核酸等温扩增技术的应用现状与思考
马学军，博士，研究员，博士研究生导师，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验室主任；中国疾病预防控制中心分子诊断学领军人才；中国医促会常务理事；中国医促会分子诊断学分会主任委员；新冠病毒检测标准国际合作中方专家组成员；2020年作为国内首位援外专家参加中国红十字会和世界卫生组织伊朗考察专家组；2020迪拜世博会防疫保障中方专家；食品安全国家标准审评委员会微生物专业委员会委员；中国食源性微生物检测技术创新战略联盟常务理事；中国体外诊断产业技术创新战略联盟常务理事；传染病诊断试剂产业技术创新联盟专家；中国医药技术协会生物诊断技术分会常务委员；中国医疗器械行业协会现场快速检测（POCT）分会常务委员；中华预防医学会旅行卫生专业委员会常务委员；中华实验和临床病毒学杂志执行主编；多个中英文杂志的编委；获3项省部级科技进步奖；发表英文SCI期刊和中文核心期刊论文200余篇，授权国家发明专利10余项，科技成果转化5项，软件著作权1项；主译“精编分子生物学实验指南”第4版。研究方向：病原体核酸检测新技术平台的研发和应用。
目前, 传统的聚合酶链式反应, 简称PCR技术, 因其灵敏度高、特异性强和稳定性好被认为是病毒核酸检测的首选方法。PCR技术是一个热循环的过程, 包括高温变性、退火和延伸3个环节。通常在35个循环之后, 微量的DNA模板即被特异性地扩增到可以被仪器检测到的数量，但整个扩增检测时间较长，需要核酸扩增仪作为辅助工具, 因此PCR反应始终受到电力、成本以及空间等因素的制约, 难以实现对病原的现场快速检测。
核酸等温扩增是在等温条件下的核酸扩增和检测技术，无需热循环仪，等温仪器体积小，实验操作简单，具有快速、准确和易普及等特点，适用于对检测速度要求极高的海关口岸和技术力量、基础薄弱的县乡级基层医疗机构（如发热门诊等），能在短时间内完成培训，使其具备核酸检测能力[1]。本文拟回顾和评论目前国内外主要的核酸等温扩增技术及其在新型冠状病毒核酸检测中的应用现状，并分析核酸等温扩增技术目前应用存在的不足，展望和思考核酸等温扩增技术未来发展前景，供同行参考和批评指正。
一、目前国内外主要的核酸等温扩增技术简介
国外广泛应用的核酸等温扩增技术包括依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、环介导等温扩增技术（Loop-mediated amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification，RPA）和将上述等温扩增技术与Cas酶结合的新型检测方法如SHERLOCK（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）和DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）等[2]。国内自主研发主要的核酸等温扩增技术包括实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）、重组酶介导扩增技术（recombinase-aid amplification，RAA）[3]和交叉引发扩增技术（Cross-priming amplification，CPA）等。
1. 依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）：NASBA是一种可直接对RNA靶标进行扩增的等温扩增技术。NASBA技术首先利用含有T7启动子的逆转录引物将RNA靶标逆转录为含有T7启动子的cDNA，再通过T7RNA聚合酶对cDNA进行转录扩增得到大量的RNA扩增产物，合成的RNA扩增产物可重新进入逆转录和转录扩增循环。整个循环扩增过程在41℃下进行，但在进入循环扩增反应前需要先在65℃下进行引物退火。NASBA可在1.5～2h内将靶标扩增6～9个数量级，灵敏度能达到单拷贝/反应。NASBA的扩增产物为单链RNA，可用电化学发光法（Electrochemiluminescence，ECL）、酶联凝胶法（Enzyme linked gel assay，ELGA）和分子信标法进行检测，也有与测流层析试纸条结合实现可视化检测的报道。NASBA多用于在实验室环境下检测RNA，虽然也可用于DNA靶标的扩增，但是DNA靶标的预变性过程会使逆转录酶失活，需要重新补加才可以进行后续反应。
