全自动血细胞形态分析仪在血常规复检工作中的应用

袁慧，教授、博士研究生导师。现任首都医科大学附属北京安贞医院检验科主任。主要学术兼职：中国中西医结合学会检验分会委员、北京中西医结合学会检验分会副主任委员、北京医学会检验医学分会常务委员、北京医师协会检验医技师分会常务理事、中国医院协会临床检验专业委员会常务委员。主持国家自然科学基金项目、北京市科委培育项目 、教育部重点实验室开放研究课题等。以第一或通讯作者发表文章50余篇。

卢丹，首都医科大学附属北京安贞医院检验科主管检验师，硕士研究生、主治医师；北京中西医结合学会检验分会委员；从事血液学检验及血细胞形态学的临床、教学、科研等工作。

【摘要】目的 探讨低值血小板样本复检策略，评估全自动血细胞形态分析仪低值估算技术在血小板计数复检中的适用性。方法 收集120例血常规检测中血小板计数＜100×109/L的样本（PLT-I方法），分别立即使用PLT-O方法、全自动推片机推片+全自动血细胞形态分析仪阅片方法、手工血小板计数方法检测血小板计数。以手工计数方法为金标准，评估 PLT-I、PLT-O、全自动血细胞形态分析仪自动估值、全自动血细胞形态分析仪手动估值的准确性。结果 （1）对于镜下未见血小板聚集的87例样本，全自动血细胞形态分析仪自动估值、手动估值、PLT-O检测结果与手工计数方法相关性高（相关系数分别为0.986、0.973和0.990）；（2）对于血小板微聚集簇（每簇聚集含血小板个数≤5）的样本，全自动血细胞形态分析仪自动估值、手动估值、PLT-O方法与手工计数方法相关性好（相关系数分别为0.912、0.875和0.821）；（3）对于镜下出现血小板明显聚集簇（每簇聚集含血小板个数＞5）的样本中，有2例样本可经PLT-O方法获得准确数值外，另外6例样本均需采取更换抗凝剂、手工计数血小板等方法获得更为准确的血小板数值；（4）对于存在小红细胞、红细胞碎片等干扰的样本，PLT-O法与显微镜计数法相关性最高。结论 全自动血细胞形态分析仪的血小板自动估值功能可应用于无血小板聚集及血小板微聚集簇的低值血小板样本复检。

【关键词】低值血小板样本；复检；全自动血细胞形态分析

血小板计数是临床上最常用的检验项目之一，对许多出凝血性疾病、血液病及风湿免疫性病的诊断、治疗及监测有重要作用，同时也是血小板其他参数准确计算的基础，因此，血小板检测结果的准确性至关重要。目前，全自动血细胞分析仪计数血小板的原理多数为电阻抗法，其计数正常形态的血小板有较好的准确性和重复性，但易受到细胞碎片、小红细胞、大血小板、血小板聚集及细菌等非血小板颗粒的影响[1-2]。当前低值血小板计数的准确性越来越受到临床医生的关注[3-4]，因此，如何通过常规检测方式获得更为准确的数值是检验科迫切需要解决的问题之一。迈瑞公司生产的MC-80全自动细胞形态学分析仪是模拟人工显微镜阅片工作的形态学分析系统，能够自动识别外周血中白细胞、红细胞、血小板及其他成分，并能进行预分类、提供血细胞图片和血小板自动估值、手动估值。本文以手工计数血小板作为参考方法，研究全自动血细胞形态分析仪自动估算、手动估算血小板方法及PLT-O方法与手工计数法结果的相关性，探讨低值血小板样本的复检策略。

一、研究对象与方法

1. 研究对象：选取2022年3月-2022年5月北京安贞医院检验科血常规样本，使用EDTA-K2抗凝管采集的静脉血2ml。经过BC-6800plus全自动血细胞分析仪检测，收集血小板计数＜100×109/L的样本120例。

