单细胞代谢组学的质谱分析面临的机遇与挑战
【摘要】单细胞代谢组学（SCM）是一种强大的工具，通过深入了解单个细胞之间的差异来研究细胞异质性。随着一系列有前景的SCM管线(计算机流水线)的开发，这一成熟的技术有望在生物医学研究中得到广泛应用。然而，在SCM准备就绪之前，还有一些挑战需要克服。在这篇综述中，我们总结了SCM发展的趋势和挑战，还重点介绍了最新的方法和应用，并概述了与其他组学和成像方法相结合的前景。
传统上，细胞生物学知识是通过分析大量细胞获得的，虽然群体水平的研究对于回答众多生物学问题至关重要，但并非没有局限性。主要是来自可能相关的稀有细胞群的信息被平均化以及单个细胞之间的差异，即细胞异质性。两个基因相同的细胞可以具有非常不同的代谢组，因此，在模型系统中考虑这种细胞间异质性对于更准确地理解细胞生物学的机制至关重要。此外，隐藏的细胞表型在疾病的诊断和治疗中起着关键作用。例如，单细胞代谢的差异可以将乳腺癌细胞分为不同的亚型，这可以为早期诊断和癌症治疗提供新的见解并预测治疗结果。因此，为了填补这些知识空白，单细胞代谢组学（SCM）方法应运而生。
代谢组学涉及识别代谢产物，测量其丰度，并最终阐明控制生物系统行为的代谢相关机制。代谢组学研究传统上使用质谱（MS）或核磁共振进行，由于哺乳动物细胞体积小，检测方法的灵敏度对任何SCM实验的成功至关重要。因此，MS是SCM的首选方法，因为它具有高灵敏度并且能够通过结构解析来识别代谢物。目前基于单细胞MS技术大致可分为成像质谱（MSI）和活体单细胞质谱（LSC-MS）两大类。单细胞MSI通常使用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）或激光烧蚀电喷雾电离质谱（LAESI-MS），可绘制细胞代谢组的三维（3D）图谱。二次离子质谱（SIMS）可以实现更高的空间分辨率，但其代价是通量和所测分析物碎片的增加，从而使下游分析复杂化。MSI方法通常需要大量的样本制备，这会干扰细胞的微环境，进而影响细胞的代谢组。LSC-MS试图通过直接在质谱仪中对活细胞进行取样和测量来解决这一问题，从而将对细胞微环境的破坏降到最低。MSI只允许对气相中的样本和分子进行操作，而活细胞SCM允许在质谱分析之前对液相中的样本进行操作，从而获得更多的定量结果或通过衍生化（derivatization）等方法提高灵敏度。
尽管这些单细胞MS方法很有前景，但在大规模应用于生物学研究之前还需要克服一些挑战。首先，样本量小和代谢物转化速率对灵敏度以及在最小扰动情况下表征代谢组的能力提出了很高的要求；其次，传统的代谢组学方法，如液相色谱-质谱（LC-MS），由于样本量有限，完全不适合单细胞分析；第三，实现高通量单细胞采样是一项重大技术挑战；最后，定量和数据分析，尤其是在非靶向代谢组学方面，仍处于发展阶段。在这篇综述中，我们将批判性地讨论SCM的新方法和挑战，以及进入SCM黄金时期所需的条件。
一、单细胞代谢组学与质谱
单细胞代谢组学与其他组学不同，由于代谢物的结构多样且浓度范围随时间快速变化，因此无法放大代谢检测信号。此外，SCM需要精确的单细胞分离方法和灵敏的仪器来检测最小体积的代谢物。SCM-MS可分为成像单细胞MS和LSC-MS两大类。以下部分将讨论这两种方法的最新进展和挑战（图1）。
图1. SCM不同方法的示意图
1. 成像单细胞质谱：单细胞成像MS中最常用的方法是MALDI-MS。通常，MALDI-MS检测首先将所需样本与基质混合，然后在真空条件下用紫外激光束照射，随后，分析物被电离并加速进入MS。近年来，一些研究将基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术与光学显微镜技术相结合，不仅提供了细胞的代谢特征，而且提供了更准确的空间信息和细胞的形态特征。例如，Luca Rappez等人开发的SpaceM平台结合了MALDI-MS和光学显微镜来进行单细胞检测。SpaceM基于对哪些细胞组分被MALDI激光局部烧蚀的精确估计，这是通过将具有亚细胞精度的细胞显微镜图像与MALDI激光烧蚀标记的显微镜图像进行匹配来实现的。最终，SpaceM为每个细胞生成一个空间分子矩阵，其中包含标准化的代谢特征和显微镜衍生的表型属性，如细胞荧光强度和形态空间特征。MALDI-MS技术的主要优势在于其高通量，一个很好的例子是SpaceM能够以1000个细胞/小时的通量检测每个细胞中的100种代谢物和脂质。MALDI-MS的主要局限性是在测量之前需要对细胞进行处理，这增加了可能导致代谢变化的扰动机会。
