新型冠状病毒全自动化核酸检测与流程优化

作者:李东 王学晶 2022-09-22
作者单位:北京民航总医院检验科

王学晶,主任医师,博士,北京大学医学部副教授,硕士研究生导师。现任民航总医院检验科主任。主持IFCC国际多中心子课题、首都临床特色应用研究、首都卫生发展科研专项、北京大学医学部教学课题、十三五子课题、北京市小分子重点实验室课题等。主要研究方向为肾脏和心血管疾病的实验诊断,参与起草、修订多项国家和行业标准。主要社会兼职:中国医院协会实验室管理委员会委员、中国老年医学会检验医学分会总干事、北京市医学检验质量控制和改进中心专家、北京医学会检验医学分会委员;《中华检验医学杂志》青年编委。


李东,硕士、副主任医师。现任民航总医院检验科微生物组组长。北京市医学会检验学分会青年委员。专业方向为分子诊断学专业。



2019年底暴发的新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)疫情传播迅猛,被世界卫生组织定为“国际关注的突发公共卫生事件”。截至目前为止仍严重的影响着人类健康,国内的疫情防控形势严峻,病毒在地区内和地区间的小规模播散不断。不断变异的病毒基因、逐步增强的传播力和尚不清楚的毒力,仍然是疾控人员、医务人员和人民群众面对的严峻挑战。我国人口基数大,老年人口数量多,部分地区的医疗资源相对不足,必须坚持“动态清零”政策不放松,不能采用西方的“躺平政策”,一旦防控措施松动,将可能引发严重的医疗资源挤兑以及一系列不良结果,甚至导致不可控制的局面。2022年以来,新冠病毒毒株以奥密克戎为主,传播力强;病毒感染者中普通型和轻症感染者占了大部分,无症状感染者比例也较之前有所增加,这部分人群更不容易被发现。高效、精准的核酸检测是发现病毒感染的唯一有效手段,也是实现“早发现、早诊断、早隔离、早治疗”的前提和基础。


在医疗机构的门户区域,包括发热门诊、肠道门诊、急诊室、儿科急诊等处进行预检分诊和严格流行病学调查非常重要,发热是SARS-COV-2感染的最常见症状,也是这些门户科室患者的非特异性表现。快速诊断或者排除新冠病毒感染以及精准防护,可为准确分流和及时救治提供了可靠的参考依据,争取抢救时间,降低传播风险。早在2020年下半年,《中华检验医学杂志》刊登了《医疗机构发热门诊临床实验室能力建设专家共识》,预见性地提出发热门诊实验室需要设立PCR实验室[1]。PCR实验室常规分为3~4区,分区设计主要是为了防止产物污染。由于基因片段被指数级复制,阳性样本以及阳性质控的片段,哪怕是微量的气溶胶,也可引起严重的实验室污染,影响病原学检测的质量和效率。通常情况下,在PCR实验室,完成一轮新冠病毒核酸检测需要耗时3~4小时。


国务院联防联控机制在《关于进一步加快提高医疗机构新冠病毒核酸检测能力的通知》中提到,要提高核酸检测的规范性和时效性,发热门诊患者的核酸检测要在6小时内报告结果,争取缩短至4小时[2]。在传统分区的PCR实验室以及新冠病毒核酸检测的特殊防护要求,在4小时出具核酸检测报告的时间比较紧张,尤其是需要复检时。新冠病毒核酸随来随检也较难实现。POCT设备完成一轮耗时较短,但其粗放的核酸提取和简约的扩增程序,让检验工作者用此方法检测发热患者有漏检的担忧。而在临床实践中,即使是4小时的等待,也是许多发热患者难以接受的时限,医疗结构因此所需配备的隔离病房数量也会增多。曾经有医疗机构就因患者在发热门诊等待检测结果期间,离开发热门诊到其他区域导致了疫情传播风险的案例。另一个较大的风险则来自于急诊科接诊“封管控区”患者时,危急的病情和较高的疫情风险随时考验着接诊医疗机构和医生的综合能力。面对发热门诊和急诊医生面对的疫情防控和医疗救治的诸多挑战,可以通过提高核酸检测效率来争取宝贵的时间,以快制快,迅速判定传播风险。


