新型冠状病毒核酸检测质量控制关键点与经验分享

高会霞，硕士、主任检验师、市管拔尖人才。现任石家庄市第五医院检验科质量及临床试验负责人。主要研究方向是病原微生物学检验、耐多药结核菌耐药基因检测、各类病原体基因检测、生物安全等领域，先后开展20余项新技术。2020年接受国家级的GCP培训，参加临床检验试验30余项，作为主要研究者10余项 。主持承担15项科研课题，获河北省科学技术二等奖1项，河北医学科技奖1等奖3项、2等奖3项，发表论文50余篇，其中SCI论文11篇。出版学术论著2部。获国家实用发明专利2项。    

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新型β属冠状病毒，属于单链 RNA病毒，于2019年12月底首次被发现，可导致新型冠状病毒肺炎（COVID-19）[1]。由于其高度传染性，它在短短几个月内就发展为全球大流行。由于病毒不断变异，特别是高传染性德尔塔、奥密克戎变异株的出现，导致世界各地感染人数居高不下，截止目前全球感染人数已达5.02亿、死亡人数621万[2]。国内规模性疫情与散发疫情交织，部分地区疫情仍在高位运行，疫情防控形势依然严峻复杂。国内疫情防控的主要措施是动态清零，日常对重点人群进行核酸筛查，局部有疫情暴发采取全员核酸检测[3]，在此过程中，核酸检测发挥至关重要的作用。然而，各地经常出现核酸检测结果假阳性、假阴性等事件发生，给防疫工作造成一定的负面影响。本文结合本单位实验室核酸检测的经验与教训、处置当地核酸假阳性与假阴性事件经历，结合有关文件、指南及文献，针对典型假阳性及假阴性事件进行深入剖析，总结出保证新型冠状病毒核酸检测质量的关键点，旨在与各位同道分享，以利于提高新型冠状病毒核酸检测结果的准确性，避免乌龙事件的发生。

一、典型案例分析

1. 案例一事件经过：2021年1月石家庄藁城区疫情期间，某定点医院组织全院职工检测新型冠状病毒核酸，其中有6名本院职工的新型冠状病毒核酸单基因或双基因弱阳性。采用另一种试剂在该院另一个PCR实验室进行复核，结果均为阴性。立即组织对这6名职工重新采集鼻咽拭子标本，每人两份标本。一份留本院检验科检测，另一份送市疾控中心检测，两份检测结果均为阴性。经综合研判，此6名职工初检结果为假阳性。

案例一原因分析：①疫情期间，该实验室检测出大量新型冠状病毒核酸阳性标本，而且阳性标本病毒浓度很高。在这期间，实验室还承接了本市全员核酸检测任务，实验室使用的频率高，几乎24小时不停运转，不能保证充分的消毒及通风换气，存在气溶胶污染可能性很大。②医疗废弃物堆积未及时转运出实验室，PCR扩增产物可能对实验室造成污染。

2. 案例二事件经过：2021年1月石家庄藁城区疫情期间，某定点医院对本院职工进行新型冠状病毒核酸筛查，第一次检测时李某等10人内标基因未出现扩增曲线，为无效结果。该实验室重新提取核酸复检，李某的结果显示双基因（ORF1ab基因Ct值38.96、N基因Ct值36.78）阳性，其他9人的检测结果均为阴性。将李某的原始标本送到市疾控中心复核，结果也为阳性。因该职工无流行病学史、无任何症状，第二天重新采集该职工鼻咽、口咽、肛等三个部位的标本分别用中山达安、上海伯杰、湖南圣湘（快检）等三种试剂进行核酸检测，结果均为阴性。送市疾控中心复检也均为阴性。