2. 环介导等温扩增技术（LAMP）：LAMP是Notomi T等在2000年提出的一种核酸等温扩增技术，整个扩增反应在60～65℃下恒温进行，灵敏度可达10拷贝/反应。LAMP反应中需要一对具有回折结构的内引物和一对用于置换单链产物的外引物。在内外两对引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下生成两端具有环状结构的哑铃型中间产物，在内引物识别中间产物环状区域引发延伸和回折结构3'端自引发延伸的双重作用下扩增得到超长串联双链DNA扩增产物。扩增产物一般采用DNA双链嵌合核酸染料、钙黄绿素等荧光指示剂进行检测。对于RNA靶标，LAMP反应可利用Bst DNA聚合酶的逆转录活性直接进行扩增，也可通过添加禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶对RNA靶标进行逆转录得到cDNA模板后再进行LAMP扩增。
3. 重组酶聚合酶扩增技术（RPA）：RPA方法是基于T4噬菌体DNA复制的机理而发明的, RPA系统包括一种常温下能工作的 DNA聚合酶,噬菌体uvsX重组酶和单链DNA结合酶（gp32），以及另外一个辅助uvsX重组酶的uvsY蛋白。该系统的显著优点在于, 它在常温下就能实现DNA解链并可在15~30min内完成目的DNA的快速扩增，不需要使用贵重的核酸扩增仪。可以在RPA反应体系中加入逆转录酶实现RNA靶标的扩增。
4. 实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）：SAT是一种基于NASBA的RNA实时荧光恒温扩增检测技术（SAT-RNA）。该技术是在NASBA扩增反应的基础上首先用RNA 捕获探针，对病毒RNA进行捕获富集，经过NASBA扩增后采用高分辨率分子信标技术进行扩增产物检测。SAT利用磁珠微粒表面偶联待检病原RNA的特异性捕获片段（探针），特异性地与样本中待检病原的RNA杂交，当捕获探针与RNA结合后，用磁铁吸附磁珠，可获得高纯度的RNA作为待扩增检测的模板。待检病原的RNA在逆转录酶作用下合成一条带T7启动子的双链DNA，T7RNA聚合酶以这条双链DNA为模板进行转录，每个DNA分子可以转录出100-1000个拷贝的RNA，转录出的RNA与特异性荧光标记探针结合发出荧光，被荧光检测仪实时检测到。与此同时，新转录的RNA继续在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下循环逆转录和转录过程，如此往复，实现高效扩增。
5. 重组酶介导扩增技术（RAA）：RAA是基于RPA的一种改良的新型恒温核酸扩增检测技术，RAA与RPA最大不同在于重组酶的来源。RPA使用的是噬菌体T4uvsX重组酶，RAA使用的是从大肠杆菌中获得的重组酶，因为酶的来源不同，RPA和RAA的反应体系不尽相同。RAA可在等温条件下（25~45℃）在15-30min内完成扩增检测，具有操作简单、仪器便携和结果快速等特点。可以在RAA反应体系中加入逆转录酶实现RNA靶标的扩增。结果判读的方式有电泳、荧光和可视化。
6. 交叉引发扩增技术（CPA）：CPA是一种由交叉引物和有链置换活性的DNA聚合酶介导的等温扩增反应[4]。其通过特殊设计的交叉引物和置换引物引发延伸，在靶序列两端引入多对交叉引物识别位点（交叉位点），交叉引物与交叉位点结合延伸形成分枝状的扩增结构，在63℃下反应1h实现指数扩增。针对RNA靶标，可以在CPA反应体系中加入逆转录酶实现RNA靶标的扩增。CPA扩增产物多采用试纸条可视化检测，CPA反应中会投入两条与靶序列互补并分别带有生物素标记和发色基团标记的检测引物，检测引物与靶序列结合延伸，形成带标记的可检测产物，标记产物与试纸条上的配体结合，形成可视化信号，其检测限可达10拷贝/反应[5]。