自动化分子诊断系统在疫情的压力下不断升级。根据自动化程度可分为两种模式,一种是半自动分子诊断系统,如M2000sp/rt。M2000sp/rt是由自动化样本加样提取(m2000sp)和实时荧光定量PCR扩增与检测(m2000rt)两部分组成,提取样本核酸后需要手动上机扩增;另外一类为全自动的分子诊断系统,可模拟手工操作的自动化检测系统,设计理念是将样本加样、全自动核酸提取工作站、实时荧光PCR仪整合在一台设备上,基本实现了“样本进,结果出”,是真正意义上的自动化、一站式。这种全自动分子诊断系统又分为板式全自动检测和管式全自动核酸检测。板式全自动分子检测仪器采用的是在一块样本板上进行批量提取核酸,体系构建完成之后再进行整板封膜,再进行整板扩增需要达到一定样本量进行检测。管式采用的是单独样本管(卡盒)进行独立的提取核酸,在扩增部分采用独立的温控模块,实现了单管流水线式的操作模式,同时可以检测RNA及DNA可实现单人份随到随检的全自动化检测,能够实现“实时上机”,类似于全自动生化免疫分析仪的工作模式。实验室可根据自身的硬件条件和检测规模进行选择。

本实验室于2022年初使用了一款安图生物公司生产的型号为AutoMolec 3000的全自动核酸检测设备,结合其优势,通过流程优化,使实验室新冠病毒核酸检测质量和效率得到大大的提升。


一、门户重点科室核酸检测TAT明显缩短


由于空间原因,很多医疗结构的新冠病毒核酸检测实验室与发热门诊实验室是分开的。我院购进的全自动分子诊断系统就安装在发热门诊实验室,安装需要15平方米的空间即可。这使得发热门诊患者的核酸检测中间环节明显缩短。之前发热门诊核酸样本也是优先检测的,随着日常检测的定时批次优先插入,2区提取,3区扩增、发放报告。安装这台设备后,改为随来随检,扫码上机和自动接收结果,不仅提高了效率,也避免了许多人为错误和检测延迟的发生。


样本随来随检,是这台一站式全自动核酸检测设备最大的优势。既可逐个检测,也可批量检测,最多一批可做60个样本,亦可急诊插入。第一个结果出现在进样后100分钟,之后每2分钟出一个结果。这种灵活的进样方式非常便利,我院在使用该设备后,发热门诊和急诊患者的样本完全做到了随来随检,这部分患者的核酸检测TAT时间由使用设备之前的4-6小时,缩短为了初筛100分钟,复检3-4小时内完成。这对于发热门诊接诊封管控区的患者和急诊室接诊危重症患者尤为重要。发热门诊属于高风险科室,医生需要迅速判定患者的风险,除了流行病学史、胸部CT和血常规等,核酸结果不出来患者不允许离开发热门诊。急诊室的风险在于危急重症的及时处理,尤其是手术,其传染风险低于发热门诊,但医疗风险大,也需要及时得到核酸结果以便按需防护。2022年4月北京发生疫情以来,我院发热门诊发现的5例阳性患者均采用了这台设备,在100分钟内快速准确的完成了初筛,在3~4小时内完成了复核。对于初筛阳性的患者,立即复采样本并对初采和复采样本同时复核。此间,提前准备运送区疾控中心实验室确诊的相关材料和包装,并对与该患者同时空就诊的患者以及接诊的医护人员按照相关流程进行防控处置,最终患者得到了及时确诊并转至定点医院,密接和次密接人员迅速落位管控,阳性患者行程轨迹迅速进行环境采样和消杀等,不仅快速切断了传播途径,为病情救治和下一步工作赢得了时间。我院圆满完成了5例阳性病例的相关防控流程,无停诊,未影响任何医疗工作,医患满意度也迅速提升。使用该设备前,催查核酸结果的电话不断,患者和家属投诉多,使用该设备后,急诊科、发热门诊和儿科发热门诊等门户区域的医生和患者对核酸检测时限的抱怨几乎消失,且满足了门诊办公室、医务处和医院感染控制办公室的一系列管理要求,真正解决了这些重点科室的急难愁盼问题。此外,由于仪器的自动化程度高,也减轻了检验人员的工作压力,夜班由2人减为1人,仅负责值守该设备,保证随来随检,节约了人力成本。