经综合研判，该职工第一次的初检结果及市疾控中心第一次复核结果均为假阳性。

案例二原因分析：①首次送检标本在实验室内进行了两次核酸检测，同批次检测标本中均有高浓度新型冠状病毒核酸阳性标本，而且两者位置很近，该实验室采用全自动开帽加样系统，有可能在开盖取样过程中阳性的标本污染该标本，造成标本间交叉污染。②该标本与阳性的标本放在一起保存，如果标本有溢洒，也有可能导致标本间交叉污染。

3. 案例三事件经过：2021年2月，某综合医疗机构在对普通住院患者进行新型冠状病毒核酸筛查时，有4名患者新型冠状病毒核酸检测结果均为仅E基因阳性，ORF1ab和N基因均为阴性，遂报告新型冠状病毒核酸检测结果阳性，并同时送市疾控中心复检，但复检结果为阴性。

案例三原因分析：①该实验室所采用的新型冠状病毒核酸检测试剂盒说明书有关结果判定标准明确指出：仅有ORF1ab基因（-）、ORF1ab基因（-）且N基因（+）、ORF1ab基因（-）且E基因（+），需要重复测定，若ORF1ab基因（+）且E基因（+）和或N基因（+），则判为2019-nCoV阳性；其他情况均判为“可疑”，需隔期复查。检验人员没有严格按照试剂盒说明书判定结果、没有对需要重复测定的样本进行复测。②实验室仅有一种新型冠状病毒核酸检测试剂，未准备复核试剂用于主试剂初检可疑阳性标本复核。

4. 案例四事件经过：2021年6月，在重点人群筛查时，某实验室对332份标本（10合1混采）采用中山达安试剂（检出限≤30）进行新型冠状病毒核酸检测时，其中有一管结果显示双基因弱阳性（ORF1ab基因Ct值27.98、N基因Ct值26.70）如图1所示。中山达安试剂（检出限≤40）复检结果：ORF1ab基因Ct值37.89、N基因阴性；复星试剂（检出限≤36）复检结果：ORF1ab基因Ct值34.996、N基因Ct值32.035、E基因阴性。将原始标本送到市疾控中心复核结果为阴性，紧急采集10人标本（单采）进行检测，本院及市疾控中心核酸检测结果均为阴性。经综合研判，该实验室的初检结果为假阳性。

图1. 10合1混检标本扩增曲线

案例四原因分析：①实验室的阳性质控品是试剂盒自带的强阳性质控品，有可能污染样本核酸。②现场查看该实验室的原始扩增曲线为翘尾，实验室人员对扩增曲线的认定把关经验不足，业务水平有待进一步提高。③该实验室复检阳性，同一份标本市疾控中心复检阴性，说明实验室可疑阳性标本的复检流程存在不足，应该进一步优化。

5. 案例五事件经过：2021年2月，某卫生院对职工进行新型冠状病毒核酸检测（10合1混采）时，其中1管为阳性，复检也为阳性。随即对此10人单采单检，采用中山达安试剂（检出限≤30）进行检测，发现仅有刘某某的标本ORF1ab基因Ct值27.94，N基因阴性如图2所示，其余9人均为阴性。采用上海伯杰试剂复检为阴性。将10合1混采管和10份单人单采管送市疾控中心复核，达安和伯杰试剂检测结果均为10合一混采管阳性，10人单采管均为阴性。经综合研判，该实验室的10合1混采管初检及疾控中心复核结果均为假阳性，刘某某单采标本初检结果为假阳性。

a b

图2：刘某某单采标本扩增曲线（a：原始荧光曲线；b：扩增曲线）

案例五原因分析：①10合1混采标本采集场所与疫苗接种混用，间隔时间不足24小时，物体表面（桌面）采样后检出新冠肺炎病毒核酸。可能标本采集时被疫苗污染。②单采时，刘某的新型冠状病毒核酸扩增曲线不典型，斜直型曲线，而原始荧光曲线无起峰，检验人员判读结果经验不足、没有认真分析扩增曲线，仅凭ORF1ab基因Ct值27.94误判为阳性。

