环状RNA过表达的方法学研究与临床价值
崔敬宜，目前就读于北京协和医学院，攻读临床检验诊断学专业博士学位。主要从事环状RNA（circRNA），微小RNA（microRNA）等非编码RNA在肿瘤中的功能及分子作用机制研究，以及环状RNA新型成环技术，为环状RNA在疾病中作为分子标志物及其功能研究提供了新的实验策略，参与发表SCI论文4篇。
环状RNA（CircRNAs）是由前体RNA反式剪接产生的共价闭合环状结构单链RNA分子。初期，由于分析RNA测序数据方法的限制，环状RNA很大程度上被忽视。随着高通量测序以及三代测序技术的发展，越来越多的环状RNA被发现和研究。环状RNA具有基因特异性和组织细胞特异性[1, 2]，参与许多生物过程并发挥重要作用[3]。近年来，研究表明环状RNA可以作为miRNA海绵的功能来调节下游靶基因的功能[4, 5]。环状RNA还可以与RNA结合蛋白相互作用[6]以及翻译多肽或蛋白质来参与调节转录[7]，神经元发展[8]、细胞周期控制[6]、肿瘤发生和化学抑制等生物过程[9, 10]，然而大多数环状RNA的功能仍然不明确。尽管少数环状RNAs在细胞中高度表达，但是大多数环状RNA丰度较低[11]。因此，过表达目的环状RNA的方法（功能获得性研究）是研究它们生物学功能中必不可少的一个工具。
目前已经有研究证明了一些顺式和反式作用元件可以调节环状RNA的生物合成[11]，已经有一些策略用于过表达环状RNA[12, 13]。首先，互补的序列介导的环状RNA过表达是一种经典策略[14, 15]。其次，利用二聚体蛋白介导环状RNA也被发现可以促进RNA的环化，例如在侧翼内含子中插入Quaking蛋白的RNA结合基序有助于环状RNA的生物发生[16]。此外，基于核酶的剪接机制也被用来过表达环状RNA[12]。但是，这些方法存在一些问题，例如过表达效率低下，载体构建耗时和复杂。而且在过表达环状RNA的过程中会引入额外的RBP表达或线性转录本，这会限制了它们在环状RNA中的功能研究以及应用。因此，目前仍然需要简便，高效，准确的CircRNA表达系统。本文将结合相关研究，总结目前几种常见的过表达环状RNA的方法。
一、环状RNA分子特性及形成机制
环状RNA的形成是前体RNA通过反向剪接的方式，使5'端和3'端序列首尾相连。环状RNA没有5'端帽子结构和3'端poly（A）尾巴，比线性RNA更稳定，不易被RNA核酸外切酶或RNase R降解。环状RNA种类丰富，进化保守，表达具有时空特异性和疾病特异性。目前，环状RNA被分为五类：外显子circRNA：来源于线性转录母本的外显子，主要定位于细胞质中；内含子circRNA：来源于线性转录母本的内含子，主要在细胞核中富集；反义circRNA：来源于线性转录母本的互补链；外显子-内含子circRNA：来源于单个基因位点的相近转录母本；基因间circRNA：来源于两个基因的间隔区[11]。
环状RNA的发生不仅依赖于经典的剪接性位点，同时还依赖于经典的剪接机制。反向剪接的剪接信号和剪接体与经典的RNA剪接的类似，反向剪接与经典的RNA剪接具有一定的竞争关系[17]。当pre-mRNA可变剪接事件减慢时，RNA的反向剪接事件就会增多。反向剪接的假说主要是下游剪接位点与上游剪接位点连接形成闭合环状RNA分子，这主要通过反向重复元件（例如Alu元件）之间的碱基对[18]、RBPs的二聚体或RBPs与侧翼内含子中的特定基序结合使下游剪接给体位点（SD）与上游剪接受体位点（SA）接近，也就是通常所说的内含子配对驱动环化和RNA 结合蛋白驱动环化。其次，外显子跳跃所形成的套索驱动环化也是环状RNA生成的一种机制。此外，剪接过程中从分支结构脱离的内含子套索也会产生环状RNA。
二、环状RNA形成的调控因素
