​免疫检测技术发展高峰分论坛

免疫检测技术的迅猛发展，恰逢当今国家经济高速发展和新医改的层层推进的新常态，政府部门在调整监管的重心，厂家在有意识地平衡效益和技术创新，医疗机构也在不断优化自身的实验室构成。这种新常态下，也产生了很多的新形势，既有技术上的要求，如标准化的推行，也有临床实际的考虑，如适宜技术的选用等。丛玉隆教授回顾了免疫检测技术的发展历程，聚焦新常态下免疫检测技术发展的诸多热点问题，和我们分享了宝贵的观点和经验。

免疫学是生命科学和医学中一门重要的基础和前沿学科，以其原理为基础的免疫学检验在许多临床疾病的诊断、治疗和发病机制研究中发挥重要作用。丛玉隆教授把免疫检测技术概括地分为了“自动化免疫分析技术”和“流式分析技术”两个大类，自动化免疫分析技术又分为“酶免疫分析技术”、“荧光免疫分析技术”、“免疫比浊分析技术”和“化学发光免疫分析技术”；流式分析技术又分为“流式细胞标记分析技术”和“流式磁微粒分析技术（流式芯片”。丛教授依次回顾了各项免疫检测的技术发展和临床普及历程，存在的技术壁垒和应用门槛等。

酶免疫分析技术

1966年美国、法国同时报道了辣根过氧化物酶替代荧光素，定位组织中抗原的酶免疫组织化学技术（EIH），是最早的酶免疫分析技术。1971年Engvall和perImann在此基础上，发明了酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(ELISA)。90年代后期，随着ELISA技术的应用和发展，国外陆续研发出使酶免疫分析仪从单一的比色读板功能发展为集多种功能为一体的全自动酶免疫分析仪，实现了一台机器可将ELISA实验从加样、孵育、洗涤、振荡、比色到定性或定量分析的各个步骤都根据用户事先设计的程序自动进行，直至最后完成报告存储和打印，这就是我们所说的酶免的自动化。时至今日，酶免技术仍然是国际上最重要的免疫分析技术之一，其在测定大分子甚至是蛋白时，具有实用、便利、经济等明显优势。今天我们不能因为有了化学发光技术，就一味强调化学发光技术，而忽略了酶免技术。这实际上是一个误区，实验室需要的不应该是最尖端的技术，而应该是实用的、适宜的技术。随着医改推进和价格的改革，酶免技术的价值将再次得到体现，酶免技术也必将重新登上历史舞台。

免疫比浊分析技术

免疫浊度测定是基于经典免疫学反应——沉淀试验的一种技术。1977年Sternberg提出了在抗原抗体反应最高峰时，测定其复合物的含量，称之为速率散射比浊法，由此可使抗原抗体结合反应在几十秒之内得出检测结果，即在尚未出现肉眼可见的反应阶段就能够进行快速检测。这一发现使免疫化学分析发生了质的飞跃。近年来，在免疫比浊法的基础上又出现了乳胶增强比浊法。该方法是利用微小的乳胶颗粒（μm级）偶联抗体后，在液相中与相应抗原结合后产生光吸收或光散射的变化量来测定待测抗原含量，提高了免疫比浊法的灵敏度，减少了非特异性反应的影响。目前此项技术在散射比浊法与透射比浊法中都有较好的应用。

荧光免疫分析技术

物质受到紫外光或蓝紫光照射时能够吸收光能进入激发状态，在其回到基态的过程中，能以电磁辐射形式放射出所吸收的光能，产生荧光。荧光免疫分析技术是将荧光物质标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，给予紫外光或蓝紫光照射而发光。可通过荧光显微镜直接观察，或应用荧光分光光度计和流式细胞仪进行定量检测。这一技术在自免领域应用得比较多。

化学发光免疫分析技术

化学发光技术是利用化学反应释放的自由能激发中间体，当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析。在化学发光技术中的直接化学发光技术具有类似荧光的特异性，同时不需要激发光。这就避免了荧光分析中激发光造成的杂散光影响，从而具有很高的灵敏度，并且不像放射分析那样存在潜在的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定性及定量分析方法。虽然化学发光具有很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性，两者结合形成了化学发光免疫测定（CLIA）技术。

此外，免疫学还有一个重大的分支，就是流式细胞术。流式细胞术可用于我们观察细胞的标记和细胞的分群。例如做淋巴细胞和干细胞的功能试验时，流式细胞仪通过磁场的分选，能够实现细胞的分群。免疫学在流式细胞术的应用，包括在血细胞分析仪的应用、在细胞膜标记分析的应用，以及流式磁微粒免疫分析等。

