人类生物样本贮存： 最佳贮存温度的选择

·前    言·

生物样本包括组织，细胞（以及它们的大分子构成成份）。通常，生物样本被收集于不同的地点供今后使用。生物样本的处理、运输和贮存必须保持其关键生物特性。最常见的生物样本保存方法是降温冷冻并贮存在低温下以抑制降解。其他稳定的方法包括化学固定、塑化、干燥、冻干、离子液体，干燥状态贮存，和密封，本文将关注人类生物样本的长期低温贮存。与缺血相关的问题，以及非人类样本的贮存研究将不包括在本综述中。值得注意的是，无论样本来源如何，在冷冻过程中发生的许多生物物理和生物学现象会影响生物样本的稳定性。

·低温下生物样本的物理学·

因为水为大多数生化反应（包括那些降解分子）所必需，所以了解水在冷冻过程中的流动性是很重要的。液态、固态（冰）和玻璃态（高粘性液体）的水流动性（即水参与反应的能力）不同，因此，低温贮存生物样本在某种程度上反映了对系统中水的行为进行控制，特别是通过冷冻或玻璃化减少水的流动性。为了了解水在冷冻过程中发生了什么，简单了解低温物理学是有很有必要用的。

大多数生物样本是复杂的混合物，至少包含水、盐和蛋白质，因此它们在单一的温度下不会凝固，但冷冻超过一定的温度范围，多组分溶液的热力学状态可以通过相图和随时间变化的温度-时间-转变（TTT）图描述。特别是在给定初始浓度和压力时，已冻结水的量和未冻结溶液的浓度可以根据温度确定。水和其他所有成分（如，生物样本中的脂质）经历的相变可由相图描述。

不同于大多数物质，水可过冷到其冷冻平衡温度以下。纯水可以在0℃-40℃的温度范围冷冻，生物样本在-5℃-15℃形成冰并不常见。冻结的起始点称为成核，不规则的容器表面性和样本中颗粒，可辅助水分子形成稳定的冰晶的过程，叫做成核。样本的过冷（此时样本在低于熔点温度时成核）是细胞生物标本解冻后复苏的重要参数，且经常使用各种方法控制。当样本成核后，水以冰的形式从样本中被去除。溶质（例如，蛋白质和盐）没有被包含到固体冰晶中，这将导致样本被分割为固体成分和未冻结的液体成分，且随着样本温度的下降，液体中的溶质浓度增加。细胞、蛋白质、脂类和其他成分被隔离在冻结液体和相邻冰晶之间的缝隙中。当大部分的水是以冰的形式被除去时，剩下的未冻结液体被高度浓缩，分子、细胞和组织经受的溶质浓度是10,000毫渗透摩尔（mOsm）。在部分冷冻溶液中分子的分布可能不均匀。在冷冻期间使用拉曼光谱技术使蛋白质溶液的微观偏析成像显示，即使是小至1um的间隙，蛋白质分布也不均匀，且在冰-水界面附近蛋白质呈现聚集。

氯代钠-水的二元相图经常被用来作为生物体系在无冷冻保护剂时冷冻行为的模型，例如，等渗盐溶液[0.9%（w/w）氯化钠]慢冻时，相邻的冰晶之间的间隔会逐渐减小，直至样本完全凝固（在共晶温度下）或玻璃化（玻璃化转变温度，Tg）。对等渗盐水而言，共晶浓度是23.3%（w/w）氯化钠，温度是-21.2℃。为了细胞生物样本和蛋白质的稳定以便药物应用，通常添加稳定剂（二甲亚砜和甘油用于细胞样本，糖和糖醇用于蛋白质）形成多组分溶液。下面的经验公式用来评估多组分混合物的玻璃化转变温度：