LAESI-MS试图通过当细胞在细胞环境中仍存活时对其进行采样来规避这一问题。Michael J. Taylor等人报告了一项很有前景的技术，他们将显微镜集成到LAESI源的光柱中，从而实现可视化的环境原位单细胞分析，结合漂移管，离子迁移质谱（IM-MS）可使系统以高置信度识别结构及其在组织中的空间位置，以分析洋葱表皮细胞的代谢物含量，其中已报告25种注释代谢物。虽然LAESI-MS的扰动/破坏较小，但它的通量和覆盖率相对低于上述MALDI-MS方法。此外，由于目前的光斑尺寸为±50μm，该方法不太适合研究平均直径为±10μm的典型哺乳动物细胞。总之，单细胞成像MS方法可以具有非常高的通量，并且可以提供更多的空间信息，但除了一些例外，它通常需要在分析前对样本进行预处理，这可能会对真实的代谢特征产生影响。此外，它们通常只是定性方法，这主要是因为样本（如细胞）是在气相中操纵的，没有简单的方法来添加内标进行定量。
2. 活体单细胞质谱：LSC-MS方法设计目的是在对细胞微环境造成最小扰动的情况下对细胞进行采样，理想情况下，与成像MS方法相比，LSC-MS方法还具有更高的定量性能。典型的装置包括一个连接到显微镜3D微操作器的微量移液器。在显微镜观察下对细胞进行采样，然后通过直接进样MS（DI-MS）或通过纳米LC-MS（nano-LC-MS）分离后转入MS。Masujima等人报道了一种基于DI的LSC-MS方法，这是最简单的样本操作方法之一，使用涂层毛细管(也是纳喷雾发射器)收集细胞并将其引入MS，该方法对细胞的很小，还可以通过在电离溶剂中加入内标实现相对定量。然而，由于没有代谢物分离和富集步骤，其生化分辨率较低。为了解决这个问题，Hsiao-WeiLiao等人使用场放大样本进样毛细管电泳电喷雾电离质谱（FASI CE-ESI-MS）检测了单个神经元中的37种细胞内代谢物。除了与毛细管电泳相结合外，纳米液相色谱（Nano-LC）也是一种分离代谢产物以达到高生化分辨率的好方法。如Kohta Nakatani等开发了基于高灵敏度纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）的SCM分析系统。他们利用单细胞体内取样和nano-LC-MS/MS的方法，成功地从单个HeLa细胞（n=22）中检测到18种相对丰富的亲水代谢物（16种氨基酸和2种核酸相关代谢物），并将这22种HeLa细胞分为三个不同的亚类，表明培养的HeLa细胞群在代谢功能上存在差异。
虽然与分离方法相结合可以获得更高的生化灵敏度，但在样本采集和处理过程中需要一系列步骤，这些步骤都会对细胞内代谢产生重大影响。Yan Zheng等人建立了一种高性能功能探针电喷雾质谱法（FPESI-MS）来解决这个问题。该方法使用自制的线性手动操作器进行直接活细胞采样，然后利用氮气聚集/气体加热系统对分析物进行解吸，并使用还原氧化石墨烯功能铜探针将产物离子聚集成离子簇，在尽可能还原活细胞生长环境的条件下提高离子传输和检测效率。他们利用FPESI-MS成功分析了阿尔茨海默病（AD）大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤（PC12）单细胞中的7种AD相关神经递质、16种生物标志物和12种血清代谢物，该方法有望用于体内生物样本和代谢物的快速检测。LSC-MS方法并非没有局限性，其中一个限制是，由于单细胞取样困难，要获得大量具有统计学意义的数据非常困难，这可以通过自动化来解决，目前市场上已有几种自动化单细胞取样平台；另一个限制因素是缺乏样本制备，因此难以进行定量，也难以检测某些需要衍生化的难以电离的化合物。
二、单细胞代谢组学的质谱分析，准备好迎接黄金时期了吗？