免疫学在血细胞分析仪的应用，可以大致分为两类。一类是同时查血细胞和血浆免疫成分的所谓“白细胞+CRP”的结合，其应用于儿科和手术后，有一定的临床意义；另一类则是直接把流式加入到血细胞分析仪，其应用于艾滋病、免疫缺陷病是非常有使用价值的。但是可惜这块市场一直未能推开，这其中既有市场需求的原因，也有用户使用习惯的原因。

免疫学在流式细胞仪的应用价值很高。例如在检测白血病时，光有形态学检测，知道是白血病还不够，还必须通过流式免疫方法来确定是什么类型的白血病，才能指导用药。流式细胞仪在艾滋病、血液病的诊断方面有广阔的应用空间。但是囿于我国自主研制的单克隆抗体太少，进口单抗又太贵，极大地限制了它的使用。但是流式的发展前景必将是巨大的。

除了直接用来查细胞外，流式的原理还可以用来检查血液里的大分子和肽类。通过标记了抗体的磁珠，来跟血液中的大分子物质等结合，即流式磁微粒免疫分析。若不同的抗体标记在不同的磁珠上，即构成液体芯片，这也将是今后的发展趋势。

新常态下，免疫技术的不断创新，从业者认识和观念的更新，也带来了很多新的理念。丛教授聚焦一些热点问题，带领我们进行了一番深度的思考。

自动化与人工技能

随着技术的进步，自动化的程度越来越高，甚至出现了人工智能。人工技能似乎渐渐变得无足轻重了。但是自动化也好，人工智能也好，归根结底都是人预设好的程序。就像最近的围棋“人机大战”，虽然是人工智能赢了，但是它也是人设计出来的。实验室自动化，也是根据实验全过程的各个环节和要素，所设计出来的。有了机器，我们人能不能正确地使用，也是一个很大的考验。对于有的项目来说，例如细胞的多态性，自动化也很难去实现。任何的图像分析都建立在数据库的基础上，看得多、训练得多、积累的数据越多，认得就相对准。过分强调自动化，忽视了人工技能，会导致很大的问题。

全自动化与POCT

POCT不是给准确结果的，POCT就是一个定性的分析，它给的结果就是yes 和no。例如急诊做肌钙蛋白，超出POCT的参考范围，就马上干预，阴性的就不去干预。POCT不需要做得多准，不一定也不可能。POCT的定义，其目的不是准，是即时即地，马上给出一个结果，以便紧急干预。因此POCT和自动化是两个不同的概念，各有不同的分工。这两个概念不可比，这里说的不可比，不是说数值上的不可比，而是临床需求上的不可比。

检测系统的建立与维护

国外企业往往倾向把检测的各个环节看成一个整体，即检测系统，囊括了仪器、试剂、校准、质控的方方面面。国内企业相对缺乏这样的认识，卖机器的卖机器，卖试剂的卖试剂，在这点上应该学习国外的思维。对于实验室来说，买了这个系统就得遵循这个系统，不要试图去分立地看待其中的某个环节，一般都是要这个系统当作整体去维护。

追溯前沿与适宜技术

现在科技越来越进步，有很多前沿的技术冒出来。但是我们一定要明确，不是所有先进的东西我们都要用。检验不是搞尖端科研的，而是解决老百姓看病问题的。事实上，机器的准是相对的，不准是绝对的，应该关注你在什么单位，是什么要求。满足临床诊断的基本需求即可，而不是买的越高级越好，即使你不差钱。实验室引进技术，有三个标准：第一看方法学，第二看临床价值，第三从经济学去考虑，方法好，临床有用，成本怎么样？寻找出最直接、最有效、最经济的技术，这就叫适宜技术。

丛玉隆教授

免疫技术看似多而复杂，但按照输出结果归类，无非就是两类：定量分析和定性分析。

定量分析，多数针对的是人体内物质。它将被测物质、物体或现象的可测属性（数量）与一个合适的参考对照相比较，用数值和计量单位表示结果。计量单位是定量分析的第一个属性，只有先确定好单位，谈定量检测才有意义。许斌主任用时下热门事件“青岛大虾”举例说，只谈数值不谈单位是没有意义的，甚至是欺骗。数值是定量分析的第二个属性，它是通过与参考标准比较以后获得的。对于大部分的临床化学项目而言，它们都有标准物质和参考方法，所以可以溯源到国际单位（IU）。但对于很多免疫学物质，既没有标准物质，也没有参考方法，只能依据厂商标准。不同的厂商在建立自己的方法学和分析系统的时候，都有一个自己的标准。很多的厂商就会有很多的标准，这样一来，就给免疫学的溯源、标准化带来了很大的问题。但是，没有标准是不可以做测量的。

