POCT分子诊断新趋势： 多重PCR试纸层析检测新技术

基于核酸扩增（PCR）的分子诊断技术是通过引物介导特异性扩增目的基因，以检测内源性（遗传或变异）或外源性（病原体）目的基因的存在与否，进而对疾病的诊断和治疗提供信息和决策依据。它一经问世就作为一种快速、灵敏、特异的检测新技术手段，迅速而广泛地应用于传染病的诊断、血筛和肿瘤早期辅助诊断，例如，肿瘤的分子分型、遗传病的诊断、产前诊断和组织分型等诸多诊疗领域中。

在后疫情时代背景下，由于PCR分子检测提供了良好的特异性、敏感性和结果的重复性，检测时间仅需几个小时，使得分子诊断行业热度持续高涨。同时，应用端也提出了更快、更广、更准的要求，如何进一步优化PCR方法，克服不足之处，以加速传统分子技术的更新迭代。目前已显现两大发展趋势，其一是高集成、高自动化PCR整体解决方案，其中既有大通量、超高速的全自动大型平台，满足大型PCR实验室的高样本量检测需求;也有小型化“样本进、结果出”的POCT平台，大大提高PCR的可及性。此外是提高检测靶标的多样化和广谱性，单次反应即可完成多联检测，提供更多的生物信息。

分子POCT是分子生物学技术与POCT相结合的产物，将核酸检测的门槛降低，具备集成化、小巧便携、操作简易、快速、密闭、适用于多种场景等特点。通常由测试仪器和试剂盒组成一个封闭系统，集成“核酸-扩增-检测-报告”整个流程，因此整个系统的稳定、高效、便捷、成本可控非常关键。简化PCR后分析判断结果的复杂性，是分子POCT的一个突破方向。DNA生物传感器的进一步发展提供了一种替代方法，大大提高了检测能力、特异性和再现性。DNA生物传感器的一般原理涉及将DNA探针固定在传感器表面，并通过电化学、光学或重量法进行杂交和检测。但价格昂贵，需要专用设备及训练有素的实验室技术人员。

多重检测能够在单次反应中检测多个靶标，是分子POCT的另一个突破方向。在提高POCT仪器单次检测效率的同时，又可以应对复杂感染、混合感染、多耐药靶点、多基因突变等多样化检测需求。目前，许多用于检测呼吸道病毒或非典型病原体的多重PCR方法，包括双启动寡核苷酸系统（DPO）、多重连接依赖性探针扩增（MLPA）[1]和基于高级片段分析的多重PCR，都已用于识别呼吸道致病原[2]。然而，这些多重PCR技术大多依赖于昂贵的基础实验室设备，如荧光PCR仪器和熟练的技术人员，这些设备需要执行一系列繁琐的操作，或需要长时间的后续结果分析程序[2]。

PCR-试纸层析分析技术已被开发并应用于多个领域，使其成为此类多重PCR分析的良好候选方法。越来越多的DNA生物传感器以基于试纸侧向层析条的形式应用于POCT分子诊断[3、4]。这种纸基传感器可以在不使用仪器的情况下对DNA进行目视检测，由于采用干式试纸条，省去了孵育和清洗步骤，并将对操作人员的要求降至最低。此技术主要通过使用金纳米颗粒[3－6]和彩色聚苯乙烯微球[7、8]作为信号发生器，实现了对DNA定性结果的可视化判读。利用金纳米颗粒（AuNP）的特征红色，特异性杂交可触发试纸条测试区的AuNP累积，从而实现PCR后的目视检测。也可使用寡核苷酸修饰的红色/蓝色聚苯乙烯微球作为标记物，通过引物延伸反应和随后的直接目视检测即可基因分型结果判断，而无需在PCR步骤后对DNA进行事先纯化。聚苯乙烯微球相对于AuNP的优势在于其在各种缓冲液中的优越稳定性以及与寡核苷酸的结合物的快速制备，聚苯乙烯微球允许对特定DNA序列进行双色检测，还可开发双色或多色生物传感器用于细菌的颜色编码识别。除了定性判读，也可通过颜色强度读数或与酶、荧光染料或放射性结合物的耦联后换算出定量结果[9－11]。

