数字PCR在产前诊断中的应用价值与发展趋势

魏凤香，深圳市龙岗区妇幼保健院副院长、研究员、博士研究生、硕士研究生导师，深圳市海外高层次人才，哈佛大学访问学者，加拿大麦克马斯特大学博士后。分管医院教学科研和信息化等。目前任广东省医学院遗传学会副主任委员、深圳市医学会遗传学会副主任委员、龙岗区医学会会长等职务。在细胞生物学、医学遗传学、分子生物学和肿瘤学等领域从事研究近20年期间，共发表科研论文106篇，其中SCI收录文章40篇，第一作者SCI影响因子达90分；参编教材和论著4部；主持国家自然基金1项，广东省自然基金1项，广东省医学科研基金1项，市级重点课题2项，区重点课题1项。

【摘要】数字PCR技术是一种新颖、灵敏、准确、多元的定量策略，可以在复杂的临床样本中检测出如细胞游离DNA等数量稀少的目标核酸，是传统方法的一种高灵敏度和高准确度的替代方法，特别是在产前诊断领域中，在无创性产前诊断、胎儿非整倍体疾病、单基因疾病、X连锁遗传疾病等诸多方面具有广阔的应用前景。本文就数字PCR的原理、分类、产前诊断领域中的应用及其前景进行综述。

【关键词】数字PCR；产前诊断；微液滴数字PCR

数字聚合酶链反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）是继终点PCR和实时PCR之后的第三代PCR，是一种新型的核酸定量技术[1]，由液滴发生器、PCR热循环仪、液滴读取器等多个独立装置组成[2]。研究表明[3]，它与常规定量PCR技术相比，dPCR不再需要标准稀释曲线和反应效率，具有高灵敏度、高准确度以及绝对定量的优势。不但在遗传疾病、病原检测、致癌基因的分子诊断和法医学鉴定等诸多领域中意义重大[4]，还在如无创产前基因诊断、胎儿非整倍体疾病、单基因疾病、胎儿性别检测等产前诊断领域发挥着重要作用[5]，有望成为胎儿产前基因诊断的重要研究工具。

一、dPCR技术的原理

dPCR从血液、组织细胞或细菌等样本中提取DNA分子混合物后，将样品分散至成百上千万个分区，每个分区构成一个单独的纳米反应器，平均含有零个或一个DNA模板，扩增完成后对所有的液滴进行荧光信号识别并计数，通过泊松分布原理[6]计算靶标分子的浓度[7]。

样品的稀释和分散通常是dPCR的第一步，样品分散是将PCR混合物分成更小的单元进行热循环的过程[8]，其主要分为微液滴样品分散法、微孔板样品分散法、通道型样品分散法和印刷型样品分散法四类[4]。

1. 基于液滴的样品分散方法：基于液滴的样品分散只需要样品流体体积在微升或纳升范围内[9]，就可以通过微乳液在油相中产生大量均匀的液滴，在数千个平行反应中可同时发生[10]。油包水乳液液滴基于t型结几何、流聚焦几何、共流几何的设计产生[4]，最终可根据阳性滴和阴性滴的数量计算出目标核酸。微液滴dPCR（droplet digital PCR，ddPCR）作为一种新的高通量和快速（3小时）的方法[11]，可在复杂的临床样本中检测出数量稀少的目标核酸，其测量结果以接近1:1的比例准确地反映了每个反应中每个分子的绝对含量[12]，具有极高的灵敏度和准确度。

2. 基于孔板的样品分散方法：基于微孔的样品分散在相邻微反应之间存在固体屏障会避免液滴破碎的风险，从而降低了测试结果假阳性的概率[4]。该方法十分省时，只需一步即可分散所有样品产生均匀的隔室。并且，在物理分区和分散速度方面具有明显的优势，将该方法集成到样本中以回答微流控芯片对于实现灵敏、准确的快速检测而言具有巨大的潜力[13]。

3. 基于通道的样品分散方法：基于通道的样品分散在样品装载、分配精度和再现性方面具有明显的优势，研究表明[14]，微流体芯片dPCR（chip digital PCR，cdPCR）即使在低水平嵌合体的情况下，检测非整倍体仍具有较高的敏感性和特异性，为快速、技术简单、经济有效地筛查常见的胎儿非整倍体提供了工具[15]。当母体细胞污染水平较高时，可准确区分污染和胎儿镶嵌。但其功能集成的要求较高，使设计和制造过程十分困难。