Tg（mixtures）¼ Tg1 （1-x）+Tg2•x + k•x （1-x）    （1）

Tg，i（i=1,2）是组成成分的玻璃化转变温度；x是冷冻保护剂的质份数；K是相互作用参数。

10%（w/w）二甲基亚砜（DMSO）溶液可根据水的Tg1=-135.2℃，DMSO的Tg2=-122.2℃，x=0.1，K=16，计算出玻璃化转变温度为-132.58℃。与DMSO水溶液相比，常用的冷冻保护剂中，海藻糖的玻璃化转变温度较高（Tg=-113.9℃）。低于玻璃化转变温度时，由于粘度增加10帕斯卡.秒（pa-s），样本内分子的流动性减少。Angell报道氯化钠（NaCl）溶液在“正常”的冷却程序中不能玻璃化，然而，应用非常快的冷却速率可以防止等渗系统的结晶。玻璃化转变温度取决于几个参数，包括浓度、贮存温度、贮存时间。

系统中的水的凝固也受到组织样本中存在的细胞外基质的影响。水与胶原等其它的基质之间有强烈的相互作用，且这些相互作用影响着组织的凝固。具体而言，冰晶优先在血管（对血管组织而言）形成且随着样本的冷却在血管中生长。对股骨头组织（如软骨、角膜），由水流在组织中形成很窄的通道，冰晶在不同部位形成。这些大的冰晶体（或冰镜片）可导致细胞外基质明显的毁坏/重组，因此细胞外基质的存在也可影响凝固过程。

如上所述，生物标本是一种复杂的溶液，其冷冻历经一系列温度。在冷冻过程中，水以冰的形式被去除，溶质，蛋白质甚至细胞从冰中被分割出来。在剩余的未冻结液态部分实现共晶或玻璃化形成前，样本不能完全凝固。细胞外基质的存在也影响了水的凝固，因此，样本贮存在液态水（相对于冷冻或玻璃化的水）仍然存在的温度时，将导致稳定性降低。

·低温下的生物样本特性表征·

利用样本在低温下以各种方式存在的特点，可对低温下的样本进行研究。这些方法使得研究人员能详细了解温度对生物样本在降温和复温过程中的影响，从而有助于改进的降温和复温的方案。低温测量采用的几种方法包括：光谱法，量热法，断层扫描和显微镜法。傅里叶变换红外（FTIR）和拉曼光谱学被用来检测样本的分子振动，能够提供关于水的运动和冰晶生长的信息。常用的量热方法包括差示扫描量热法（DSC）和差热分析（DTA）；这些技术用于创建相图，量化通过质膜的水传输并检测细胞内冰晶的生长。磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）已用于可视化三维冰晶体生长和保护剂在空间扩展的样本中渗透。显微镜的方法包括低温显微镜、定向凝固，冷冻电子显微镜和多光子显微镜。一些不同的方法已被组合使用，例如，低温显微镜和差示扫描量热法（DSC）或拉曼光谱法。

·低温下的生物活性·

所有的生物样本均含有降解的分子，脂肪酶，糖酶，蛋白酶和核酸酶可存在于液体或组织生物样本中。蛋白酶（如基质金属蛋白酶）既可作为生物标记物，也可在样本中降解生物标志物，酶的活性是特定蛋白质的动态功能。温度对蛋白质动力学有很强的影响；温度降低导致蛋白质动力学/活性降低，蛋白质活性随温度下降而降低是生物样本在低温下稳定的机理之一。蛋白质活性与温度之间的相关性遵循阿伦尼乌斯关系。然而化学反应速率常数依赖于绝对温度T：

                 k = A•e－Ea/（RT）               （2）

A为指数前因子，Ea活化能，R为气体常量，因此，低温导致化学反应的速率降低。

最佳贮存温度应选择低于保持蛋白质活性的阈值温度。观察不同蛋白质在-53℃附近的动态特性有明显变化。拉斯姆森和他的同事们研究了核糖核酸酶（RNaseA）的变化与温度的相关性，他们确定在215K（-58℃）时底物不能与酶结合。蒂尔顿等观察到了类似的结果，他们观察到在180–200K（-93℃至-73℃）核糖核酸酶（RNaseA）的变化。相反，更多的同行观察到在温度低至-70℃时β-葡萄糖苷酶的活性。

