代谢组学技术在糖尿病患者诊疗中的应用与临床前景
刘树业，主任技师，二级教授，天津市第三中心医院检验科学术带头人。社会兼职：天津市医师协会检验医师分会会长；天津市生化与分子生物学会临床研究分会主任委员；天津市临床检验重点学科带头人；中国医疗保健国际交流促进会副主委；中国老年医学会检验分会常委；中国国家合格评定认可委员会实验室评审员（15189，17025）；国家卫生健康委能力建设和继续教育检验医学专家委员会委员。专业研究方向及成果：基于液质联用代谢组学方法的疾病的实验室检验诊断；曾荣获天津市科技进步二等奖、三等奖，国际先进科技成果十余项，主持完成各类重点科研课题十余项。
刘爽，天津市第三中心医院检验科主管技师，2016年毕业于天津医科大学，临床检验诊断学硕士。主要研究方向：代谢组学在疾病早期诊断方面的应用。近三年参与天津市科委及卫健委课题两项。
糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组常见的代谢内分泌病，其病理基础为胰岛素绝对或相对不足和靶细胞对胰岛素敏感性降低，导致高血糖和脂肪及蛋白代谢改变[1]。可发生于任何年龄，遗传和环境因素为主要原因，某些病毒感染，不良饮食习惯，也均使糖尿病患病率显著增加[2]。近些年，我国糖尿病患病率呈显著增加的态势[3]，据统计，我国在糖尿病及其并发症治疗方面的总支出位居全世界第二位[4]。早期发现糖尿病，早期进行治疗干预，对于提高糖尿病患者生存水平有很大帮助。糖尿病作为一种典型的代谢性疾病，往往涉及复杂的代谢变化过程。而代谢组学技术作为一种能够识别和测量生物体整体代谢变化的技术，被认为是给个体代谢物分级的有效工具[5]，将非常有助于代谢性疾病的研究。本文将就代谢组学在糖尿病诊疗方面的应用和前景做一简要论述。
一、代谢组学（metabolomics或metabonomics）研究
方法概述
代谢组学起源于二十世纪八十年代，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个分支，研究生物体系的代谢网络[6]。该技术具有整体性、非靶向性和动态性等特点，可以从分子水平发现疾病导致的异常代谢变化，提供机体最完整的生物学状态图谱。该技术主要以小分子代谢物（相对分子质量＜1,000）为研究对象，利用高精密度的分析方法和化学计量学的处理方法来研究生物体在遗传、环境或是外界物理、化学刺激等情况下机体的反应和变化[7]。由于信息学和分析技术的创新发展，以及正交生物学方法的整合，现在有可能扩大代谢组学分析，以了解代谢产物的系统级影响。此外，由于代谢组学固有的敏感性，可以检测到生物途径的细微变化，从而为深入了解人体问题各种生理条件和异常过程（包括疾病）的机制提供了依据[8]。
二、糖尿病代谢组学技术临床应用研究概况
糖尿病是一种以糖代谢失常为主的内分泌代谢性疾病，通常表现为整体的代谢紊乱（包括糖、脂、氨基酸代谢紊乱等），利用代谢组学技术研究糖尿病发病前后代谢产物和代谢途径的变化，将表观现象及其在分子水平上的变化联系起来，更加系统和全面地揭示糖尿病病理变化和发病机制，发现因疾病引起的代谢异常，为糖尿病的预防和治疗提供理论基础，并有助于糖尿病生物标志物的发现，辅助临床早期诊断和治疗[9]。在近十几年的研究中，通过高通量代谢组学技术对于糖尿病的病理生理途径以及疾病的风险因子已经基本清晰[10, 11]，疾病基本机制的研究成果也为如何预防疾病、早期发现疾病提供了更多的线索。已有大量研究证明，代谢产物，如葡萄糖、果糖、氨基酸和脂质，在糖尿病患者体内会发生不同的改变，并且这些代谢物在糖尿病前期以及糖尿病病程中具有显著的前瞻性和预测性关联。
三、糖尿病代谢组学临床研究实例分析
2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）占糖尿病患者的90%，由遗传因素和环境因素共同引起，包括胰岛素抵抗、超重和缺乏运动[12, 13]。目前，全球约有4.63亿T2DM患者，每年有420万人死于该疾病。这些数字在2030年可能会翻倍[12, 14]。基于此，本文中暂且只分析讨论糖尿病分型中的T2DM。
1. 代谢组学在糖尿病发病机制方面的相关研究：糖尿病的发病机制与遗传易感性、环境因素、胰岛素抵抗、低度炎症、不良饮食及生活方式都存在一定的关系，探索代谢物的变化有助于更好地了解糖尿病的生物学基础。
