循环肿瘤细胞检测技术的 现状和前景

造血肿瘤细胞播散是癌症进展的关键步骤。固体上皮肿瘤（例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌）患者的外周血循环肿瘤细胞（CTC）检测具有远大的前景。对CTC的分子特性的了解在技术上目前仍具有挑战。CTC特性的鉴别需要灵敏度和特异性极高的分析方法，这些方法通常会结合复杂的富集技术和检测程序。CTC的浓度非常低，在数以百万计的正常血细胞背景中存在一个肿瘤细胞。由于CTC上皮—间叶细胞的可塑性，所以现有CTC试验中使用上皮标志物很难将其检测出来。在本篇文章中，我们总结了当前用于富集和检测CTC的方法并讨论了在改善临床癌症患者管理的环境中CTC分析的前景和关键挑战。

癌症患者外周血CTC检测具有远大前景但仍具有技术上的挑战。在过去的几年中，人们对CTC领域的兴趣显著增加并快速开发了许多新技术来鉴别CTC。

CTC的浓度非常低，在数以百万计的正常血细胞背景中存在一个肿瘤细胞。CTC的鉴别和特性分析因此需要灵敏度和特异性极高的分析方法。这些方法通常会结合富集和检测程序。由于罕见事件的检测总是受到泊松统计学的阻碍，因此最好用大血量（至少7.5mL或更多）分析，具有CTC负荷小的早期癌症患者人群尤其需要大血量分析。

CTC研究的目标包括（i）癌细胞转移性复发或进展风险的评估（即：预后信息）；（ii）疗法的分层和实时监测；（iii）治疗靶点和耐药性机制的鉴别；（iv）癌症患者癌细胞转移发展的理解。

这篇文章侧重于当前CTC监测和特性分析方法学的挑战和前景，可能有助于癌症患者个性化靶向治疗的改进。

CTC富集包括大范围基于不同CTC特性的技术，这些技术必须能将其从正常造血细胞中区分出来：（i）物理特性（例如：大小、密度、电荷和可变形性）；（ii）生物特性（例如表面蛋白表达和侵润能力）（图1）。

物理特性能让区分工作在不使用标记的条件下进行（i）密度梯度离心（Ficoll OncoQuickTM），已知一定数量的CTC会在系统中丢失；（ii）通过特殊过滤器过滤，ISET（根据上皮肿瘤细胞的大小来分离）或一种新型三维微型过滤器，会丢失小的CTC，过滤器孔会保存大的造血细胞；（iii）新型通用无标记生物芯片，该方法利用癌细胞与血细胞在大小（更大）和可变形性（更硬）上的独特差异；（iv）结合多孔流分离（MOFF）和介电泳（DEP）细胞分离技术的微流体设备；（v）介电泳场流分离（DEP-FFF）设备，根据大小和膜特性的不同导致对DEP的反应不同进行活CTC分离。

生物学特性主要应用于免疫程序，这些程序使用对抗肿瘤相关抗原（阳性选择）或白细胞共同抗原CD45（阴性选择）的抗体。免疫磁性系统用磁珠偶联抗体靶定抗原，接着抗原抗体复合物受到磁场效应被分离。通过上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体执行阳性选择，然后使用细胞角蛋白（CK）—上皮细胞中间纤丝的抗体执行CTC免疫细胞检测。当前基于EpCAM的技术中，FDA批准的CellSearchTM系统在过去的7年中得到了广泛的关注，该系统经常用于与所有新型CTC检测方法比较。近来还研发了其他有前景的使用不同方法捕获EpCAM阳性CTC的技术，这些技术包括：（i）一种称为CTC芯片的微流体平台，该平台由anti-EpCAM抗体包被微柱阵列组成，用于分析患有实体瘤患者的血液样品。癌症患者甚至是非转移癌症患者的CTC计数很高，健康对照组阳性事件的频繁检测表明了该试验的特异性需要进一步研究。（ii）高通量微流体混合设备，又称为鱼骨状芯片或“HB-芯片”，能提供先进的CTC分离平台；（iii）一种称为“Ephesia”的CTC芯片，该芯片使用磁捕集器阵列中微流体通道内自组合的生物功能化超顺磁珠微柱；（iv）使用微流体系统对低丰度CTC进行高通量选择、计算和电动处理；（v）其他新的免疫磁性分离技术有MagSweeper，从血液中积极富集表达EpCAM的循环上皮细胞（CepC），并支持后续分子分析；（vi）通过使用3D纳米结构底物或纳米“Fly Paper”技术，可以有效地和特异性地捕获包被有anti-EpCAM Ab-CTCs的硅纳米线（SiNW）阵列；（vii）一种像魔术贴（Velcro-like）的微流体设备，该设备可以分离CTC，有效性范围40%-70%。这并不是全部现有的试验，只是强调了现有的分离策略。