对数量有限的蛋白质研究表明，蛋白质可能会在很低的温度下（＜-80℃）保持活性。因此，当生物样本贮存在水仍有流动性且蛋白仍具活性的温度下时，将导致其降解。

·确定良好贮存条件·

在很多情况下，测量实体生物样本中水的流动性和蛋白质活性是不现实的。大多数生物样本库不得不依靠强有效的质量控制程序来确定良好的贮存条件。办法之一是采集少量的生物样本进行质量控制测试（不分发）。在冷冻前、冷冻后对这些样本进行监测，以获得目标生物标志物随时间变化的函数关系，如随着贮存时间的延长，生物标志物降解，则表明样本未被贮存在最佳状态，应贮存在较低的温度下。适当的质量控制程序可确定对低温贮存反应差的标志物（相对于那些在给定的贮存条件下不稳定的标志物），例如，乳酸脱氢酶冷冻后失去了所有的功能活性，因为仅简单的冷冻即可损伤，所以贮存稳定性差。因此，一个强大的质量控制程序可促使对低温保存反应差与贮存不稳定的生物标志物的确定。生物样本含有对低温保存反应差的生物标志物时，必须用其他方法（如，干态，液态）贮存。生物样本含有随贮存时间延长而不稳定的生物标志物时，应贮存在较低的温度下。值得注意的是，一些生物标本，特别是生物样本中的细胞损伤表现为解冻后随着时间而演变的细胞凋亡，因此，细胞生物样本解冻后的评估必须适应这种损伤机制随时间的演变。监测生物样本的冷冻损伤、贮存稳定性，解冻后适当的评估方法将是生物样本库不断提高质量的关键。

·贮存研究文献综述·

贮存条件对生物标志物稳定性的影响在各种系统中均有研究。如前所述，下面的章节将描述最新针对人类蛋白、细胞和组织生物样本稳定性的研究，此综述以外的其他参考资料可以在isber网站上的isber生物样本科学工作组文献汇编中和关于生物样本库实践中低温生物学原理概述的工作回顾中获得。

·蛋白质和纯化核酸的贮存·

液体生物样本（如血清、血浆、尿液、脑脊液等）是蛋白质生物标志物的常见来源，贮存温度对一系列生物标志物稳定性的影响总结在表1。许多的液体生物标本目前存放在世界各地的生物样本库。将这些生物样本应用于下游的能力在很大程度上取决于对生物样本的处理和贮存情况，因为这些情况导致生物标志物研究解读的不确定性。

例如，最近的一项研究，追踪10年期间血清中两种肿瘤标记物的浓度（癌抗原CA125、CA15-3），观察到随贮存时间延长，生物标志物发生15%的增加。在另一个研究中，Kisand等报道血清贮存在-20℃或-75℃下经反复冻融后，血管内皮生长因子（VEGF）水平明显下降。另一种血清成分，基质金属蛋白酶-7（MMP-7），贮存在-20℃ 5年仍稳定，用阿伦尼乌斯公式计算在-75℃下贮存100年也将稳定。总的来说，研究者们推断出血清贮存在-20℃下生物标志物不稳定。基质金属蛋白酶-9（MMP-9），一种在临床研究中用于检测心血管风险的生物标志物，被发现随着贮存在-80C下时间的延长而降解。24个月后，MMP-9的水平下降到65%，43个月后下降到只有1%。

Woodrum等人检测血清中游离前列腺特异性抗原（PSA）在不同贮存条件下的稳定性，他们发现随着时间的推移，游离PSA水平下降。贮存在20℃下每月损失0.9%，而贮存在-70℃每月损失0.4%。 Schiele等人测定贮存在不同温度（-20℃和-80℃）下达4年的血清中载脂蛋白浓度的稳定性，他们发现在-20℃和-80℃下贮存3个月或-80℃贮存4年，载脂蛋白浓度不受明显的影响，Qvist等研究了I型胶原C端肽（CTX）的稳定性，CTX是血液和血清样本中的一种骨吸收标志物，CTX贮存在不同温度（-20℃、-80℃和-150℃）下3年后，仅在冷冻（如，在-20℃和更低温度）时才稳定。