已有的研究中，多重PCR-DNA试纸层析分析技术已成功开发和应用于多个领域。原理是将不同的寡核苷酸探针平行固定在试纸上，带有寡核苷酸标记末端和生物素化末端的靶DNA扩增产物通过链霉亲和素-生物素相互作用与红/蓝乳胶微球偶联，然后与条带上的互补寡核苷酸杂交。在测试线和对照线上聚集捕获的乳胶微球会产生红/蓝带，可用肉眼进行视觉检测，此外，还可给出基于视觉强度的半定量结果（图1，2）。

图1. PCR和DNA层析技术的示意图[8]

Tag：寡核苷酸链；cTag：互补寡核苷酸链

图2. DNA试纸层析色谱图[3]　

应用包括口腔龋齿相关细菌群[3]、H1N1病毒快速检测[12]、麻疹病毒[13]、腺病毒DNA[14]、鉴别粪便样本中的碳青霉烯酶基因[15]，与其他核酸检测相比，该检测更省时，且更易于操作和运输。此外，它不需要昂贵或复杂的设备，PCR产物的结果可以目视观察快速直观地读取。这种纸基的PCR-试纸层析分析技术与微流控技术相结合，可制成微流控反应芯片，配合小型设备即可组合成封闭、高效的分子POCT检测系统。检测简单、快速（10分钟内目测）、灵敏、价格低廉，很好地满足了POCT应用的性能关键点，即不需要复杂设备、试剂或电源，可一次性、易于使用和运输的试剂，最大限度地减少了对技术人员的需求。

宝创生物科技有限公司长期致力于病原微生物的快速、精准分子诊断技术的研发和生产，潜心研究多重PCR－DNA试纸层析分析技术，已成功开发出7种常见呼吸道病毒和非典型病原体联合检测试剂及4种性传播疾病联合检测试剂。

呼吸道感染病原体的早期准确诊断对于及时、准确地使用抗病毒或抗菌治疗，启动有效的感染控制措施，缩短住院时间以及控制医疗费用至关重要。宝创生物科技有限公司首创将多重PCR－DNA试纸层析技术应用于呼吸道病原体的多重检测，在呼吸道样本中同时检测7种呼吸道病原体，例如，新型冠状病毒、甲乙流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体和衣原体。应用硝化纤维素（NC）膜制成的试纸条，不同测试线上包被有不同的互补序列（cTag），以实现一个试纸条上的多重检测。PCR扩增时产物可连接上探针（tag）和生物素，将产物与链霉亲和素包被的蓝色乳胶微球预先混合（图1）。当试纸条插入混合物中时，目标DNA将通过Tag和cTag的序列互补性连接到试纸条上的测试线（图2）。同时，包被链霉亲和素的蓝色乳胶微球将通过链霉亲和素-生物素相互作用附着到测试线上。随着蓝色微球的累积，当混合物中存在目标PCR扩增产物时，显示蓝色测试线（见图3）。

性能验证结果显示，检测限为10拷贝/μl，未观察到与11种病毒以及12种呼吸道细菌的交叉反应，这表明PCR－DNA试纸层析检测具有高度的灵敏度和特异性。应用896份临床样本评估该方法的临床性能，并将结果与Sanger测序进行了比较，阳性预测值高于82.1%，阴性预测值高于99.5%，kappa值为0.869～0.940[16]。

