。在噬菌体成功治疗的案例中，科研人员将噬菌体进行了人工改造，增强了其杀菌能力，并与其他天然噬菌体组合成为噬菌体“鸡尾酒”，挽救了一名耐药脓肿分枝杆菌感染的危重病人。该案例表明噬菌体改造技术是噬菌体疗法的重要补充，噬菌体改造技术在未来将成为抗耐药菌领域的关键技术。生物工程噬菌体也被用来提高抗生素的特异性和对抗MDR细菌病原体。基因工程可以利用噬菌体介导的基因递送用于治疗目的。可以递送或插入细菌细胞的遗传物质包括用于逆转抗生素耐药性[29]，CRISPR/Cas9序列使毒力基因失活[30]，随着创新方法的不断测试，我们预见到噬菌体生物工程治疗的巨大潜力。
噬菌体疗法可以采用不同的方法，每种方法都有适应范围、感染类型和患者的特征。噬菌体疗法的临床使用多样性和适应性是其最大的优势。尽管噬菌体疗法的广泛使用还具有挑战性，但噬菌体疗法非常适合成为对抗细菌耐药的多维策略的一部分，有着非常广阔的应用前景。
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作者单位：510080广州市，广东省人民医院检验科，广东省医学科学院
