DNA异常甲基化在肺癌诊疗中的应用价值
赵晓涛，博士，教授、主任医师，硕士研究生导师，北京大学人民医院检验科副主任。主要从事临床分子检测及相关基础研究工作。作为课题负责人获得国家自然科学基金、北京市自然科学基金等资助，以第一或通讯作者发表核心期刊及SCI收录论著多篇。主要社会任职：北京大学医学部医学检验学系委员（兼秘书）；中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会常务委员（兼秘书长）；中华医学会北京检验学会科研与研究生培养专项工作组副组长；中华医学会检验医学分会分子诊断组委员；北京医师协会检验专科医师分会理事；中国中西医结合学会检验医学专委会委员；北京中西医结合学会检验医学专业委员会常委；中国医疗保健国际交流促进会基层检验技术标准化分会委员等。
杨雨，北京大学人民医院检验科临床型硕士研究生，研究方向为DNA异常甲基化检测在肿瘤中的应用。
【摘要】随着肺癌发病率及死亡率的增加，肺癌早期诊断的需求变得愈发强烈。DNA异常甲基化发生在肺癌早期，随着疾病的进展及治疗效果而动态变化。迄今为止，大量文献报道了特异性基因甲基化在肺癌临床诊断、疾病预后及疗效监测等方面的应用，同时DNA甲基化转移酶抑制剂应用于肺癌治疗的临床试验也正在如火如荼地开展。DNA异常甲基化检测助力肺癌诊疗指日可待。
据全球最新癌症数据显示：肺癌已成为癌症死亡的首因，发病率居世界第二，多数肺癌患者确诊后5年生存率仅为10% - 20%[1]，因肺癌早期无典型的临床表现，确诊时多为进展期，因此肺癌诊断的研究重点是寻找较为敏感及特异的标志物以辅助肺癌早期诊断[2]。肺癌发生的分子基础是细胞核中遗传学及表观遗传学改变的逐渐积累。表观遗传学在不改变DNA序列的前提下通过DNA异常甲基化、miRNA及lncRNA表达调控、组蛋白修饰调节等方式调控肺癌的发生发展。DNA异常甲基化通过改变DNA与甲基的共价结合，影响基因的表达，是首个在癌症中被证实的且研究最广泛的表观遗传学改变[3]。在这里我们将对DNA甲基化的概念、DNA异常甲基化在肺癌诊治方面的应用以及DNA异常甲基化在其他肿瘤中的应用等内容进行综述。
一、DNA甲基化
DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸（S-adnosylmethionine，SAM）提供的甲基以共价结合的方式连接于基因组未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤-二核苷酸（Cytosine-Guanine-dinucleotide，CpG）的胞嘧啶第5个碳的位置。在人类基因组中，大部分的CpG位点被甲基化，而未甲基化的CpG位点则呈现不均匀局部聚集现象，富集的区域称为CpG岛，多位于基因的启动子区，调控基因表达。DNMTs是甲基化过程的关键酶，目前已报道的DNMTs家族成员有: DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C、DNMT3L，其中DNMT1负责修复和维持DNA复制过程中的甲基化模式，DNMT3A、DNM3B则促进DNA从头甲基化[4]，近年来研究表明DNMT1也具有从头甲基化的作用[5]，而DNMT2、DNMT3C、DNMT3L不具有催化活性，但DNMT3L可作为DNMT3A/3B的辅助因子，增强DNMT3A、DNMT3B活性[6]。甲基胞嘧啶双加氧化酶（ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase family of enzymes，TETs）通过氧化甲基胞嘧啶，同时联合胸腺嘧啶DNA糖苷酶的碱基切除修复作用，发挥DNA去甲基化作用，从而将甲基化的DNA还原为非甲基化状态[7]。Takeshima等人通过构建幽门螺杆菌感染小鼠模型，证明炎症因子下调TETs水平和一氧化氮（NO）增强DNTMs活性在DNA甲基化过程中具有协同效应[8]。因此，在DNMTs与TETs的共同作用下，维持CpG位点甲基化与去甲基化的动态平衡，保持DNA状态的稳定，一旦失衡将导致DNA异常甲基化。