4. 基于印刷的样品分散方法：基于打印的dPCR技术指将液滴印刷与dPCR相结合，即油滴阵列首先印刷在亲水-疏水图案化的化学修饰基底上，然后将含有目标核酸和PCR混合物的样品微滴打印到每个油滴中。进行PCR热循环反应，并在反应结束时获取和分析荧光点图像[4]。喷墨打印和接触打印技术在dPCR的发展过程中具有灵活性和高通量能力，具有显著的竞争优势，并即将在dPCR中实现单分子DNA打印具有巨大潜力。

二、dPCR在产前诊断中的应用

1. 无创产前基因诊断：dPCR已被用于识别罕见的基因变异以及与儿科发病疾病相关的多个基因拷贝数的差异中。据报道，脊髓肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常见的常染色体隐性遗传病，是婴儿死亡的第二大常见原因，该疾病由生存运动神经元1基因（SMN1）缺失引起，导致肢体无力、吞咽困难和呼吸异常[16]。目前常用的检测方法是通过绒毛穿刺（孕龄10-12周）或羊水穿刺（孕龄16-18周）的介入性产前诊断的方法来确认胎儿健康状况，但该方法具有一定的流产风险。目前，有研究表明使用dPCR可准确定量SMN1和SMN2拷贝数以及弥补介入性产前诊断方法的缺陷，这对于正确诊断SMA和鉴别携带者是至关重要的[17]，并且，这种快速的分子诊断方法适用于孕前优生检查、产前检测以及新生儿筛查，帮助医生或遗传顾问改善人群SMA发病率。

目前，基于ddPCR检测方法可从母体血浆中提取的未处理的游离DNA中识别胎儿地中海贫血状态[18]。在检测活检的卵裂球样品中的α-珠蛋白和SEA型缺失等位基因中明确报道[19]，该高灵敏度方法可以为体外受精临床机构的α-地中海贫血的常规诊断提供可靠的技术手段，并减少血红蛋白巴特胎儿水肿综合征的发生。

2. 胎儿非整倍体疾病：产前13、18、21、X、Y染色体拷贝数畸变占临床显著染色体畸变的80%以上。目前，可使用通用锁定核酸探针可靠地鉴定胎儿非整倍体[20]，或也通过整倍体和非整倍体样本分布的差异，高精度地确定目标染色体的倍性。使用一种有前景的实验室常规检测方法——基于芯片的dPCR技术进行胎儿非整倍体的准确和快速测定，不仅提供了最短的操作时间，还减少了分析时间、成本效益和提高了绝对定量的精度[15]。

其中，采用dPCR系统无创产前筛查（Non-invasive prenatal screening，NIPS）21三体综合征比采用NGS的相对便宜、所需时间短、成本低，具有广泛的适用性，更为重要的是与核苷酸序列信息获取方面的伦理问题相兼容[21]，该方法有可能成为提高产前诊断准确性和可靠性的基础技术。

3. 单基因疾病：ddPCR是检测母体血浆中胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）的常用工具[22]。cffDNA可在妊娠4周时在母体循环中检测到，游离胎儿DNA水平在5%到20%之间[23]。细胞游离DNA（Cell-free DNA，cfDNA）可以从母体血液样本中提取，cfDNA分析可以在怀孕早期为广泛的单基因疾病提供明确诊断[24]。如在苯丙酮尿（PKU）无创产前诊断方法中[25]，准确定量PKU家系孕妇血浆中cffDNA，计算胎儿DNA在总cfDNA中的浓度，并对胎儿DNA进行基因分型，是一种可靠的无创产前诊断PKU工具，并对cfDNA具有较高敏感性和特异性。

目前，应用ddPCR方法来预测母体遗传性单基因疾病的胎儿基因型。在检测无创胎儿人类血小板抗原（human platelet antigens，HPA）基因分型时被认为是一种安全可靠的方法，可早期诊断胎儿血小板不相容性，并可用于血小板免疫实验室的常规临床检测[26]。对于单基因糖尿病孕妇巨大儿风险管理中，该方法具有潜在的适用性，并且通过非侵入性检测方法，消除了与侵入性羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样相关的流产风险或其他并发症[27]。