二、实现实验室污染有效控制


AutoMolec 3000全自动分子诊断系统,将传统PCR实验室建设要求的试剂准备区、样本制备区与扩增区这三个单独区域融为一体,其设计符合国家卫健委《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》中所提出的基本要求[3]。仪器内部分为3个区域:耗材洁净区、提取区域、PCR扩增区。其采用的防止污染的技术包括:提取试剂为单人份预分装,吸样用滤芯TIP固化在提取试剂条上,移液过程通过全程压力监测和防滴落托盘,减少移液过程中液滴滴落造成的交叉污染现象,通过石蜡油和软胶塞进行PCR扩增管双重密封,扩增区管与管之间的距离大于常规96孔板孔间距,检测完成后反应区紫外灯智能开关,定时消毒废弃仓紫外、废液桶出气口过滤等等。这种全流程的防污染设计可很好的消除在有限空间内污染的发生。截止目前,我院已使用该设备半年以上,每日检测量为100~200管,没有发现1例污染的情况。


三、最大限度提高了检测的灵敏度


我国对于新冠病毒核酸检测试剂的灵敏度要求为500拷贝/ml。该自动化系统试剂的灵敏度可达到100拷贝/ml,不必担心漏检。这对于夏季的新冠病毒核酸检测尤为重要,之前的阳性病例送检我们也发现,随着时间的延长,病毒载量有所下降,表现在我们做出的CT值稍低于送往疾控中心后的CT值(采用同种试剂,中间运输环节约1小时左右),说明RNA病毒在体外不稳定,需要及时检测和科学保存。此外,试剂中的逆转录酶和DNA聚合酶的储存温度是2~8℃,其冷藏型即用试剂,应用时无需复融、混匀等准备步骤,能最快速度开展实验。仪器的内置冰箱可保证较长时间的在机稳定性,试剂开瓶后有效期可达30天,减少浪费。


四、其他传染病病原体的精准检测


临床需求催生了全自动分子诊断系统研发更多有关传染病病原学检测的项目,未来可搭载更多的病原学核酸检测项目,包括呼吸道、消化道和接触传播等各类病原体,帮助发热门诊、急诊、儿科以及收住院等的各类患者进行快速灵敏的病原学检测,助力传染病的快速精准防控。随着新冠病毒肺炎、猴痘病毒感染等各类新型传染病的出现以及甲、乙型流感等传统传染病的周期性传播,实验室面临着检测量不断增加、检测时限越来越短、技术人员短缺等压力,这恰恰促进了分子诊断技术的快速发展。一站式自动化病原学检测设备从检测效率、精准度、人力成本等方面满足了患者、医生和检验人员的需求,未来将进一步助力传染性疾病的病原学诊断,提升传染病综合诊治和管理水平。


参考文献


[1] 北京医学会检验医学分会, 北京市临床检验中心, 北京市医学检验质量控制和改进中心.

北京医疗机构发热门诊临床实验室能力建设专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(8): 780-786.

[2] 国务院联防联控机制. 关于进一步加快提高医疗机构新冠病毒核酸检测能力的通知. 国

务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组 [2020] 204号。

[3] 卫生部办公厅. 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法. 卫办医政发 [2010] 194号


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