多种外界因素可通过改变DNMTs及TETs活性或影响SAM来源干扰DNA甲基化过程。化学物质（尼古丁、黄曲霉毒素B1、某些重金属、多环芳香烃、PM2.0颗粒等），食物中某些营养元素和非化学应激源等均可干扰DNA甲基化过程，导致原癌基因和抑癌基因功能失调[9]。吸烟是肺部疾病、心血管疾病等的高危因素，Dugué团队对三类人群（当前吸烟、戒烟和从未吸烟）进行横断面研究，结果表明：当前吸烟者与戒烟者，戒烟者与从未吸烟者相比，CpG位点甲基化存在显著差异[10]，当前吸烟者与从未吸烟者相比，芳香烃受体抑制剂（aryl hydrocarbon receptor repressor，AHHR）基因中的cg05575921位点甲基化水平显著升高[11]。通过纵向研究表明随着戒烟时间延长吸烟引起的DNA异常甲基化是可逆的[10]。Mahmoud综述了食物中某些营养元素，如叶酸，维生素B12，维生素B6等，通过参与一碳单位的代谢过程，影响一碳单位为甲硫氨酸提供甲基形成SAM，同时也可通过影响DNMTs活性，调控DNA甲基化水平[12]。因此，通过规避外界环境因素对DNMTs及TETs的影响，可能会降低DNA甲基化致病率，成为辅助DNA异常甲基化相关疾病的治疗方法之一。
二、DNA异常甲基化与肺癌
1. DNA异常甲基化：主要表现为两种形式：（1）CpG岛DNA高甲基化；（2）基因组DNA整体低甲基化。CpG岛高甲基化则多发生在抑癌基因的启动子区，通过直接削弱转录因子与启动子结合或招募甲基化DNA结合蛋白间接干扰转录因子与启动子区结合，从而抑制抑癌基因转录[3]。基因组DNA低甲基化过程多发生在基因内、基因间区域、重复序列等处，在DNA复制过程中，基因组CpG位点甲基化的丢失经细胞有丝分裂后导致整体甲基化水平降低，引起基因组不稳定，诱发沉默的原癌基因激活[13]。CpG岛局部高甲基化及基因组DNA整体低甲基化在肺癌的发生发展起着至关重要的作用。
多轮低剂量螺旋CT筛查可显著降低有吸烟史的高风险人群肺癌死亡率[14, 15]，但对肺部结节鉴别诊断的特异性差，且多次辐射暴露会加重患者心理负担。肺组织病理活检作为肺癌诊断的金标准，存在以下不足：（1）肿瘤存在异质性，部分组织样本不能完全代表疾病状态；（2）对早期肿瘤、残留病灶以及早期复发的检测较为困难；（3）侵入性有创操作，易引发相应并发症。而DNA异常甲基化在肺癌的不典型增生期即可出现[16]，并在癌症进展过程中持续存在[17]，可通过检测痰液或者外周血中循环肿瘤DNA异常甲基化辅助肺癌诊断。虽然对痰液进行DNA异常甲基化检测诊断敏感性更高[18]，但早期肺癌患者可能无明显的临床表现，导致无痰液咳出，故而对外周血中循环肿瘤DNA异常甲基化的检测应用更广泛。
2. DNA高甲基化与肺癌：Kneip等人报道了单独用血浆中SHOX2高甲基化诊断肺癌时,敏感性为60%，特异性可达到90%[19]。肿瘤干细胞由肿瘤细胞去分化发展而来，具有强大的自我更新、多重分化、增强转移的能力，虽然占肿瘤总数的不到1%，但它们是导致放疗或常规化疗耐药性和侵袭性进展的主要因素。RASSF1A基因启动子区甲基化的肺癌细胞可触发肿瘤细胞向癌症干细胞转化并可促进肿瘤细胞体内转移性播散[20]。在肺癌患者中对血浆中SHOX2、RASSF1A高甲基化联合检测可将诊断敏感性提高到96.67%，而特异度并无明显下降[21]，上述结果表明SHOX2、RASSF1A高甲基化作为辅助肺癌诊断的生物学标志物有良好的应用价值。2017年国家药品监督管理局批准了SHOX2、RASSF1A甲基化DNA检测试剂盒，用于体外定性检测人肺泡灌洗液中这两个基因的甲基化情况。另外，SHOX2联合PTGER4基因甲基化在I、II期肺癌的诊断灵敏度可分别达82.5%和90.5%[22]。