相关研究表明，T2DM发病的始动因素为胰岛素抵抗，且胰岛素抵抗与炎症因子及信号蛋白异常关系较为密切，脂代谢异常所导致的脂肪异常分布、过度堆积则是胰岛素抵抗的主要因素。早在2000年，耶鲁大学霍华德休斯医学院Gerald I. Shulman在探讨胰岛素抵抗的细胞机制时提出了在T2DM中骨骼肌胰岛素抵抗是导致血糖升高的一个原因的观点[15]，而骨骼肌的胰岛素抵抗是由于脂肪酸的浓度增加，其机制为脂肪酸浓度的增加导致线粒体内乙酰辅酶a/辅酶a和NADH/NAD+比值的升高，进而导致丙酮酸脱氢酶失活。这反过来又会导致柠檬酸浓度增加，引起磷酸果糖激酶的抑制。随后细胞内葡萄糖-6-磷酸浓度的增加会抑制己糖激酶Ⅱ的活性，从而导致细胞内葡萄糖浓度的增加和肌肉葡萄糖摄取的减少。为了从分子层面证实这一结论，Yang Zhou等人所在的课题组[16]通过动物模型，利用质谱法进行了深入研究。课题组以野生小鼠与糖尿病小鼠为研究对象，采用质谱法体外监测小鼠骨骼肌中与线粒体脂肪酸氧化相关的代谢物质。实验证实糖尿病小鼠骨骼肌中与线粒体脂肪酸氧化相关的两种蛋白代谢产物和一种长链乙酰基肉碱显著下调，最终得出脂肪酸β-氧化在2型糖尿病小鼠模型骨骼肌中的通路衰减的结论，从而印证了Gerald I. Shulman的结论，也向糖尿病发病机制的揭示迈进了一步。
糖耐量异常（Impared Glucose Tolerance，IGT）是糖尿病前期的一种代谢状态，是介于血糖正常和DM之间的一种代谢状态，对该阶段人群进行代谢组学分析，筛查特征性代谢物，有助于揭示疾病的发生、发展的变化规律，从而有效预防或延缓T2DM的发生。本研究中心肖继等[17]通过超高效液相色谱与质谱联用（UPLC-MS）代谢组学技术分析糖耐量试验正常（Normal Glucose Tolerance，NGT）组，IGT组和T2DM组血清代谢物，用SIMCA-P软件构建主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘聚类分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型，筛选出28个特征代谢物。通过SPSS统计软件分析，最终得出7个具有统计学差异特征性代谢物质（见图1和表1）。研究指出LysoPC在IGT和T2DM患者中均有减低，而LysoPC能够促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄入，在胰岛素抵抗的发病机制中发挥重要作用，是一种新的反映胰岛素状态的标志物，为研究糖尿病的发病机制提供了新的思路。
注：A，所有标本构建的PCA在第一与第二主成分上的打分图（t[1]/t[2]），图中每一个点代表一个标本；B，所有标本构建的OPLS-DA在第一预测主成分与第一正交主成分上的打分图（t[1]/t[2]），图中每一个点代表一个标本。
2. 代谢组学在糖尿病治疗中的相关研究：代谢组学可以反映小分子代谢物在疾病发生发展及治疗过程中变化的整体水平,因此可用于探索疾病病程变化和监测药物疗效。由于代谢组学技术中的核磁共振氢谱（nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H-NMR）能够对样本进行动态监测，因此该技术在T2DM及其并发症和中医药治疗的代谢组学研究方面展现出良好的应用前景。
Guo[18]等人采用基于1H-NMR的代谢组学和网络药理学研究黄芪-山药对T2DM大鼠的降糖作用，代谢谱分析发现T2DM的调控主要与黄芪-山药中的18种活性物质有关，其作用靶点有135个，其中4个靶蛋白可能是黄芪-山药治疗T2DM最相关的靶点。