通过将一步RT-PCR与试纸层析条相结合，该方法目前可在40分钟内实现多重检测。省时高效，相比其他分子诊断方法花费时间更少，并且成本比其他分子检测方法（如RT-PCR）低得多。在目前的新冠疫情背景下，此技术可以被用来鉴别新冠病毒肺炎和其他病原体引起的普通肺炎，现有的多重PCR检测需要使用琼脂糖凝胶电泳或昂贵的专用杂交或测序设备才能对PCR产物进行分析，因此只能由专业人员在高级别实验室内经几个小时才能得出结果。而PCR-DNA试纸层析检测仅需一台普通梯度PCR仪，因此可广泛应用于小型化实验室。

性传播疾病（STI）的传统病原体检测方法包括培养和免疫分析，但存在耗时长、阳性率低的问题，免疫分析虽然快速但特异性较低，因此需要更快速、经济、易操作、灵敏的检测方法。核酸扩增技术（NAATs）以其高度的敏感性和特异性得到了广泛的应用。目前的NAAT相关检测，包括琼脂糖凝胶电泳分析、实时PCR和DNA微阵列，都有一些缺点。例如，通过琼脂糖凝胶电泳进行后分析的PCR比其他NAAT相关分析（如实时PCR）敏感度更低[17]；而实时PCR和DNA微阵列[18]需要复杂的数据分析或昂贵的仪器。

宝创生物科技有限公司的4种性传播疾病（STI）联合检测也是基于多重PCR－DNA试纸层析技术，通过在试纸条上包被4个不同的cTag，实现一个试纸上同时检测四种STI病原体：脲原体、淋病奈瑟菌、人型支原体和沙眼衣原体。从原始样品到结果的DNA层析分析的总运行时间在2小时以内，包括DNA提取过程。应用295个临床样本评估试剂性能，将结果与培养或胶体金抗体结果进行比较，PCR－DNA试纸层析法的阳性率高于培养法或胶体金法。解脲支原体阳性率最高，其次是沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和人型支原体。其中合并感染很常见，培养或胶体金法检出22例合并感染，PCR-DNA试纸层析法检出28例。敏感性为84.6%-100%，特异性为93.5%-96.6%，PPV为53.6%-86.7%，NPV大于98.3%。两方法之间的Kappa值范围为0.676～0.864，符合率为93.5%～96.6%[19]。

在多重PCR-DNA试纸层析技术的基础上，宝创生物开发了微流控PCR层析芯片和配套的分子POCT分析仪，形成完整的可视化、便捷化的多重PCR快速检测解决方案。芯片内含核酸扩增区、密闭的腔体和流道、层析区。通过气体驱动样本的流动转移，将样本推至核酸扩增区，由外设备对核酸扩增区中的样本进行PCR扩增反应。扩增完成后，再推动扩增后的样本产物至层析区进行分子杂交反应，待反应结束后进行可视化的结果分析，见图4。

    图4. 宝创生物多重PCR快速检测解决方案

本技术产品优势：有别于传统的POCT分子试剂芯片，体积小巧，结构精简，成本低。样本及试剂需求少。采用密封设计，进行核酸扩增反应后，无需转移扩增产物，避免核酸扩增产物对外界的污染，极大的提高PCR检测的安全性和可靠性。仪器无需荧光模块和繁琐的传动组件，降低了对设备结构的要求，有利于批量生产及客户使用。

主要参数：（1）上样量：40μl；（2）进样时间：约2min；（3）扩增时间：约30min；（4）层析反应时间：约12-13min（大约45 min出结果）。

宝创生物科技有限公司仍在全方位升级和拓展此项技术，已研发定型6项呼吸道细菌检测、结核分枝杆菌和非分枝杆菌多联检测、耐药基因多联检测等。还将研发适用于多样本类型的核酸提取试剂芯片，它与层析芯片简单叠加，形成更为集成化的PCR全反应过程试剂。仪器也可添加结果自动摄像判读功能，真正实现“样本进、结果出”的分子POCT检测流程，可在多种分布式医疗场景下（门诊、基层、居家自测）发挥巨大潜力。

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