Karlsen等人发现血浆中维生素C（抗坏血酸和脱氢抗坏血酸）只要-20℃ 1天之后就降解，因此作者建议这些样本贮存在-70℃。Rai 等通过将血浆贮存在不同温度（-80℃，-196℃）下研究分析前因素，并进行蛋白质组学分析（SDS-PAGE和SELDI-TOF）。他们的结论是，应将血浆贮存在液氮中。

有趣的是，发现一些分析物在低温贮存期间随着时间的推移浓度增高。例如，Mannisto等评价贮存在-25℃达23年的人血清中的促甲状腺素（TPO），甲状腺激素（TSH、FT4、FT3），和甲状腺自身抗体（TPO-Ab，TG-Ab）的浓度。TSH和fT3贮存在-25℃浓度不受影响，然而fT4显示浓度随时间变化波动明显。TPO-Ab和TG-Ab水平随时间变化而增高。另一项研究中，Panesar等测量了贮存- 80℃下8-11年在甲状腺激素水平（TSH、fT4和fT3），发现贮存在-80℃下TSH随贮存时间延长而下降，但fT3和fT4浓度则增高。

Kubasik等检查了贮存时间和温度对血清中14种不同分析物的影响，分析物通常用放射免疫方法测定。他们发现甘胆酸、皮质醇、地高辛、铁蛋白、促卵泡激素，免疫球蛋白E、促黄体素、催乳激素、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸在室温2周是稳定的。然而，胰岛素和胃泌素不太稳定，需分别冷藏或贮存于-70℃。

对纯化与非纯化核酸的稳定性也有研究。vindeløV等研究了从JB-1肿瘤细胞和细针穿刺抽吸固体肿瘤组织中提取的DNA，贮存在-80℃ 1年的影响，细胞和细针抽吸物放冻存管被浸在干冰并在99%乙醇中-80℃保存，贮存-80℃ 1年后DNA去卷积结果显示无明显变。Chan等研究分析前因素包括血浆冻融对细胞游离循环DNA的完整性的影响，在他们的研究中，血浆被贮存在-80℃24小时，后经反复冻融，会导致DNA断裂。

纯化的mRNA稳定性很大程度上依赖于贮存方法。Riesgo等比较了两种保存方法：（a）一种是液氮快速冷冻后贮存在-80℃，和（b）另一种是固定的方法，包括浸入RNA4℃ 1小时后，放-20℃过夜，然后贮存在-80℃，贮存1个月后，快速冷冻法得到更好的结果（测定A260／230比值）。这些例子表明，大多数的亚细胞成分能够被贮存在-20℃冰箱而且一些成分在-80℃贮存就会降解。

·冻存细胞的贮存·

贮存条件对冻存细胞的影响已被广泛研究，因为解冻后的细胞功能是许多应用的关键。科学文献建议，最佳的贮存条件取决于细胞类型和所使用的保存介质。有关细胞贮存相关的研究汇总在表1。

血细胞（如红细胞、造血祖细胞、血小板），用于治疗已经有几十年且研究最为广泛。红细胞用40%（W/V）甘油冷冻保存在-80℃长达37年的稳定性已被Valeri和他的同事们证实。红细胞也可用24%（w/w）羟乙基淀粉（HES）冷冻贮存在-10℃--75℃的温度范围内。贮存温度对细胞溶血有很大影响，作者提出了一种指数法，描述了在给定的贮存温度下，测定随时间变化的溶血。此外，他们提出了亚细胞成分的去玻璃化和变性是破坏因素。