7. 基于Cas酶的核酸等温扩增技术：等温扩增技术仅对靶标进行高效扩增，还需要指示剂、荧光染料或荧光探针对扩增产物进行识别与报告，识别的特异性往往受到靶标序列及扩增特异性的影响，而造成结果不准确。Cas酶检测系统作为一种高特异性的核酸序列识别与报告方法，与等温扩增技术相结合，可提高检测结果的准确性。基于Cas酶的附属活性，SHERLOCK和DETECTR两种等温检测方法已成功用于新冠病毒核酸检测[6]。SHERLOCK采用逆转录RPA和T7 RNA聚合酶对病原RNA靶标进行扩增，得到大量单链RNA产物，最后利用Cas13a在向导序列的介导下与靶序列结合时被激活的附属活性，对体系中的单链报告探针进行切割产生信号，从而对扩增产物进行特异性检测。DETECTR与SHERLOCK原理类似，不同在于其所使用的Cas酶为Cas12，可识别DNA靶标，只需一步逆转录LAM而无需转录过程即可对靶标进行检测。SHERLOCK和DETECTR的检测灵敏度均可达到10拷贝/μL，并且均可在1h内完成。但是两者都需要在扩增反应结束后开管进行扩增产物的转移，而且试纸条检测时也需要再次开管，这增大了产物污染的风险和操作难度。为了解决这一问题，一种基于Cas12b的检测方法STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）被开发出来。该方法所采用的Cas12b可以在LAMP反应温度（65℃）下保持活性，因此可以无需在扩增结束后开管转移产物，降低了产物污染的风险。并且为了避免试纸条检测时的开管，Joung J等采用了弹夹式试纸条检测管进行结果检测[7]。
二、获得国家药监局批准的主要的核酸等温扩增检测新冠病毒核酸技术
1. SAT-RNA捕获探针法：SAT技术配合AutoSAT全自动核酸分析系统可以实现8h内200个样本的高通量检测，可一次性放置80个样品并实现连续上样。SAT-RNA技术利用RNA捕获探针和分子信标技术在NASBA技术的基础上进一步提高了检测的灵敏度和特异性，结合全自动分析系统简化了操作并且提高了检测通量，但是并未能从原理上克服NASBA技术反应时间长的问题。此外，该技术仍然需要预先对样本进行常规病毒核酸提取，因此，更适合于检疫检验部门在实验室环境下进行高通量的SARS-CoV-2核酸检测。
2. 荧光RT-RAA法：荧光RAA方法可用于检测口咽拭子、鼻咽拭子、鼻拭子、肺泡灌洗液、唾液等样本中的核酸，灵敏度高（注册检报告的灵敏度两批试剂盒可以达到137copies/mL，一批试剂盒达到45copies/mL）。配套自动化核酸提取仪器和提取试剂盒，加入提取的核酸后，在8-15分钟内完成16个样本的检测，1个小时内完成96样品的全流程检测，检测结果可用便携式等温扩增荧光仪器自动判读。操作简便和快速，检测具有灵活性，可实现随到随检，适合在县级乡镇发热门诊和口岸检测机构进行快速筛查[8]。
3. CPA实时荧光法：逆转录CPA实时荧光法使用了一种一体化全自动核酸检测管。这种检测管整合了核酸提取和检测，通过温度改变熔化各种核酸提取试剂和检测反应试剂之间的有机隔层，控制整个提取和检测反应有序进行。CPA扩增产物采用分子信标进行检测，荧光信号由外部荧光检测设备检测。这种全自动检测管适合疫情暴发初期的现场筛查。
4. LAMP芯片法：基于LAMP和离心碟式微流控芯片[9]法用于包括新冠病毒在内的6种呼吸道病原体检测。该芯片上有24个反应单元和引物预载单元环形排列，反应单元之间由连接通道连接。六种病毒对应的引物分别预载在不同的引物预载单元内，进行检测时，经过核酸提取的样本与反应体系的混合液由加样孔加入，并在离心力的作用下均匀分布进入反应单元，芯片在63℃下反应1.5h完成扩增，扩增产物采用钙黄绿素显色法进行检测，配合多芯片反应检测仪器，一次可检测16人份的样品。LAMP芯片法实现了多种呼吸道病原体的鉴别检测，适合于医疗机构对有呼吸道疾病指征的患者进行快速分诊处治。利用肉眼观察颜色变化来判读检测结果，虽然降低了对仪器设备的要求，适合在资源有限和经济不发达地区开展核酸检测，然而主观判断颜色变化存在较大个体差异，钙黄绿素等指示剂不具有靶标序列特异性，因此影响结果的准确性。此外，LAMP芯片法尚需传统的病毒核酸提取步骤，限制了检测速度，不适于现场快速检测。曾有文献报道LAMP反应体系抗干扰能力较强，可对只经过简单裂解的血样[10]或只经过沸水浴处理的拭子样本[11]直接进行扩增检测。如果能开发出直接检测热裂解咽拭子样本的新冠病毒核酸检测方法，将有利于现场快速检测。上述4种等温扩增技术检测新冠病毒核酸的性能比较见表1。