定性分析，多数针对的是人体外来物质的化学和物理特性将其识别或分类的一组操作。定性分析只关注分析物的有或无，不关心有多少。定性分析实际上又可以分为两种。一种是纯定性试验，是用肉眼和经验判断结果的。一种是数值化定性试验，用读数仪根据CUT OFF值或阈值判定结果，阳性结果只说明分析信号超过了cut-off值或检测限。纯粹地讲阴阳性，不讲量变是不可以的，定性的背后必然是定量。例如尿试纸中的蛋白量，如何定义是“+”还是“++”？每个厂家必然已经明确了多少mg的蛋白是“+”，多少mg的蛋白是“++”。一定会有一个数值，这个数值就是判定阴阳性的基础。

定性免疫学检验技术的方法很多，大致上又可以分为标记免疫和非标记免疫。非标记免疫技术包括凝集反应、免疫固定电泳和免疫印迹等，非标记免疫技术则包括免疫荧光、免疫胶体金、酶联免疫吸附试验、放射免疫和发光免疫等。目前在免疫学上应用的大部分还是标记免疫。

标记免疫技术的经典代表，就是酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA灵敏度、特异性相对较高，适合批量筛查。但也有它的局限性：一是只能检测到ng水平，极低浓度人群易漏检；二是精密度差（批内CV15-20%）；三是线性范围窄（一个数量级）；四是存在“HD-HOOK”效应，极高浓度的人群易漏检。所以ELISA无法做准确定量，只能用来做半定量和定性试验。

发现这个技术的局限性以后，大家都很关心这个技术以后的发展，并做了很多努力。包括固相载体的改变，聚苯乙烯表面的高级制备，以及信号放大的改变，如酶促荧光、酶促化学发光等。

固相载体的改变，最好的方法是变成珠包被，从而将固相的反应变成液相的反应。反应的速度更快，反应程度更充分，可以做到很好的定量。但是如何把微珠做到均一是技术的难点。

聚苯乙烯表面的高级制备，是指将肉眼所见的平整做成纳米水平的平整。我们肉眼可见聚苯乙烯板的表面非常平整光滑，但是在原子力显微镜的放大下，其实充满了皱褶。包被以后会有很多空白，包被效率非常低；如果能达到纳米水平的平整，包被会更加致密、均一，分析敏感性就会有突飞猛进的增长。

国内企业多数都愿意做物理包被，造成的后果是，孔与孔之间的包被一致性非常差，一个8联排或12联排的试验中，CV会达到12%-20%！这样的板子，去做定量肯定不会有好的重复性。所以，从物理包被向定向包被转变也是一种方向。

化学发光技术的发展，能够把产生和收集到的免疫学反应的信号进行105到1010倍的放大。今天化学发光的独领风骚，就如同90年代ELISA的盛行一样。我们没有从根本上，有系统地去做一些改革，比如说：包被的物质，包被的方法。最主要的是，我们没有明白化学发光最主要的贡献是，它有超宽范围的线性和比较高的分析灵敏度。线性和分析灵敏度的提高，解决的是定量问题，而目前很多的临床需求，并不需要化学发光的精确程度。

不同的检测技术，不管是ELISA也好，化学发光也好，都会存在漏检现象。生物窗口期和检测窗口期都会存在漏检。就生物学而言，免疫的窗口期永远比分子的窗口期要长得多。对于血液筛查来说，要求是及早发现，尽量避免漏检。化学发光虽然有更高的检测能力，但是和ELISA一样都是免疫技术，对于生物窗口期的限制也无法回避。这时候只有依赖核酸检测来将检测时间提前，而这个提前也不可能是绝对的。因此，盲目地追求技术是没有意义的，正视临床的需求才是解决的方法。

医学检验是以标本为中心，以试验数据为目的；而检验医学是以患者为中心，以疾病的诊疗为目的。检验技术的进步是为获得更可靠的结果，而检验结果是为临床诊疗服务的。医学检验必须逐步走向检验医学，要了解检验结果应用于临床诊疗的价值所在。检验结果可以用来做疾病筛查、诊断过程、疗效观察、预后判断和用药指导等等。但是，如果性能不一样，其临床价值也是有差异的。不同的实验室可以测同一个物质，但不意味着就可以做相同的临床决策。