人类造血祖细胞（HPCs）的保存通常使用两种不同的解决方案：5%二甲亚砜（DMSO）和6%（w/w）羟乙基淀粉（HES），或10%二甲亚砜（DMSO）使用这些冷冻方案保存人类造血祖细胞（HPCs）的稳定性，已被确定取决于在-80℃的贮存时间和DMSO的浓度。不同DMSO浓度之间细胞解冻后的活力无差异，但活力随着时间延长而明显变化。具体来说，活力从1个月后的大约80%，逐步下降到31个月后的32%。Halle等不控制外周血祖细胞（PBPCS）的冷冻速率，将其保存在3.5%DMSO中，贮存在-80℃大约7周后，有核细胞、CD34+细胞、粒细胞巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）和红细胞爆裂型集落形成单位（BFU-E）可回收率分别为60.8%，79.6%，35.6%和32.6%。另一个冷冻研究中，自体PBPCS以1.5℃/min的速度冷却至-90℃保存在-80℃或-170℃ 1-2年，两种贮存温度下，细胞计数无显著性差异。然而，只有细胞贮存在-80℃时，细胞膜的完整性和克隆形成能力显著降低。作者表示，目前还不清楚这种减少是否完全由于在相对高的贮存温度-80℃引起或者由于细胞内冰的形成引起。Cilloni等用10%DMSO和10%人血清白蛋白（HSA）在不使用控制冷冻速率技术时，将PBPCS冷冻保存于-140℃。样本贮存在-140℃ 10-12个月。解冻后，有核细胞绝对数量减少。同时，多向克隆形成实验显示回收率降低。该试验的长期培养起始细胞和BFU-E表现出了明显的损失。

Parker等在骨髓细胞中加入10%DMSO贮存在-85℃，-140℃或-190℃，40-42个月。冷冻前后进行细胞计数和粒细胞-单核细胞集落形成细胞（CFU-C）试验，稀释和清洗步骤与质量下降有关，CFU-C的测量表明，汽相液氮可适合于人类骨髓细胞的长期贮存。Ayello等也用5%DMSO和6%HES将骨髓细胞和外周血单个核细胞（PBMC）冻存在-90℃。研究者们测试了体外细胞复苏，集落形成单位—粒细胞巨噬细胞（CFU-GM），自体人类造血祖细胞（HPCs）克隆形成和细胞活力，他们没有发现明显的变化并得出结论：-90℃贮存这些细胞三年以上是可行的。

Katayama等人在人外周血造血干细胞（PBSC）中加入10%DMSO和8%HSA然后用控制冷冻速率法冷却至-80℃，样本贮存1–61个月，研究解冻过程和长期冷冻保存的效果，用CFU-GM、BFU-E试验来检验质量。贮存5年后，CFU-GM、BFU-E复苏率表明无显著差异。作者断定冷冻保存程序对于应用于临床的PBSCs贮存是有用的。McCullough等将人外周血干细胞放在10%DMSO，5%DMSO和6%HES不同的组合中，冻存在-80℃或135℃中，贮存5年后，通过测定有核细胞总数、细胞活力、CD34+细胞含量和CFU-GM含量来判定样本的质量。大多数的质量检验显示没有显著差异，仅样本中有核细胞总数在冷冻保存前贮存在1℃-6℃ 24小时，随时间呈下降趋势。

Massie等95研究了贮存温度对藻酸盐包裹肝细胞球体活力的影响。球体被贮存在-80℃或-170℃达12个月，活细胞计数和肝球体的功能在贮存-80℃ 1个月后大幅下降，在12个月贮存期间继续降低。相反，肝细胞球体在170℃贮存12个月，可保持活力。

细胞样本贮存的这些例子显示，一些类型的细胞被成功保存在-80℃，并随时间变化保留了活力。然而，发现其他类型的细胞即使在-80℃下贮存很短的时间也失去活力，因此需要更低的贮存温度（如，-170℃）。

·组织的贮存·

组织生物样本是疾病诊断、疗法选择和疗效监测的重要资源，也能用于治疗（即，胰岛的移植治疗糖尿病）。研究表明，血供结扎后生物标志物的表达快速变化。组织的冷冻用于阻止生物标志物的降解，组织生物标志物的长期稳定性取决于长期贮存的条件。科学研究汇总描述了贮存中组织生物标志物的稳定性。