目前研究发现环状RNA的形成是受多个因素调控的[19]，包括异质性核糖核酸蛋白（hnRNPs）和SR蛋白（即含有长重复丝氨酸和精氨酸的蛋白）的顺式作用元件和反式剪接因子的联合作用[20]。还有一些蛋白分子会参与环状RNA的调控，比如，ADAR（防止先天免疫系统激活功能的双链RNA特异性腺苷脱氨酶）通过与双链RNA结合将腺嘌呤核苷编辑为次黄嘌呤核苷，以及依赖ATP的RNA解旋酶A（也称为DHX9）通过反向重复之间碱基配对抑制环状RNA的生物发生[1, 21, 22]。另外，长侧翼内含子、反向重复元件（如Alu元件）[23]和反式RNA结合蛋白（RBPs；例如RNA结合蛋白FUS）、震动蛋白（HQK）、NF90和NF110，这些均是白细胞介素增强子结合因子3基因的蛋白产物，它们都有助于反向剪接[16]。组蛋白和基因体的表观遗传变化会影响选择性剪接，也可能会造成对环状RNA的生物发生的直接影响。比如近期的一项研究就表明DNMT3B作为DNA甲基化维持所必需的关键甲基转移酶[24, 25]，对其敲低后发现环状RNA表达发生变化，而这些变化与相应的线性宿主基因表达的变化无关。
三、常见的过表达环状RNA方法
根据内源circRNA环化的原理，研究侧翼内含子序列、蛋白等对环化的促进或抑制作用，构建过表达载体，可以为环状RNA在体内的功能研究提供一个强有力的工具。
1. 经典侧翼序列介导成环的过表达载体：这类过表达载体包RNA序列和反向互补的侧翼序列来促进环化剪接，转染到细胞中可以主动促进成环。互补序列可以发生在重复元件中，例如Alu元件，可以通过挑选上游内含子的一个区域，并将其反向插入环状RNA的下游来创建互补序列。
对于不同的环状RNA，可以将其自身的上游和下游侧翼序列（通常取200-1000nt）与circRNA序列分段克隆，构建在真核表达载体上。为了构建更通用的过表达载体，侧翼序列通用框架被构建并不断被优化。Liang[14]等分析了circ-ZKSCAN1侧翼序列对成环的影响，删除简化序列后得到上游87nt加下游59nt的成环框架序列，使用pcDNA3.1（+）构建了一个包含酶切位点的通用载体。该载体可以直接通过一步酶切连接反应将目的circRNA序列构建到载体侧翼通用框架中过表达。Dieterich[26]等构建的环状RNA过表达通用载体主要由三部分组成：可反向互补配对的上下游内含子（~800bp），以及RNA环化序列，其两侧保留可供剪接识别的特异性内源侧翼基因组序列（每个约200bp）和多嘧啶序列（PPT）。上游内含子片段和下游内含子片段在转录后通过反向互补配对形成稳定的RNA发夹结构促进环状RNA的环化。通过将目的circRNA的环化序列插入到MCS中互补的内部序列之间，该载体可以用于表达几乎任何环状RNA。该过表达载体实现了比传统克隆更高的环状RNA表达，比内源性水平高400-5000倍，转化效率超过55%，副产物很少。此外，各种商品化通用过表达载体相继推出。
这种方法构建方法简便，是目前最常用过表达环状RNA的方法。但通常导致环状RNA剪接位点的随机插入。此外，该过表达载体转染入细胞中会导致线性转录本和环状RNA共同产生，理论上应该对产生的线性和环状转录本的数量进行实验评估，并谨慎解释实验数据及实验现象。
2. 基于核酶构建的环状RNA过表达载体：核酶（ribozyme）是指具有催化功能的小分子RNA[27]，可以降解特异的RNA序列。自剪切核酶一般可以产生5'端的游离羟基和3'端的2',3'-环磷酸酯结构，RtcB可以将其连接。Jaffrey[28]等在2015年就曾经报道设计了基于tRNA的环状RNA过表达体系（tricY），tRNA加工成熟的过程中内含子区域可以借助RtcB实现自连环化[28]。Jaffrey[29]等随后在2019年提出一种更高效的核酶过表达载体（Tornado），该技术是基于具有自剪切功能的核酶Twister核酸酶，实现待环化序列的上下游切割，依赖内源的RNA连接酶RtcB连接，但最终的产物包含了待环化序列以及为实现环化而携带的连接序列[29]。