在我们整个的检验方法里，哪些性能是最重要的？首先是“测稳”，分析系统的室内CV、室间CV应满足临床需要。第二个是“测准”，分析系统必须可溯源。第三个是“测对”，随着微生物、免疫学、分子生物学技术的不断发展，检测物越来越多以后，一致性的工作必须从“测对”开始，即从被检物的定义开始。目前来说，在感染性疾病的标志物里，艾滋的一致性比较好，就是因为从一开始，艾滋的定义就非常明确，GP120表明I型，GP41表明II型，P24是抗原。

室内质控的目的，是采取一定的程序和方法，监控和维持检测方法学或试剂盒的性能指标稳定在一定范围内。对于定量项目来说，最重要的性能指标是正确、精密；对于定性项目来说，最重要的性能指标是灵敏、特异，控制灵敏和特异的关键分别是最低检出限和cut off值。所以质控的安排是每分析批至少安排一个弱阳性和一个阴性质控，检测位置不应固定而应随机放置。有的实验室可能会说，我们没有质控或买不到质控，这种情况下可以利用上次检测的患者血清。质控可以利用上次检测的患者血清，上次的阴性或阳性结果可以作为这次实验的外对照；这次的阴性或阳性结果可以作为下次实验的外对照，永远有质控血清，可以是商品化的，也可以是自制的。

许斌主任

免疫学技术发展很快，产品更是数量繁多。按技术可将其分为两类：一类是POCT技术，如固相膜免疫测定；一类是自动化免疫技术，包括自动化免疫浊度分析、自动化发光免疫分析、自动化酶联免疫分析等。前者操作简便，随时随地可以开展，不需要技术人员和专业的实验室。后者需要用到实验室的设施、设备、空间，必须由专业的技术人员来开展。

POCT技术以固相膜免疫测定为主。结合丛玉隆教授的讲述，按理说POCT是以定性为主的技术，但是厂家努力将其转换成定量的技术，让更多的人去使用它。不过用户更应该考虑的是，这项技术是否适合于用在我们具体的临床需求上。用对了它就发挥了它的优势，但是用得不对，这样出来的结果就是有问题的。

自动化免疫技术可以分成两个大块，一块是免疫比浊，包括散射比浊、透射比浊，散射比浊法多用于特种蛋白分析仪，透射比浊多应用于生化仪。另一块是化学发光技术，免疫学反应的特点是特异性很高，但是灵敏度很低，临床上很多微量的物质测不出来，化学发光就是给免疫反应加上了一个放大的技术。随着标记技术的进步，我们已经有了多种多样的发光技术，诸如直接化学发光免疫检测技术、化学发光酶免疫检测技术、荧光酶免疫检测技术，以及电化学发光免疫检测技术等。

面对如此众多的技术，实验室应该怎么去选择适宜自己的技术？检验人员需要明确的一点是，检验科的服务对象其实不是患者，而是临床医生，检验医生是通过临床医生来服务于患者。因此医学实验室的核心任务，一是保证患者每项检查结果准确无误，能反映患者体内真实情况，二是临床医生正确合理地使用检验结果，为患者的诊断、治疗方案确定以及治疗与预后检测服务。

检验结果准确性的决定因素，既有硬件因素，也有流程管理。硬件因素包含人员、设施和环境条件，以及实验室设备、试剂和耗材。流程管理包括检验前程序、检验程序、检验程序的质量保证、检验后程序和结果报告等。

免疫学检验可能存在的问题，是多种多样的。一个是抗体的问题，包括抗体针对表位差异、抗体亲和力差异和抗体标记物稳定性。一个是反应模式问题，例如抗原抗体反应模式多样化和“钩状”效应。还有一个是抗原问题，包括抗原标准化问题、抗原变异问题、表位暴露和丢失，以及抗原标记物稳定性。这些都将导致不同检测系统测定结果一致性差，批内重复性差、批间偏差大，最低检测限不能满足临床需求，临床可报告范围不能满足临床需求等问题。

陶志华主任

临床医生对检验科要求重复性好、满足临床诊疗的特殊需求，具有可比性、量值溯源性。为了达到这个目的，免疫学仪器和试剂的选购与采购，需符合一定要求。首先，是资质要求，三证一定要齐全： 《企业法人营业执照》、《医疗器械注册证》和《医疗器械经营企业许可证》。其次，是性能要求，包括临床实验室质量目标及对检验结果的要求，检验科内部仪器所组成检测系统一致性和测定结果可比性，设备功能能否满足目前以及未来客户需求，即质量、速度、一致性。第三，要考虑仪器放置地的设施和环境条件，仪器设备的电力供应、通风、温湿度等，即合适性。此外还要考虑信息要求、费用和可操作性等。