三、核酸等温扩增技术存在的问题
本文介绍的核酸等温扩增技术原理各异，产物检测方法各不相同，因此它们在检测的灵敏度、特异性、所需仪器、检测时间等方面存在差异，需要针对不同的场景和需求选择合适的检测方法。目前的核酸等温扩增技术在扩增检测速度、仪器小型化，试剂成本、可视化判读结果等方面比PCR技术有一定优势，但现场检测难以实现，样品前处理（核酸提取）成为主要制约因素。简单的样本处理法若能与等温扩增技术匹配，才能真正缩短检测周期，发挥出等温扩增快速、灵敏、便捷的特点。其次，如何实现单管闭管条件下的多重或多靶标等温扩增检测，并同时具有高灵敏度和特异性，也是亟待解决的技术难题，否则将限制等温扩增技术的应用范围。此外，虽然有些等温扩增POCT（Point-of-care test）技术实现了样品进、结果出的终极目标，解决了核酸提取和等温扩增多重检测难点，具有现场应用的前景，然而目前的产品通量偏低，成本偏高，时间偏长或灵敏度偏低，从而限制了其应用场景。目前Cas酶系统成为技术热点，但是Cas酶系统只是一种特异性的产物检测方法，Cas酶检测系统本身灵敏度不足，必须结合扩增反应才能实现靶标的检测，另外，Cas酶检测系统对报告探针的切割无选择特异性，实现单管多重检测面临技术挑战。
四、核酸等温扩增技术发展和应用的思考
核酸检测技术的未来发展方向是信息化，小型化，简单化和自动化。核酸等温扩增技术在病原检测中仍不能替代PCR技术，但是弥补了传统PCR检测技术设备依赖和检测周期长的不足，极具发展潜力，使得核酸等温扩增技术在现场快速检测、全自动一体化检测等方面展现出独特的应用前景，是传染性病原体核酸检测技术未来发展的方向。微流控芯片作为一种新型的反应和检测载体，可以与不同的等温扩增反应结合开发出小巧便携的床旁检测或即时检测平台，微流控芯片也可以将多重反应整合在一起，实现多样本或者多靶标同时检测。真正实现核酸等温扩增技术的现场应用，还需要考虑仪器的小型化或无仪器的可视化判读，可接受的检测成本，智慧数据传输（如智能手机）和电池驱动装置等。
新型冠状病毒疫情在全球流行，由于各国防控情况不平衡，新型冠状病毒或将在相当长的一段时间内与人类共存甚至会成为长期存在的一种呼吸道传播病原体。面对严峻的形势，我国新冠疫情防控虽然取得举世瞩目的成绩，有效控制了疫情扩散，但仍面临巨大挑战。外防输入、内防反弹依然是我国疫情防控的常态。外防输入是要守好国门，做好海外输入的新冠检测，将新冠防在国门之外，随着国门在后疫苗期间的逐步开放，外防输入的压力将持续增大。必须尽快提升海关现场快速核酸检测能力，更好减轻防疫人员的压力。在海关实现病原体超快速筛查对核酸检测技术的准确度、灵敏度、通量、全流程检测时间提出了更高的要求。内防反弹的重点工作是提高我国医疗卫生服务网络相对薄弱的广大农村地区的检测水平，补齐短板，这是保持我国新冠肺炎防控胜利成果的关键，必须考量到我国欠发达和广大的农村地区发展不平衡和医疗资源短缺，存在核酸技术仪器设备、技术人员储备严重不足这一因素。核酸等温扩增技术由于其操作简单、检测快速和结果准确的特点是在基层和海关应用的适宜技术。
建议在实际应用层面上可允许采取组合检测方式，如核酸等温扩增技术用于初筛，PCR技术用于复核，可以充分发挥两种技术的优势和特点，满足口岸快速排查，基层发热门诊快速分流的实际需求。同时，鉴于与国外同类技术比较，国内核酸等温扩增技术的原创性和核酸等温扩增新技术产业化方面差距明显，建议设立新技术研发专项，鼓励探索性和原创性研究，重点扶持具有中国自主知识产权的核酸检测新技术的研发和产业化。
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