组蛋白基因HIST1H的多个CpG位点在肺癌患者均呈现高甲基化，尤其是应用HIST1H4F和HIST1H4I两个位点的甲基化联合检测肺癌，诊断灵敏度可达92.9%，诊断特性度可达96.0%，尤其在I期肺癌检测方面效果显著[17]。Alicia Hulbert团队筛选出三个肺癌特异性甲基化基因（TAC1，HOXA17和SOX17），三者联合检测显著提高肺癌诊断性能[18]。因此，多个基因高甲基化联合检测可显著提高肺癌诊断的检出率。在肺腺癌中HIST1H2AG，HIST3H2A，HIST3H2BB，HIST1H3发生高甲基化；HIST1H4A，HIST1H3A，HIST1H2AL，HIST1H3I高甲基化仅在肺鳞癌中被发现；HIST1H2BL，HIST2H3D，HIST1H2AJ，H2AFJ，HIST1H2AI，HIST1H1D在小细胞肺癌中被特异性甲基化，因此组蛋白基因不同位点的高甲基化将有助于肺癌不同类型的诊断[17]。且肺癌病灶体积越大，TNM分期越高，肺癌特异性基因甲基化水平则越高，肺癌患者行手术治疗后，肺癌特异性基因甲基化水平较术前将显著下降[23]。
TMEM196基因作为抑癌基因，启动子区发生高甲基化后，其表达水平下降。与未甲基化的肺癌患者相比，TMEM196高甲基化的肺癌患者总体生存率更低[24]。抑癌基因启动子区高甲基化还与靶向药物的耐药相关，吉非替尼可用于EGFR基因突变阳性的非小细胞肺癌患者，研究发现WIF1基因启动子区甲基化程度越高，非小细胞肺癌患者对吉非替尼的反应越差，患者的无进展生存率及总体生存率也显著降低[25]。因此，肺癌特异性基因高甲基化在肺癌诊断、预后评估以及靶向药物疗效监测等方面均具有良好的应用价值。
3. DNA低甲基化与肺癌：DNA甲基化的缺失是首个在癌症中被发现的表观遗传学改变。全基因组低甲基化可发生在DNA重复序列、癌症相关基因的转录调控区域等位置[13]。多项吸烟相关的甲基化差异表达研究发现F2RL3呈现低甲基化状态[26, 27]，尤其是在65岁及以上的吸烟人群中F2RL3基因低甲基化与肺癌的发生率及死亡率显著相关[28]。正常情况下SPANXC基因仅在睾丸组织中表达，而SPANXC基因启动子区低甲基化时可使其在肺腺癌组织中被激活，促进肺腺癌细胞的转移[29]。DNA低甲基化也可影响下游抑癌基因启动子区使其发生高甲基化，抑制抑癌基因转录[13]。对应用免疫检查点（PD-1）抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者进行DNA顺式调控元件（包括增强子和启动子）测序，比较抗PD-1治疗有反应和无反应的患者发现DNA甲基化存在差异表达，尤其是低甲基化的CYTIP和TNFSF8基因对抗PD-L1疗效有良好的预测性，甲基化水平越低，疗效越差，无进展生存率和总体生存率越低[30]。在肺鳞癌中，DNA重复序列LINE-1低甲基化被证实是癌症特异性改变，与基因组不稳定性相关[31]。逆转录转座是通过逆转录将转座子特异插入基因组而发生染色体重排的一种机制。LINE-1序列低甲基化可促进逆转录转座过程，导致LINE-1与FGGY基因重排形成LINE-1-FGGY，干扰FGGY抑癌基因的表达以及介导癌症细胞的局部免疫逃逸[32]。肺鳞癌的基因突变频率低于肺腺癌导致靶向药物治疗效果不明显，通过应用免疫检查点抑制剂治疗可提高肺鳞癌患者的无进展生存率和总体生存率[31]，而LINE-1低甲基化介导肿瘤局部免疫逃逸会降低免疫检查点抑制剂的疗效。因此，DNA低甲基化不仅促进肺癌的发生发展，也会降低肺癌免疫检查点治疗的疗效。
三、DNA异常甲基化在肺癌治疗中的应用