图1：从癌症患者血流中通过不同富集方法富集后CTC是一种实时液体切片。（a）物理特性包括大小、可变形性、密度和电荷。（b）物理特性基于细胞表面标志物的表达，包括阳性选择上皮细胞粘附分子（EpCAM）和阴性选择CD45。所有这些技术已经都被应用于体外血液样品，但是最近一种新型微检测技术可以直接从患者臂静脉中富集CTC，这表明其能在大约1500mL血液中富集CTC，可以采集更大量的CTC。疾病的阶段不同，CTC有不同的衍生来源（例如原发肿瘤或转移器官如肝、肺和骨髓），它们可以作为癌症液体切片并能揭示重要的治疗靶点信息和/或耐药性机制，这些信息和机制可以用于将来接受如EGFR/HER2抑制剂或激素疗法（如ER、AR）等靶向疗法的患者分级并能实时监测治疗效果和耐药性的发展。缩略语：glyco A：血型糖蛋白A（存在于人体红细胞胞外表面的131氨基酸蛋白）；RBC：红细胞；ER：雌激素受体；PSA：前列腺特异性抗原；PSMA：前列腺特异性膜抗原；AR：雄激素受体；EGFR：上皮生长因子受体。

最近，结合使用肿瘤相关物理和生物特性的试验已经问世，例如Ozkumur等人使用了一种结合基于CTC大小的流体动力学细胞分拣技术和免疫磁性选择技术（阳性或阴性）的新型技术并将其称之为新型“CTC-iChip”设备。

由于这些设备尺寸非常小，微型设备需要较小的样品量和细胞量，从而可以使处理时间最短化并使昂贵染色试剂的使用最小化。但是分析如此少量的血液会对罕见CTC的检测产生巨大的限制，尤其是大部分处于早期的癌症。克服这种限制的简单方法是在体内直接靶定CTC。通过使用Gilupi nanodetector®已经让该方法成为现实。通过在外周臂静脉上应用这种设备30分钟可以分析多达1.5升血液，包括CTC在内，通过2cm纳米检测器的功能性区域并能让大量CTC与抗EpCAM抗体结合。另一种方法是开发白细胞去除术，进行细胞淘析以供使用流式细胞术执行后续体外CTC分析和实时PCR进行CTC分子特性分析。

最近一项研究对CTC试验的特殊优势、技术挑战和常见缺点（包括微流体技术）进行了概述，报告也已经发表。其中比较特殊的是Parkinson等人提供了现有CTC试验的综合列表，跨国专家组对涉及的试验进行了评述。简而言之，微流体设备由于可以对流体高度可控并支持设备选择，因此具有非常大的优势。但是这些设备有干扰血流的倾向如可能在血液内产生气泡或引起血凝块。目前很难确定哪种物理原理在临床捕获CTC时更加具有优势。许多CTC技术基于肿瘤细胞比CTC更大更硬的假设，但是癌症患者原始血液样品CTC的大小变化显著，经受EMT的肿瘤细胞有和白血球一样的弹性。电介质和声光特性以及肿瘤细胞膜边缘波动最近被引入，但是这些技术仍在接受临床确认。