丛玉隆教授一直在呼吁搭建一个包括生产和研发的产、学、研、用的大平台，今天他也讲到实验室要选择适宜技术。如果我们对生产和研发不了解的话，就很难去选择一个适合我们的技术，那么如何从企业研发和生产过程的角度去选择适宜技术呢？

企业研发所提供的无外乎是两个方向。第一个方向是流程的优化，体现在对仪器的不断改进，这更多的是对硬件方面的一个调整；另一个方向，就是怎样提供更好的项目给到临床。所有的流程优化，都是为了使检验科医生有更多的时间、更多的精力，能够从繁琐的工作中解脱出来。从而使大家能够更多地关注到项目上来，更多地关注到为临床、为病人提供解决方案上来。

为什么说我们选择适宜产品，要对产品研制有一定的了解呢？实际上，一个产品的研制和临床工作是密切相关的。整个产品的研发过程通常分为产品的定义阶段、产品的实现阶段和产品的商品化阶段。临床的检验医师拿到的产品就是处于商品化阶段，这是我们产品研发的最后一个过程。

在这之前有大量的工作要做，第一步就是产品的定义阶段，在产品上市的时候定义是最关键的。对于临床检验医师来说，要选择适宜的技术，那对于厂家来说，也要选择适宜的技术去开发产品。选择适宜的技术包含很多方面，首先就是选择这样一个产品需要满足临床哪些性能，其次就是在临床应用上可接受的价格范围。在产品研发中，我们就会定下这个产品所能满足的临床需求，会从线性、灵敏度、精密度等都给出一个要求，产品满足这一系列条件以后才能被临床所接受，最初就保证了系统的完整性。另外在这个阶段，我们需要明确客户的需求。

可行性分析阶段不仅是对技术的分析，还有对风险的把控。我们既需要考虑技术研发中的风险，也要考虑生产中的风险。在产品研发中，抗体是非常关键的技术，但并不是有了抗体就能研发出试剂来。当我们研发出多种抗体来以后，我们并不一定会选择这种抗体。我们选择抗体，除了考虑其特异性以外，还有敏感度、稳定性，同时还应考虑与系统的匹配度。我们所做的一切，都是为了选择在一个最稳定的系统里面能得出最佳方案的抗体系统。

在这一系列完成以后，才真正进入产品的研发阶段。在这一阶段我们要做原材料的审核，是为了确保批次之间的稳定性。批与批之间的稳定性，最重要的就是原材料之间的稳定性。

所有的产品在研发之初，定义之初，定下这个目标以后就不会再做更改，不会在中间因为实现上的困难或者有风险，就去改变定义。当发现定义出现问题的时候，我们所要做的是推翻以前的定义，从头重新来过。这样能保证我们的产品在从头到尾的研发中，始终按照我们最初的目标来设计。

化学发光试剂有三大核心原材料，即抗体、发光标记物和关键辅助试剂。抗体又分为两类：单克隆抗体和多克隆抗体。那我们该如何去选择抗体呢？多克隆抗体制备价格低廉，同一抗原可以识别多个位点、有更好的耐变性，但是必须制备高纯度抗原；单克隆抗体筛选自同一细胞株，由分子完全一致的抗体组成，只识别单一抗原或表位，但是单克隆抗体生产成本高，对部分检测项目特异性过高。在抗体选择中，我们关注的不是单克隆抗体或多克隆抗体本身，而是关注在这三个方面：高亲和力、具有可测量的标签、高特异性。对于同样的一个检测物，不同的抗体试剂也会带来不同的检测结果。

发光标记技术也非常之多，目前主要的标记技术是吖啶技术。至今吖啶技术已经面世四十年，也获得了非常多的专利，是所有的标记技术中分子量最小的一个标记物，使发光动力学有所提升。吖啶技术的发展目标为更高的发光效能、亲水性、水溶液中的稳定性、更多的结合形式、小分子、快速的反应动力学。

辅助试剂会在洗脱或解离试剂中起到一定作用。例如临床中维生素D的检测，因为VD不溶于水的特性，罗氏通过NaOH解离和对重组VDBP的检测，来达到检测VD的目的。

免疫试剂的研发是一个精密的系统过程。从研发到生产到市场，是整个团队的紧密结合，从设计、计划可行性试验，到客户验证的精密设计，我们旨在为临床提供更多、更优秀的解决方案。

戈敏娟总监