6. 案例六事件经过：9月26日至10月12日期间，郭某曾在内蒙古额济纳旗天鹅湖项目部工作与生活，该工地有很多工作人员感染新型冠状病毒。10月13日从内蒙古额济纳旗（高风险区）返回原居住地石家庄市，10月22日，郭某主动向社区居委会报备其有过内蒙古额济纳旗旅居史，并主动去某医疗机构进行核酸检测，结果为阴性。转运至集中隔离点，10月31日，核酸检测结果呈阳性，当日由120负压救护车转运至定点医院，诊断为新冠肺炎确诊病例（轻型）。11月1日核酸检测结果N基因Ct值38.33阳性，ORF1ab基因阴性，复核结果相同。10月22日进行新冠核酸检测阴性，但在10月13日-22日期间他的邻居、同事感染新型冠状病毒，所有流行病学调查结果均指示他是传染源，经综合研判，郭某的10月22日核酸检测结果可能为假阴性。

案例六原因分析：标本采集的时机不合适，标本采集时间过晚。病人感染早期（7天内）病毒含量最高，郭某10月13日返回石家庄时已经携带了病毒，至10月22日进行核酸检测时，已经错过最佳检测时期，造成假阴性。

二、假阳性发生的常见原因及解决策略

1. 假阳性发生的常见原因：（1）标本污染：标本之间的交叉污染（如加样器污染、手套污染、自动开帽机抓手污染等）；（2）气溶胶污染：扩增产物遗留污染；（3）试剂污染或者是阳性对照（试剂盒自带）污染了样本的核酸、扩增体系等。

2. 解决策略：设施：（1）实验室的合理分区是预防扩增产物污染引起检测结果假阳性最基本的硬件，各区独立，单一工作流向。（2）实验室通风是极其重要的预防假阳性的有效措施，负压实验室必须保证各区的压力差合理。（3）所有消耗品使用前均应保存在洁净区域（如试剂准备区或库房，不能放在标本制备区和扩增区）。

3. 清洁消毒：（1）加样器用后，先用0.2%含氯消毒剂擦拭表面，尤其是与吸头接触部位，然后再用70%乙醇擦拭。（2）每一次检测后，有阳性尤其是较多阳性标本检出时，用0.2%含氯消毒剂擦拭实验台和地面等，最后用清水擦拭。（3）各区清洁用具必须专用。（4）所有试管架每次用后，用0.2%含氯消毒剂擦拭或喷雾清洁。（5）每批检测后，清洁仪器设备（提取仪、离心机、扩增仪等）。（6）每批检测后，实验室紫外线照射2小时，可使用移动紫外灯。

4. 加样：（1）标本加样时，使用带滤芯枪头加样。（2）加样过程中避免加样器头部污染，采用加样器清洁流程进行清洁。（3）检测过程中，如发现手套污染立即丢弃，更换新的手套。

三、假阴性发生的常见原因及解决策略

1. 假阴性发生的常见原因：（1）试剂敏感性低；（2）标本保存、运输和处理不当，新型冠状病毒核酸降解；（3）标本质量不合格，未采集到合格的细胞。（4）样本采集时间过早或过晚[4]。

2. 解决策略：（1）选用敏感度高的试剂；（2）试剂与提取仪、扩增仪相配套；（3）标本按要求保存、运送、处理；（4）采集人员必须是经过严格培训和考核的医务人员，采集到合格标本。（5）弱阳性质控品的Ct值波动监控：对室内质控品Ct值波动范围进行控制，假设Ct值均值是36，那么Ct值应波动在34.5-37.5之间，若波动范围太大，反映实验室检测体系重复性差，超过此范围就要加倍警惕，特别是超过37.5，意味着本批次检测灵敏度下降了，把阳性标本误判为阴性的可能性增加，要分析引起灵敏度下降的原因（提取原因、扩增效率原因、试剂效能下降、操作不当等等），并及时纠正，必要时本批标本要重新检测。（6）内标Ct值监控：同一批实验中，个别标本的内标Ct值明显高于其他标本或未检出，可能采集到细胞量少，有可能漏检，应重新采集标本复测，避免漏检。（7）采集多种类型的标本[6-7]。