2. 仪器与试剂：BC-6800plus血液分析仪（深圳迈瑞公司），自动涂片染色仪（深圳迈瑞公司），全自动血细胞形态分析仪（深圳迈瑞公司），显微镜（尼康公司）。各仪器均使用配套试剂及质控品。染液使用瑞-吉姆萨染液（珠海贝索公司）。

3. 研究方法：仪器及样品准备：在进行样本检测前，对BC-6800plus血液分析仪进行高、中、低3个水平质控品的检测，结果在控后开始样本检测。取静脉抗凝血样本，充分混匀后，在BC-6800plus血液分析仪自动模式下检测全血细胞参数。选取血小板计数＜100×109/L的样本，每份样本检测2次后取均值。所有样本在采集后4小时内完成检测。全自动涂片机制片、染色。全自动血细胞形态分析仪阅片。染色完成的外周血涂片自动进入全自动血细胞形态分析仪进行阅片，经人工核对每个视野中的血小板计数后，记录其自动估值、手动估值两组数值。手工血小板计数，取0.38ml草酸铵稀释液加20μl全血混匀[5]，充池，静置15分钟。由2位主管检验师完成手工显微镜血小板计数，取2人手工计数结果的平均值（误差＜5%）。

4. 数据统计及处理：采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料结果采用X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、研究结果

1. 经人工形态学阅片检查：样本的具体形态学表现如表1所示，血小板形态正常且无红细胞碎片、小红细胞干扰样本87例；血小板聚集的样本20例，其中血小板微聚集簇样本12例，明显聚集簇样本8例；大血小板、巨大血小板样本10例，红细胞碎片样本1例，小红细胞样本2例。具体分布见表1。

表1. 样本分布表

2. 全自动血细胞形态分析仪自动估值法、手动估值法、PLT-O法与人工镜检法计数结果相关性分析：对于血小板和红细胞形态均正常的标本，全自动血细胞形态分析仪自动估值法、手动估值法及PLT-O法均与人工显微镜计数结果呈正相关性（r＞0.95）。出现大血小板、巨大血小板等异常形态时，全自动血细胞形态分析仪自动估值、手动估值方法与人工显微镜计数法结果呈正相关性（r＞0.9），这与PLT-O法呈正相关性（r=0.881）。对于出现小红细胞、红细胞碎片等干扰样本，PLT-O法与人工显微镜计数法的相关性最高（r＞0.9），全自动血细胞形态分析仪计数方法与人工显微镜计数法的相关性较PLT-O法略低。对于出现血小板微聚集簇（每簇聚集含血小板个数≤5个）时，全自动血细胞形态分析仪自动估值法与人工计数方法相关性最高（r=0.912），其次为手动估值方法。血小板明显聚集簇的8例样本中，全自动血细胞形态分析仪自动估值、手动估值均无法获得准确数值，其中2例样本经PLT-O计数与手工显微镜计数方法的数值相关性好，另外6例PLT-O方法未能获得准确数值。

表2. 三种试验方法与人工镜检法计数结果的相关性分析（r值）

三、分析与讨论

血小板的结果容易受自身生理特性、疾病以及检验环境等多种因素影响，导致全血细胞分析仪检测结果出现假性增高或假性减低的情况，所以仍需探索更多精准计数血小板样本的检验方法。对于低值血小板的计数，不同仪器、不同方法学原理所得到的结果之间存在差异。近年来，随着人工智能图像识别技术的发展，越来越多的自动阅片设备应用于临床，在血常规复检、异常细胞定性识别方面获得了一致认可，但用于血小板定量计数方面的应用及研究较少。

MC-80全自动细胞形态学分析仪是由照相装置和细胞形态学分析软件组成的自动化数字细胞形态学分析系统，可通过标准化的程序辅助人工镜检。对血涂片单细胞层定位、扫描后获得设定区域内细胞图像，进行白细胞预分类，红细胞形态评价分类，还可以进行血小板计数。其血小板计数方法包括2种：自动估值和手动估值。“自动估值”的原理为细胞形态分析仪自动提取全血细胞分析仪中红细胞计数的数值，根据视野中血小板和红细胞数量的比值，进而自动计算血小板数量；“手动估值”的原理为根据MC-80提供的红细胞观测区（一般为8个高倍镜视野的面积，也可以手动设置观测区的大小），此观测区等分为9个面积相等的正方形，MC-80自动计数每个正方形内的血小板数量（可人工核查计数的准确性和修改），自动计算每高倍视野下血小板平均数，最后用平均数乘以血小板估算因子，即可得到血小板计数的“手动估值”数值。此外，MC-80会自动扫描涂片的边缘处和尾部等容易出现血小板聚集的部位，计数聚集簇的数量，并在白细胞分类页面中对血小板聚集情况进行提示。