4. X连锁遗传疾病：胎儿性别诊断可以通过羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样术等侵入性程序获得，但这些程序有1%的流产风险。目前，无创细胞游离DNA分子分析已成为监测器官移植或检测胎儿DNA的一种敏感生物标志物[28]。可采用SRY基因靶点设计的ddPCR方法分析孕妇血浆中cffDNA来早期诊断（7周前）胎儿性别[29]，对有如杜氏肌营养不良、肾上腺发育不良、血友病等x连锁疾病风险的家庭而言意义重大。

三、在产前诊断应用中dPCR技术的展望

无创产前检测不仅可以调查胎儿的健康状况，同时对胎儿或母亲也没有风险。近年来，孕妇进行对无创产前检测技术越加重视，使用dPCR技术确定所需靶点的母体基因型和基因组DNA的控制单核苷酸多态性具有重要意义。

dPCR相对于qPCR最大的改进是dPCR提供了绝对定量，没有标准曲线，大多数研究表明dPCR对低负荷DNA更敏感[30]。一些证据表明，数字聚合酶链反应用于核酸定量，其应用于低水平病原体的检测和精确定量、罕见基因序列、拷贝数变异的定量、罕见突变和相关基因表达具有广阔的应用前景，但dPCR在常规临床实验室的应用还需要标准化的策略和进一步的研究，需要对不同的dPCR平台进行进一步的评估和合作研究，以确认该系统的诊断适用性。

综上所述，dPCR技术经进入其新兴阶段，已在很大程度上降低了每个样品的成本、减少了检测时间，具有广泛的适用性，具有高灵敏度、高准确度的优势。并且，dPCR的绝对定量、检测单核苷酸多态性基因型和拷贝数变异的能力决定了其在基因组学、遗传学和诊断中的重要性，其意义十分重大，在生命科学领域中具有广阔的应用前景。据预测，随着微纳米加工技术的快速发展以及分区数量的增加，dPCR的检测灵敏度将不断提高，并用于各种生物医学领域。

参考文献

Li, Z., L. Pan, L. Lyu, et al., Diagnostic accuracy of droplet digital PCR analysis of cerebrospinal fluid for tuberculous meningitis in adult patients. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2020. 26(2): p. 213-219.

Jiang, Y., A. Manz, and W. Wu, Fully automatic integrated continuous-flow digital PCR device for absolute DNA quantification. Analytica chimica acta, 2020. 1125: p. 50-56.

Salipante, S. and K. Jerome, Digital PCR-An Emerging Technology with Broad Applications in Microbiology. Clinical chemistry, 2020. 66(1): p. 117-123.

Cao, L., X. Cui, J. Hu, et al., Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors & bioelectronics, 2017. 90: p. 459-474.

Tong, Y., S. Shen, H. Jiang, et al., Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology, 2017. 43(4): p. 1718-1730.

Huggett, J., The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clinical chemistry, 2020. 66(8): p. 1012-1029.

Nectoux, J., Current, Emerging, and Future Applications of Digital PCR in Non-Invasive Prenatal Diagnosis. Molecular diagnosis & therapy, 2018. 22(2): p. 139-148.

Sreejith, K., C. Ooi, J. Jin, et al., Digital polymerase chain reaction technology - recent advances and future perspectives. Lab on a chip, 2018. 18(24): p. 3717-3732.

Park, J., K. Lee, D. Han, et al., Pushbutton-activated microfluidic dropenser for droplet digital PCR. Biosensors & bioelectronics, 2021. 181: p. 113159.

Li, N., P. Dhilipkannah, and F. Jiang, High-Throughput Detection of Multiple miRNAs and Methylated DNA by Droplet Digital PCR. Journal of personalized medicine, 2021. 11(5).

Vynck, M., J. Vandesompele, and O. Thas, On determining the power of digital PCR experiments. Analytical and bioanalytical chemistry, 2018. 410(23): p. 5731-5739.

O'Hara, R., E. Tedone, A. Ludlow, et al., Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome research, 2019. 29(11): p. 1878-1888.