四、保证新型冠状病毒核酸检测质量的关键点

1. 标本采集及送检的质量控制：（1）采集人员：医务人员熟悉标本采集方法并经过培训，建议48小时内未参加疫接种工作。（2）采集场所：具备通风条件独立空间，不能与疫苗接种点共用。（3）标本的保存及送检：标本采集后室温放置不超过4小时，应在2-4h内送到实验室。放到标本转运箱内，运送时采样管保持直立状态。6小时内上机检测。

2. 试剂及设备的质量控制：（1）试剂要求：主试剂选用高灵敏的试剂，至少2个靶标（ORF1ab、N），检测限不低于500拷贝/ml；复核试剂灵敏度不低于主试剂，基因靶点的位点尽量与主试剂有差异[5]。（2）设备要求：核酸提取试剂应与核酸提取仪配套使用，并选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。所有设备应经过必要的检定/校准，建立仪器设备使用、维护、检定校准的程序文件，并按照程序文件严格执行。（3）性能验证：临床标本检测前，实验室对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证。

五、实验室检测过程中的质量控制

1. 核酸提取：标本开盖加样应在生物安全柜双人操作，标本加样前充分震荡洗脱对保证阳性样本的检出至关重要。

2. 试剂的准备与配置：（1）PCR反应体系现用现配，加样量准确。（2）每种试剂使用前要完全融化，充分振荡混匀，进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底。应避免反复冻融，不同批号试剂不能混用。

3. PCR反应体系的配制：（1）加入提取核酸样本时底部不要有气泡。（2）加样顺序：3个阴性对照（二区及三区各一个环境监控对照，加一个阴性对照随机放至样本中）、样本、阳性对照。（3）复检：结果如果需要符合，应重新提取核酸，由科室最有经验人员完成一区、二区和三区的全程操作。如怀疑存在实验室污染，最好重新采集标本由同一实验室复测或与其他实验室进行平行检测。

4. 室内质控：（1）每批检测至少有一份弱阳性质控（第三方质控品，通常为检出限的3-5倍）和3份阴性质控品。质控品随机放到临床标本中，参与提取到扩增的全过程。（2）不建议使用试剂盒自带的强阳性质控，强阳性质控品的浓度高达检出限的200倍以上。一是容易造成污染，二是起不到监控检出限的作用（3）质控品应避免反复冻融。最好将配好的质控品分装，低温保存，每次取一管，一次性用完扔掉，不再重复使用。此方法可以很好地防止因为质控品本身不稳定导致的Ct值波动。

5. 室间质评：定期参加国家级或省级临检中心组织的室间质评。

6. 结果判读：检测样品在FAM和VIC通道Ct值≤检出限且有明显的扩增曲线及原始荧光曲线起峰明显时判读为新冠核酸阳性。不典型的扩增曲线如斜直线型和翘尾型扩增曲线易误判为阳性，引起斜直线型扩增曲线的原因主要是分液不准确或反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加所致。为了避免这些问题出现，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上、八连管盖是否盖严无缝隙。翘尾型扩增曲线通常表示标本可能存在污染、样本浓度低或者加样量不准确等，建议对同一份标本重新提取核酸复检或重新采集标本复检。

六、总结与分析

综上所述，核酸检测是诊断新型冠状病毒肺炎的金标准[8]，各新型冠状病毒核酸检测实验室应按照国家指南的基础上，根据自身条件对新型冠状病毒核酸检测全过程进行严格的质量控制及合理的优化，避免假阳性、假阴性报告发出，提高核酸检测的准确性，为疫情的防控提供有力技术保障。同时，增加抗原检测作为补充[9]，进一步提高“早发现”能力，提高检测效率。

参考文献

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