手术是I、II期非小细胞肺癌患者首选的治疗方式，对于进展期肺癌患者，维持性化疗是常规选择。新兴技术（如下一代测序及其他组学平台）检测发现的某些特定基因突变（如EGFR、ALK、KRAS、BRAF基因）或染色体重排（如ROS1融合、RET融合）给进展期的非小细胞肺癌患者提供靶向药物治疗的可能。免疫检查点抑制剂应用于非小细胞肺癌患者可显著提高总体生存率[33]。DNA异常甲基化促进肺癌的发生发展，从调控DNA异常甲基化过程这一思路出发，可能会为肺癌治疗提供新思路。近年来，关于调控DNA异常甲基化过程药物的研究正如火如荼地开展。DNA甲基化过程的关键酶逐渐成为研究的热点。
DNMTs抑制剂包括胞嘧啶类似物（地西他滨、阿扎胞苷）以及非胞嘧啶类似物（SGI-1027），低剂量可抑制DNMTs的催化作用，逆转CpG岛高甲基化状态，重新激活抑癌基因，从而发挥抗肿瘤的作用。Hu等人综述了在肺癌中DNMTs抑制剂联合化疗、靶向药物治疗或免疫检查点治疗方案的治疗效果显著高于单一的抗肿瘤治疗方案[34]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP ribose polymerase，PARP）抑制剂，作为同源重组修复通路基因突变的靶向药物，通过诱导合成致死效应发挥作用。在非小细胞肺癌患者中，PARP抑制剂作为单一药物使用时效果不明显，DNMTs抑制剂可通过诱导DNA损伤修复缺陷的作用，增加非小细胞肺癌患者对PAPR抑制剂的敏感性，成为非小细胞肺癌潜在的治疗新方案；同时DNMTs抑制剂也可增加放疗的敏感性，从而达到改善非小细胞肺癌患者治疗效果的目的[35]。因此，DNMTs抑制剂可能成为肺癌治疗新方案，与其他肺癌治疗方案联合应用可能显著改善肺癌患者预后。TET1基因突变与肿瘤免疫原性增强和炎症抗肿瘤免疫显著相关。研究发现TET1突变的肺癌患者使用免疫检查点抑制剂治疗后无进展生存率和总体生存率显著延长，但因TET1突变率较低限制了其应用[36]。
四、DNA异常甲基化在其他肿瘤诊疗中的应用
DNA异常甲基化在肺癌中具有良好的应用价值，在其他肿瘤中也被广泛应用。不同亚型乳腺癌的基因突变可能仅存在部分患者中，但循环肿瘤DNA异常甲基化可普遍存在于各种亚型的乳腺癌患者。因此，DNA异常甲基化可能发展为乳腺癌较为良好的分子生物学标志物。高水平的DNA异常甲基化与乳腺癌高侵袭性显著相关。使用新辅助化疗后DNA异常甲基化水平可显著下降，疗程结束后若仍可检测到循环肿瘤DNA异常甲基化，则提示残留病灶的存在，预示疗效不佳。故DNA异常甲基化可很好地用于乳腺癌治疗监测[37]。
尤其是在结直肠癌中，DNA异常甲基化检测已变得相对较为成熟。血液中Septin9甲基化检测首先被美国食品药品监督管理局批准用于结直肠癌的筛查。在中国人群中对结直肠癌患者进行术前Septin9甲基化检测，结果提示Septin9甲基化诊断敏感性显著高于癌胚抗原（CEA），并随肿瘤分期增加而升高，尤其是在区分局部与转移性结直肠癌方面具有良好的能力[38]。另外，Septin9甲基化检测可监测结直肠癌患者术后的复发，术后检测阳性的患者表明预后不良[39]。因此，建议Septin9甲基化检测纳入结直肠癌高危人群的常规检测项目，以帮助实现结直肠癌高危人群的早期诊断。
五、DNA异常甲基化临床研究方向
肺癌具有发病率高、致死率高的特点，早期肺癌可通过手术达到完全治愈的可能，故肺癌的早诊断早治疗一直是研究的重点。DNA异常甲基化是表观遗传学的重要内容，在不影响DNA遗传序列的情况下，调控基因表达过程，其在肺癌的诊断、预后评估、疾病监测和个体化治疗方面的作用逐渐被发掘。随着高通量测序的发展，越来越多的组织DNA异常甲基化被发现，在血液、痰液、肺泡灌洗液、尿液等体液中检测肺癌特异性DNA异常甲基化改变的证据也在逐渐积累，未来努力的方向在于通过大量的临床样本验证特异性的DNA异常甲基化的临床实用性以及实施更多的临床试验验证DNMTs抑制剂联合传统肺癌治疗方案的临床有效性。DNA异常甲基化助力肺癌精准医疗指日可待。
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