本文通过对120例全血细胞分析仪血小板计数＜100×109/L的样本进行不同方法学复检结果统计分析，研究结果显示：存在血小板微聚集簇、大血小板、巨大血小板、小红细胞、红细胞碎片干扰的样本，MC-80的自动估值、手动估值均与人工镜检方法表现出良好的相关性；对于出现血小板微聚集簇的低值血小板样本，其自动估值法优于手动估值法；对于存在小红细胞、红细胞碎片等干扰的样本，笔者更推荐使用PLT-O进行复检。自动估值法与手动估值方法相比，运用于血常规检测和形态学复检时，笔者更推荐自动估值的方法。因为受制片因素影响，视野中的背景红细胞数目依然很难达到一致，手动估值法是由统一的估算系数计算得到血小板数值，而自动估值法是根据形态学分析中血小板数目与红细胞数目的关系，在提取了血细胞分析仪中的红细胞计数结果后换算得到，因此准确性更高。手动估值方法需要人工选择视野面积，并对每个视野中的血小板数目进行确认，因此较自动估值方法而言，手动估值方法耗费的时间略长。对于存在血小板明显聚集簇的样本，由于推片时聚集簇更容易分布在尾部和涂片边缘处，而不是阅片使用的体尾交界区，致使观测区计算的血小板数与红细胞数量不成比例，进而降低血小板的计算数值的真实性。

近年来，随着卷积神经元网络的发展，数字扫描成像、图像特征提取、多层模型训练的范式开发分析系统在血细胞、骨髓细胞识别领域得到了深度应用和推广[6-7]，有效缓解了此类检验项目对岗位经验要求较高的需求，彰显了人工智能技术在检验领域的巨大潜力。在使用全自动推片仪进行标准化制片的基础上，MC-80全自动细胞形态学分析仪利用图像识别技术可应用于正常形态血小板、存在微聚集簇血小板样本的计数和复检，而且还能同时直观的判断白细胞、红细胞形态，极大地提高了复检效率。对于血小板明显成团簇聚集，导致仪器血小板计数假性减低的样本，还需与临床医生及时沟通，在了解患者基础疾病及治疗过程的情况下，通过换抗凝剂、重新采血，或手工计数方法，为临床提供更加准确的检测结果。

参考文献

[1] Zandecki M, Genevieve F, Gerard J,et al. Spurious counts and spurious results on haematology

analysers: A review. Part I: Platelets[J]. Int J Lab Hematol, 2007, 29: 4-20.

[2] Baccini V, Geneviève F, Jacqmin H, et al. Platelet counting: ugly traps and good advice. proposals

from the french-speaking cellular hematology group (GFHC)[J]. J Clin Med, 2020, 9(3): 808.

[3] Jiang SQ, Huang QF, Xie WM,et al. The association between severe COVID-19 and low platelet

count: evidence from 31 observational studies involving 7613 participants[J]. Br J Haematol, 2020, 190(1): e29-e33.

[4] Cines DB, Levine LD. Thrombocytopenia in pregnancy[J]. Blood, 2017, 130(21): 2271-2277.

[5] 尚红, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 4版. 南京: 东南大学出版社, 2015．

[6] 张时民. 医学检验领域人工智能技术应用与展望[J]. 国际检验医学杂志, 2018, 39(5): 513-

516+520.

[7] 阳莎, 陈鸣. 人工智能在检验医学领域的应用与趋势[J]. 中华检验医学志, 2021, 44(3): 186-190.