现代“微生物-肠-脑”学说认为，人体肠道微生物通过微生物-肠-脑轴不仅可以影响大脑功能，改变宿主行为，而且可促进宿主代谢和健康，如减轻体重、减少脂肪，改善血糖控制及胰岛素敏感性，这也就是意味着肠道菌群有可能成为治疗T2DM等相关疾病的很有前景的靶点[19]。而代谢组学技术可以用于分析肠道代谢状况，从而间接监测药物对肠道菌群的影响，以达到评估药物疗效的目的。我国学者Mingyi Chen[20]等采用16S rDNA测序和1H-NMR谱分析灵芝多糖对T2DM大鼠模型中肠道微生物菌群组成和功能以及宿主代谢的变化。通过研究发现灵芝多糖不仅能通过增加T2DM大鼠肠道有益菌群，减少有害菌群，将肠道菌群组成调节到正常水平，还能改善氨基酸代谢，改善碳水化合物代谢，减少炎症物质代谢，减少细菌毒素，从而实现显著降低空腹血糖和胰岛素水平的治疗效果。T2DM患者可能出现肠道菌群失调，不同人群之间表现出一定的差异，但也存在许多共同特征。代谢组学的大规模分析技术拓宽了与T2DM发病机理有关的新发现的可能性，目前已鉴定出包括短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）在内的多种肠道菌群代谢产物，并揭示了它们对T2DM代谢调控作用中可能涉及的途径。基于肠道菌群代谢的T2DM治疗目前虽不能在临床上替代传统药物，但已显示出潜在的应用价值[21]。
与T2DM相关的特定代谢物可以通过基于血浆、粪便、尿液或其他生物流体的质谱或磁共振代谢组学进行鉴定，从而能够对微生物组、代谢组进行联合分析，以确定潜在的机制联系。这也就是说代谢组学技术的应用并不局限于此，还拥有更加广阔的空间。
3. 代谢组学在糖尿病生物标志物方面的相关研究：因为代谢组学技术可以同时分析生物体液、细胞和组织的多种代谢物，是目前寻找生物标志物的常用工具。寻找反映T2DM早期变化的代谢途径和生物标志物，不仅有助于了解T2DM的病因，也可为T2DM的早期诊断、风险预测和预防策略提供理论依据。
Rui Wang-Sattler[22]等人的课题组在奥格斯堡地区（KORA）人群合作健康研究队列中，定量检测了4297份空腹血清样本中的140种代谢物。通过研究分析揭示了糖尿病前期患者（包括空腹血糖受损和糖耐量受损）显著的代谢变化，确定了三种代谢产物：甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱（LPC）（18:2）和乙酰肉碱。糖耐量受损患者与糖耐量正常受试者相比，具有较低水平的甘氨酸和LPC。这说明甘氨酸和LPC水平降低可以作为糖耐量受损甚至是2型糖尿病的预测因子。这个结论在欧洲癌症和营养前瞻性调查（EPIC）-波茨坦队列中得到了独立证实。通过代谢蛋白网络分析，课题组确定了7个与2型糖尿病相关的基因。而后证实这7基因通过与4种酶的多重交互作用与上述3种特异性代谢产物相关，而这4种酶的表达水平也与糖尿病相关的代谢物浓度的变化相关。针对另外一种糖尿病前期患者即空腹血糖受损患者，我国学者Jianglan Long[23]等所在团队也进行了类似研究，通过对149名参与者（包括51名T2DM患者、50名空腹血糖受损患者和48名糖耐量正常的受试者）的血清样本进行代谢组学分析，并通过数据库比对、统计软件分析，得到38种差异代谢物与T2DM患者显著相关，23种差异代谢物与空腹血糖受损患者显著相关，主要是氨基酸、肉碱和磷脂。通过综合评估，课题组定义了一个由2-乙酰乳酸、2-羟基-2,4-戊二烯酸、l-阿拉伯糖和l-谷氨酰胺组成的新型综合生物标志物，对空腹血糖受损患者和T2DM具有较好的诊断效果。这一发现为糖尿病的诊断和治疗提供了新的生物标志物的支持。
上述类型的研究利用代谢组学技术不止挖掘出糖尿病的生物标志物，也为预防2型糖尿病提供了新的策略。
四、代谢组学技术临床应用前景与挑战
代谢组学技术的飞速发展，为进一步了解糖尿病的病理生理机制提供了新的视角。代谢组学依托于先进的检测仪器、强大的数据分析模块，在复杂的代谢性疾病的研究中发挥了巨大的潜能。目前在糖尿病机制研究、疾病诊断与预测、药物研究与药效评估等方面成效显著。然而，考虑到代谢组学的发展，仍面临一些挑战：
1. 检测前：代谢组学检测的样本可以是血液、尿液等生物体液，但生物标本采集前状态（如禁食、用药等）和处理条件（从采集到检测或者冷冻的时间、运输条件、冻融次数等）对代谢物产生的影响暂时没有相关研究。
2. 检测中：目前尚无国际统一的代谢组学检测技术流程和质控标准，无法做到不同实验室结果的比对；现有的代谢物数据库也处于不断更新中，暂无法做到纵向的比较。
3. 检测后：尽管同基因组学、蛋白组学相比，数据分析量稍低，但也属于大数据范畴，需要具备一定的生物信息基础的人员进行处理。综上，代谢组学在代谢性疾病的诊断与治疗中仍有很大的发展空间，尚需我们在不断完善代谢组学技术的基础上，推动技术的不断进步与发展。
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