作为一种备选方案，基于肿瘤相关细胞表面抗原表达（例如EpCAM、EGFR、HER2、MUC1）的CTC捕获方案已经存在，但是这种方法也存在肿瘤异质性的问题，除非使用靶定广谱抗原的多种抗体才能解决这一问题，但是使用这种方法可能影响富集CTC片段的纯度。通过去除白细胞来阴性选择CTC可以作为CTC无偏富集的备选方案，但是需要非常小心地执行去除程序以避免CTC淹没在正常血细胞的“海洋”中。最近，一种将通过大小选择有序组合进行CTC富集与基于抗体的捕获或阴性去除CTC结合的方法出现，称之为“CTC-iChip”。

将不同细胞系的细胞添加到正常血液内的试验是评估新型CTC试验的良好开端。但是这些细胞被选择用于产生最佳的结果，从癌症患者身上取得的原始血液样品产生的结果通常较低。癌症患者体内的CTC更加多种多样，稳健性也低于多年的细胞系细胞传代。因此，应该对癌症患者原始血样进行充分的分析，对新型试验进行确认。

上述大多数CTC试验使用相同的鉴别步骤：对细胞角蛋白（上皮肿瘤细胞阳性标志物）进行荧光染色，对白细胞共同抗原CD45（排除标志物）使用细胞核染料（4,6-二氨基-2苯基吲哚（DAPI））染色。尽管一些用于捕获CTC的抗原适用于多种癌症类型（例如EpCAM适用于乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和其他上皮肿瘤），但是还是需要适用癌症特异性检测原则（例如前列腺癌PSMA或PSA）。因此相信一种试验适用于全部癌症类型是非常幼稚的想法。

为了仅检测活的CTC，就需要功能性上皮免疫斑点（EPISPOT）试验，该试验可以结合任意种类的富集步骤用于CTC分析。由于避免了和靶细胞的直接接触，该技术基于24-48小时短期培养蛋白质分泌、脱落和释放评估CTC是否存在。EPISPOT已经应用于乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的血液和骨髓（BM）样品，提供第一手临床数据。

不仅如此，使用纤维光阵列扫描技术的超高速自动数字纤维检查已经出现，用于检测荧光抗体标记的CTC。其他基于玻片自动扫描显微镜也被用于CTC检测，该技术具有前景但仍需要大量临床研究确认。

免疫检测具有后续分离被染色CTC的优势，能进行分子特性的分析。人工CTC分离已经成为可能，但是费时费力。作为备选方案的自动化单细胞选择设备（例如基于介电泳技术的DEPArrayTM）因此被开发出来。CTC的分子特性可能会增加试验的特异性，因为符合CTC表型标准的上皮细胞已经在良性结肠疾病患者中发现。

靶定特异mRNA的试验是用于替代免疫试验鉴别CTC的使用最广泛的试验。乳腺癌患者中，CK19mRNA已经成为临床研究中使用最频繁的mRNA。许多转录本（例如编码CK18、CK19、CK20、粘蛋白1、前列腺特异性抗原和癌胚抗原）在正常血液和骨髓细胞中也有低水平表达，因此，需要用具有确认截断值的定量RT-PCR试验来克服这一问题。不仅如此，基因转录在CTC中可能被下调（例如在EMT条件下，见下文），这支持了多重标志物RT-PCR方法。最近，Markou等人设计了一种新的液体微粒阵列杂交试验：对从免疫磁性富集CTC中分离的mRNA执行多重PCR，以同步测量CTC中6种基因的表达。