如前所述，SCM成功地获得了单细胞水平的细胞代谢信息，提供了有价值的生物医学见解。SCM领域正在走向成熟，然而，由于代谢组中代谢物的化学组成复杂，以及所分析的单个细胞的尺寸非常小，SCM仍然面临着一些挑战。此外，由于所有方法仍很复杂，且主要侧重于实现高灵敏度和动态范围，因此对稳健性、可重复性、数据共享和整合的重视程度较低。在报告每种方法的实验和生物参数时，缺乏可遵循的标准化模式，这进一步加剧了上述问题。代谢组学的标准化倡议就是这种模式的一个例子，它可以调整并应用于单细胞实验。基于这些挑战，整个领域正朝着更高的通量方向发展，以克服技术差异、数据分析和更高的数据质量，并与其他组织学技术相结合，以获得更全面的描述细胞生化行为的图像。在下一节中，我们将重点介绍这些有助于SCM达到黄金时期的技术。
1. 高通量单细胞代谢组学：微流控和SCM等高通量技术的联合应用对提高SCM分析的通量至关重要。在这方面，Zhang等人开发了一种基于微流控的方法，将螺旋惯性微流控和IM-MS相结合，产生了一种高通量的SCM方法，具有更高的生化分辨率。该方法最初是将悬浮在甲醇中的细胞集中到螺旋微通道中的单一细胞流中，分离后的细胞流被转移到纳米电喷雾针进行裂解和离子化，随后通过IM-MS进行实时分析。该分析系统每分钟收集6-8个单细胞代谢指纹图谱，并将气相碰撞截面测量作为额外的分子描述符，从而提高代谢物鉴定的可信度。另一种可用于提高SCM通量的技术是流式细胞术（FC）。Yao等人提出了一种通用策略，利用无标记质谱法（流式细胞电喷雾电离质谱法，CyESI-MS）结合自制的数据处理工作流程，揭示白细胞的异质性，筛选分化的代谢物作为白细胞亚型的候选生物标志物。该方法的通量高达40个细胞/分钟，注释了36种显著不同的代谢物，并清楚地区分了五种白血病亚型。这些技术对于提高任何SCM实验的统计功效至关重要，然而，上述方法产生的大量数据需要特别考虑，以便将统计结果可以转化为生物学见解。此外，此类方法中通常涉及对细胞微环境的操纵，这可能会导致细胞代谢组的变化，例如氧化还原状态的改变。根据要回答的生物学问题，这可能会对产生的数据产生重大影响，特别是在没有适当控制的情况下，例如检测接受微流控处理的细胞与直接微采样的细胞可能的代谢变化，强调了前面讨论的所有方法之间的关键差异的摘要见表1。
2. 数据分析和共享：基于MS的SCM数据分析与共享是该领域走向成熟的又一重要步骤，基于MS 的代谢组学测量的典型读数是检测到的质量电荷比（m/z）特征及其丰度的大型矩阵。在非靶向实验中检测到的特征数量通常在数万个，而样本的数量通常比样本的数量少几个数量级。由于其固有的复杂性，通常实施多个（预处理）处理步骤来转换和减少数据到一个更易于管理的规模，并过滤掉噪声和假阳性。因此，透明的处理管道对于将原始数据与生物学解释联系起来非常重要。此外，与基因组、转录组等不同，单细胞代谢组没有自己的数据库供研究人员参考，缺乏安全开放的数据共享和存储环境也阻碍了不同实验室之间的信息交流与合作。提出“可查找性、可访问性、互操作性和重复使用性”倡议的目的就是为了解决这些局限性，并改善不同实验室之间的数据共享。最后，整合来自多个组学的实验数据以获得更准确信息的唯一方法是获得更多的定量数据。实现定量SCM的方法有两种，第一种是在测量过程中添加内部标准，第二种是使数据处理更加标准化以减少技术差异，并使用数学标准化技术生成尽可能多的定量数据。
3. 代谢组学背景：尽管有上述创新，单细胞MS数据距离生物学真相的接近程度仍不清楚。了解这一点的唯一方法是结合上下文信息（context information）查看SCM中MS实验生成的数据，这可以通过将显微成像等其他技术与基于MS的单细胞方法相结合来实现。通过这种整合，可以检测单细胞MS数据与基于报告的成像数据等相比的偏差，后者可以说更接近生物学真相。这还将带来额外的好处，即量化每种单细胞MS方法中样本制备引起的不良扰动的程度，并可能突出对此类扰动有抵抗力的代谢途径。在上下文中查看单细胞MS数据的另一种方法是将获得的数据与其他组学信息相结合，以捕捉完整的生物学图像。目前有多种交叉组学计划试图实现这一目标。这些交叉组学计划对于深入了解单细胞水平的细胞行为至关重要。如果没有上下文信息，SCM数据在临床或药物研发环境中的可转化性将受到限制。
三、结论
SCM在各个领域发展迅速，但仍有许多挑战需要解决，例如如何提高检测灵敏度、实现高通量、与其他组学集成、优化标准化数据处理和数据共享方法等。尽管存在这些挑战，但我们可以预期，在不久的将来，单细胞MS代谢组学将在基础研究和临床应用中得到广泛应用。
编译节选自：《Current Opinion in Biotechnology》, Volume 82, August 2023, 102963