Jewell等分析了从人类组织（乳腺、结肠、肝脏、肺、卵巢、子宫内膜和宫颈）中分离的DNA和RNA被冷冻贮存在-80℃ 0到12个月以上的稳定性。他们用几种方法进行分析，包括电泳、逆转录聚合酶链反应和免疫印迹。他们发现在80%的组织DNA质量良好，而只有60%的组织RNA质量良好，这表明组织的DNA比RNA更稳定。

Mato等发现人尸体组织保存在-25℃的强烈影响G-蛋白[35S]GTPγS受体密度和反应，G-蛋白是一种用于分析cannabimimetic药物的标志物，该药用于治疗许多神经疾病，贮存在-25℃12–24个月后，测定组织中的[35S]GTPγS减少50%。

在另一项研究中，1平方毫米的包皮组织片放入0.8%DMSO溶液和血清中，然后将这些样本在气相液氮冷却并贮存在-196℃中1、3、6、9和12个月。解冻后，组织被切碎成更小的碎片，以便细胞培养用于染色体研究，形态学和酶法分析。任何一种冷冻保存的组织样本经测定无染色体损伤或重排。细胞的显微镜分析没有明显的形态学变化，此外，测试了六种溶酶体酸性水解酶都保持在正常范围内。作者建议当细胞培养不可能或实际情况不允许立即启动时，应使用组织冷冻保存程序。

雌激素受体和孕激素受体可作为在妇科恶性肿瘤预后的蛋白生物标志物。Toppil等研究人类女性生殖道组织切除后雌、孕激素受体水平。组织在钼酸钠存在或缺失的情况下，贮存在-196℃中4、6和8周后的进行分析。冷冻过程中造成了类固醇激素受体损失30%，但一旦组织被保存在-196℃ 2-8周以上没有发现进一步的损失。

Crawford等人比较了人类乳腺肿瘤组织贮存在蔗糖-196℃和甘油-20℃中100天的情况。他们报道了组织中的孕酮在-20℃下1个月是稳定的，用Scatchard分析法探讨了雌激素受体水平随时间的变化，雌激素受体是用来预测乳腺癌治疗效果的。他们的结论是，在-20℃这个常规能满足的条件下，雌激素受体是稳定的。

一系列研究表明，组织的长期贮存需在-135℃以下。Brockbank等研究了人类心脏瓣叶，评估不同贮存温度（-80℃和-135℃以下）对瓣膜中成纤维细胞活力的影响。样本保存在-80℃显示成纤维细胞的活力随时间变化而损失。6周和24周后，可观察到组织功能显着下降，只有15%的组织瓣膜功能完全存活。相比之下，组织样本短期（3个月）和长期（1-2年）贮存在液氮中的（低于-135℃C）可维持细胞功能（即成纤维细胞蛋白质的合成）。

这些例子表明，一些组织标记物在相对高的温度下稳定（如，甚至在-20℃）。然而，为了保存更广泛多种的生物标志物（包括活力）。贮存温度低于-135℃似乎是必要的。 

·结     论·

生物样本是生物医学研究的一种重要因子，良好的保存和长期贮存条件大大影响其质量。

本文综述了在冷冻和贮存过程中的关键事件。任何生物样本都含有水和生物系统（如蛋白质、细胞、组织）。由于水对于许多生物反应是至关重要的，溶液中水的物理状态（固态，液态或玻璃态）对了解并控制生物分子的降解是重要的。在足够的低温下贮存溶液以减少水的流动性，通过形成固态体或玻璃态，减少溶液中水降解生物分子的潜在作用。

此外，生物样本含有降解的生物分子（如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶）它们的活性受温度的影响显著。选择使这样的分子处于非活动状态的贮存条件，从而保存生物标志物。生物细胞的最佳贮存温度取决于溶液组成和生物样本类型。实施适当的质量控制体系以监测长期贮存的生物标志物的稳定性，可确定良好贮存条件并持续改进生物样本的质量。 

摘自：Biopreservation and Biobanking

编译：生物芯片上海国家工程研究中心 周红梅

转载：eBiobank