Liao, P. and Y. Huang, Digital PCR: Endless Frontier of 'Divide and Conquer'. Micromachines, 2017. 8(8).

Nykel, A., R. Woźniak, and A. Gach, The Influence of Maternal Cell Contamination on Fetal Aneuploidy Detection Using Chip-based Digital PCR Testing. Diagnostics (basel, Switzerland), 2021. 11(9).

Nykel, A., M. Kaszkowiak, W. Fendler, et al., Chip-based Digital PCR Approach Provides A Sensitive and Cost-Effective Single-Day Screening Tool for Common Fetal Aneuploidies-A Proof of Concept Study. International journal of molecular sciences, 2019. 20(21).

Wang, K., C. Fang, C. Chang, et al., A rapid molecular diagnostic method for spinal muscular atrophy. Journal of neurogenetics, 2021. 35(1): p. 29-32.

Jiang, L., R. Lin, S. Gallagher, et al., Development and validation of a 4-color multiplexing spinal muscular atrophy (SMA) genotyping assay on a novel integrated digital PCR instrument. Scientific reports, 2020. 10(1): p. 19892.

Sawakwongpra, K., K. Tangmansakulchai, W. Ngonsawan, et al., Droplet-based digital PCR for non-invasive prenatal genetic diagnosis of α and β-thalassemia. Biomedical reports, 2021. 15(4): p. 82.

Lee, T., Y. Hsu, and C. Chang, Detection of SEA-type α-thalassemia in embryo biopsies by digital PCR. Taiwanese journal of obstetrics & gynecology, 2017. 56(4): p. 487-494.

Tan, C., X. Chen, F. Wang, et al., A multiplex droplet digital PCR assay for non-invasive prenatal testing of fetal aneuploidies. The Analyst, 2019. 144(7): p. 2239-2247.

Lee, S., S. Kim, S. Han, et al., A new approach of digital PCR system for non-invasive prenatal screening of trisomy 21. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 2018. 476: p. 75-80.

Vodicka, R., J. Bohmova, I. Holuskova, et al., RHDRisk Minimization of Hemolytic Disease of the Fetus and Newborn Using Droplet Digital PCR Method for Accurate Fetal Genotype Assessment of , , and from Cell-Free Fetal DNA of Maternal Plasma. Diagnostics (basel, Switzerland), 2021. 11(5).

Scotchman, E., J. Shaw, B. Paternoster, et al., Non-invasive prenatal diagnosis and screening for monogenic disorders. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology, 2020. 253: p. 320-327.

Breveglieri, G., E. D'Aversa, A. Finotti, et al., Non-invasive Prenatal Testing Using Fetal DNA. Molecular diagnosis & therapy, 2019. 23(2): p. 291-299.

Yan, Y., F. Wang, C. Zhang, et al., evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and bioanalytical chemistry, 2019. 411(27): p. 7115-7126.

Ouzegdouh Mammasse, Y., C. Chenet, D. Drubay, et al., A new efficient tool for non-invasive diagnosis of fetomaternal platelet antigen incompatibility. British journal of haematology, 2020. 190(5): p. 787-798.

Caswell, R., T. Snowsill, J. Houghton, et al., Noninvasive Fetal Genotyping by Droplet Digital PCR to Identify Maternally Inherited Monogenic Diabetes Variants. Clinical chemistry, 2020. 66(7): p. 958-965.

Pedini, P., H. Graiet, L. Laget, et al., Qualitative and quantitative comparison of cell-free DNA and cell-free fetal DNA isolation by four (semi-)automated extraction methods: impact in two clinical applications: chimerism quantification and noninvasive prenatal diagnosis. Journal of translational medicine, 2021. 19(1): p. 15.

D' Aversa, E., G. Breveglieri, P. Pellegatti, et al., Non-invasive fetal sex diagnosis in plasma of early weeks pregnants using droplet digital PCR. Molecular medicine (Cambridge, Mass.), 2018. 24(1): p. 14.

Pomari, E., C. Piubelli, F. Perandin, et al., Digital PCR: a new technology for diagnosis of parasitic infections. Clinical microbiology and infection: the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2019. 25(12): p. 1510-1516.