原则上，肿瘤特异DNA畸变检测是最具特异性的CTC检测方法；但是实体瘤的显著遗传异质性产生了一个问题，这是因为相同实体的不同肿瘤（例如乳腺癌）以及单一肿瘤中的不同细胞包含了不同遗传畸变。因此需要针对不同遗传畸变进行大量研究，建立基于DNA的灵敏的检测体系。不仅如此，原发肿瘤的遗传分析不能预测CTC的DNA畸变，单一CTC的分离和直接遗传分析在技术上仍具有很大挑战。

细胞可塑性指的是一个有机体内一些细胞呈现其他细胞特性的能力。上皮—间叶细胞转化（EMT）是导致细胞去分化的复杂过程，并通过重排细胞接触连接增加运动性，最终使细胞丧失粘附性。与该过程相反的过程称为间叶—上皮细胞转化（MET），该过程在CTC在远端器官固定后发挥基本作用并开始形成新的微环境转移。迄今为止，我们对控制上皮—间叶可塑性的触发机制一无所知，即对转移阶梯反应期间EMT和MET的平衡一无所知。

类间叶细胞出现在癌症患者的血流中，这些细胞被当前大多数基于上皮细胞标志物如EpCAM和细胞角蛋白的试验遗漏。最近的研究显示EMT尤其会影响具有类干细胞特性的肿瘤细胞。因此最近几年，人们对研究CTC EMT标志物兴趣大增。最近的报告显示现有基于上皮抗原的试验会遗漏最有侵略性的CTC亚群。因此，迫切需要完善CTC检测方法，将EMT期间未被抑制的标志物包含进来但仍能够通过分析来区分CTC与周围血细胞（例如结肠直肠癌中的网素3）。最近Yu等人已经用一组细胞表面抗原来捕获乳腺癌转移患者的间叶细胞和上皮细胞CTC。但是，只能在低于50%的MBC患者中检测到CTC，这比同一组用独立EpCAM CTC试验公布的检测率要低。这一结果的原因仍不清楚，但是却表明开发灵敏的间叶细胞CTC捕获试验具有相当的难度。

最后，血小板在肿瘤播散中是否具有潜在作用？先前的研究表明血小板粘附诱导了卵巢癌细胞促存活和促血管生成信号。不仅如此，小鼠试验研究发现CTC结合血小板诱导EMT。已证明血小板存在于乳腺癌的CTC之上，被血小板覆盖的CTC是否增强了其向附属器官转移的潜在能力并且在CTC富集步骤中是否可能被隐藏，可能引起人们研究的兴趣。

CTC目前可以通过不同方法富集和检测。但是未来我们需要开发更佳的方法，分离和鉴别（i）具有下调上皮特异性蛋白表达的肿瘤细胞类EMT亚群以及（ii）具有器官特异性转移特征的CTC子集以鉴别其起源。目前，为了富集CTC，基于去除CTC周围白细胞的阴性选择策略可能是无偏选择肿瘤细胞包括那些缺乏上皮标志物的播散细胞子集的可行性方法。

目前，CTC分析在临床实践中仍然不是常规肿瘤分期的一部分。这主要因为使用现有方法可检测的CTC数量较低，限制了其作为“实时液体切片”的价值，对于早期肿瘤患者而言尤其是一种损失。因此，急需评估新创新方法的再现性、灵敏度和特异性，让CTC检测可以应用于临床实践。关于CTC状态的信息可以用于评估癌症患者的个体预后并对危险患者进行分级以应用系统疗法来预防复发和转移复发。此外，临床实验的CTC测量可以作为重要的生物标志物实时监测个体癌症患者的系统疗法效果，并由此加速药物的开发，定义最高治疗受益患者亚群。不仅如此，信号传导途径内下游成分的CTC分析影响靶向疗法（例如EGFR靶向疗法K-ras突变或HER2靶向疗法PI3K突变），能够加深对复杂耐药性机制的理解。

（摘自Royal Society of Chemistry，版权归其所有，仅供内部学习）

编译：张凯

审校：王小茜