I组内含子是可以进行催化自我剪接的核酶[30, 31]。它们广泛分布于真菌和植物线粒体的DNA中，也被发现于四膜虫和其他低等动物的核rRNA基因中。1992年，Puttaraju和Been[32]首次报道使用“PIE”方法利用I组内含子自我剪接的催化活性将RNA环化。在正常情况下，内含子剪接后，外显子连接，内含子环化。在排列的内含子中，外显子环化，出现分裂的内含子[13]。这种内含子-外显子排列（PIE）的剪接策略由融合的部分外显子组成，两侧是分开的内含子序列。“PIE”方法使用的I组内含子分别来源于耐热四膜虫和鱼腥藻前体RNA，I组内含子在体外自剪接从而使RNA环化。从机理上讲，“PIE”方法是基于在正常的I组内含子自剪接反应中发生在指定剪接位点的两次酯交换反应[30, 31, 33]。第一次酯交换反应导致PIE结构的3'端序列（5'端内含子）的释放。在第二次酯交换反应中，新生成的3'端外显子的游离3'-OH基团攻击3'端的剪接位点，导致环状RNA和3'端内含子的释放[32]。通过将环化序列插入在与PIE的外显子片段对应的两个短片段（E1和E2）之间，可以在体外高效的合成目的环状RNA。这种方法的一个限制是不可避免地在RNA环化连接位置将外显子短片段（E1和E2）引入新生成的环状RNA中，这将限制在基因疗法中合成对外来序列敏感的CircRNA和RNA纳米颗粒，以及合成准确的内源性环状RNA序列[34]。Rausch[35]等对这一限制进行了规避和优化，通过在PVT1外显子中寻找与E1-E2序列一致的片段并对成环序列进行重新排序，用circPVT1内部的片段代替E1和E2从而生成不带有冗余序列的内源性环状RNA——circPVT1。
总之，基于核酶构建的过表达载体的表达一般较为高效，稳定。研究发现，通过将核糖体进入位点构建至基于核酶构建的环状RNA过表达载体中，可以促使环状RNA高效稳定地翻译蛋白，这也开创了外源性环状RNA在真核生物中表达蛋白的先例，为环状RNA的新应用奠定了理论基础[34]。
3. 基于二聚体RNA结合蛋白过表达环状RNA：该过表达环状RNA转录本的方法是将特定RBPs的结合域包含在侧翼内含子中以促进RNA的环化，其他过表达环状RNA方法是把成环序列构建到质粒中，将外源的序列导入细胞中，Qi[34]等用人工设计的ECRRs蛋白可以从细胞自身的转录组上促进环状RNA的表达以更好的模拟细胞内情况。ECRRs蛋白是由特异性识别RNA单碱基的PUF结构域（human Pumilio1）与可以形成二聚体的功能结构域融合在一起，拉近剪接位点从而促进环状RNA的形成。通过利用ECRRs在细胞中过表达Circ10720和CircBIRC6，证明了该载体可以特异性地促进内源CircRNAs的产生。这种方法避免了过表达环状RNA时线性转录本的引入，但是会额外引入RNA结合蛋白在细胞中的表达[16]。
四、展望与问题
随着高通量测序技术、三代测序技术以及生物信息学分析的进步[36, 37]，越来越多的环状RNA被发现和研究。环状RNA由于其共价闭合环状的结构，缺少核酸外切酶介导降解所必需的末端，因此与线性RNA相比，环状RNA的半衰期更长，稳定性高，且不易被核酸外切酶降解。在某些应用方面，环状RNA比线性RNA更有优势。环状RNA可作为疾病生物标志物或新型RNA治疗靶点[38]，在基因工程和开发疫苗方面也具有很大潜在应用价值[39, 40]。然而，环状RNA由于其形成的复杂性和表达的多态性，对其过表达有很大的难度。基于上述，这就要对环状RNA的过表达方法提出了更高的要求。高效、通用、准确和简便地表达环状RNA仍然是我们追求的目标，对环状RNA的成环机制还需进一步深入研究。
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