实验室和床旁检验系统的IFCC校准HbA1c结果比对

鉴于HbA1c与糖尿病控制和并发症试验（DCCT）及英国前瞻性糖尿病研究（UKPDS）描述的并发症之间的关系，其对糖尿病管理来说很重要。以上两个临床试验均利用Bio-Rad分析仪，通过离子交换高效液相色谱法（IE-HPLC）报告HbA1c结果。最近，世界卫生组织（WHO）、国际糖尿病联盟（IDF）和美国糖尿病学会（ADA）建议将HbA1c≥6.5%（48 mmol/mol）选作临界值，用于诊断糖尿病，依据是其与流行病学研究中糖尿病视网膜病变的关系。

HbA1c是一个衡量葡萄糖的很有吸引力的指标，因为在血液收集后HbA1c更稳定，也不受短期血糖变化的影响，不需要空腹或者耗费时间的程序，比如口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。采用各种技术包括IE HPLC、免疫化学法或硼酸亲和色谱法，在实验室和床旁检验（POCT）中很容易测量HbA1c水平。继引进IFCC HbA1c参考方法之后包括自2003年以后用于针对常规方法校准的质谱法和毛细管电泳法，当然指南建议使用经过国际临床化学和检验医学联合会（IFCC）精密校准的方法。

德国和美国的某些指南不建议采用单一的HbA1c诊断临界值，而是采用一个范围，例如≥7.5%（58 mmol/mol）诊断为糖尿病，≤5.5%（37 mmol/mol）且后续个体葡萄糖测试结果在5.5%（37 mmol/mol）和7.5%（58 mmol/mol）之间则排除糖尿病。当临界值用于诊断糖尿病和缩小前期糖尿病范围时，了解现场方法（field methods）与IFCC HbA1c方法之间的偏差很重要。

在本研究中，我们采用经过美国糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）认证以及实验室和POCT广泛采用的6个系统，测量了128名血红蛋白结果正常的糖尿病患者的IFCC校准后HbA1c水平，见表1。我们将这些结果与基于荷兰一家实验室的IFCC二级参考方法（IFCC SRM）的HbA1c结果相比较，这家实验室采用经过专用IFCC校准品校准过的IE HPLC分析仪。该IFCC SRM用于质量保证材料和其他材料的赋值（assignment）。我们利用接受OGTT试验且并行HbA1c测量结果已被作者发表的两个患者数据集，将HbA1c差异转换成对糖尿病患病率估算的影响。另外，我们在分层覆盖整个范围的45份患者样品中比较了研究期间Tosoh设备使用的校准品与2013年9月/10月欧洲发布的修订校准品。

1.研究设计和方法

该研究从西米德兰兹郡本土研究伦理委员会获得了伦理批准并且符合赫尔辛基宣言的最新修订版。

1.1 研究人群

葡萄糖、果糖胺和HbA1c研究（GFH1）招募了在糖尿病中心接受常规1型或2型糖尿病护理并且血红蛋白水平正常的成年患者（n=128）。利用实验室和POCT分析仪测量临床生化实验室EDTA血样和2007年6月至2009年6月期间糖尿病中心毛细管肝素化血样的HbA1c水平，见表1。招募结束后，利用另外两个离子交换HPLC分析仪测量了2010年3月至4月EDTA血样的HbA1c水平和利用IFCC SRM测量了储存于-70℃血样的HbA1c水平，见表2。

1.2 HbA1c方法

如下文所述，将三台IE HPLC分析仪、一台亲和色谱分析仪和两个POCT系统与IFCC二级参考方法相比较，见表1。

表1  厂商和GFH1研究的HbA1c方法信息

表2  IFCC校准现场方法与IFCC参考方法之间的HbA1c比较，n=128

1.3 离子交换HPLC

两台Tosoh G8 IE HPLC分析仪分别位于糖尿病中心和大学医院Birmingham NHS Foundation Trust临床生化实验室。Bio-Rad Variant II NU 和Menarini HA8160 IE HPLC分析仪位于文中提到的其他实验室中。IFCC SRM Menarini HA8160离子交换HPLC分析仪位于荷兰一家IFCC二级参考实验室。

1.4 床旁检验：免疫化学法

A1cNow+一次性、手持试剂盒经过校准和设定，利用提供的试剂可执行十次分析。试剂盒包含机载内部质控品（IQC），但是用每批样品分析了额外的IQC（Bio-Rad Lyphochek®糖尿病质控品水平1和2）。由于耗材有限，不能测量所有样品（n=113）的HbA1c水平。自从执行了该研究，厂商就在试剂盒宣传单上指出：根据美国病理学家协会（CAP）的最新数据，EDTA具有干扰性。DCA 2000®+分析仪经过每批试剂特定试剂卡的校准。

1.5 硼酸亲和色谱法

采取两点校准，在每批开始和结束时，在Primus Ultra2分析仪上分析厂商提供的IQC样品。

1.6 校准

个体实验室根据自己的常规标准操作程序对试验进行校准。所有厂商均证实了IFCC-校准品的供应。IFCC SRM Menarini HA8160 IE HPLC分析仪用IFCC网络三个水平校准品组合（批号2009.1021; 2009.1022; 2009.1023）校准。

1.7 GFH1研究完成后厂商对Tosoh G8 IE HPLC分析仪重新校准

2013年9月，Tosoh通过产品信息宣传单（发布新的“血红蛋白HbA1c校准品”，批号ZS3001）建议欧洲的实验室人员立即修订校准品。宣传单指出‘对于HbA1c水平在6%-7%（NGSP）或者42-53 mmol/mol（IFCC）之间的样品，新一批校准品（与当前校准品相比）能够检测出0.1%-0.2%（NGSP）或1.4-2.2 mmol/mol（IFCC）的差异，取决于使用的特定批次。基于0.3%标准（NGSP），这些差异是可以接受的。对于HbA1c水平<6%和HbA1c水平在7%-10%（NGSP）之间的样品，新一批校准品（与当前校准品相比）能够检测出的HbA1c水平下降幅度分别是≤0.2%和≤0.3%。’

该通知发布后，在实验室Tosoh G8 IE HPLC分析仪上利用当前使用的校准品批号ZS2002和新的修订后校准品批号ZS3001测量了45份EDTA血样和IQC样品。

1.8 质控（QC）

厂商推荐的IQCs与为成批处理样品提供的额外材料一起使用。

1.1.9 样品采集和储存

利用Tosoh G8 IE HPLC分析仪，从糖尿病中心获得112名患者肝素化毛细管血中的HbA1c水平。对于剩下16名患者，在实验室中利用相似的分析仪测量静脉EDTA血液中的HbA1c水平，见表2。

另外，用Primus Ultra2亲和色谱分析仪（n=128）和两种POCT方法A1cNow+试剂盒（n=113）及DCA 2000®+分析仪（n=128）在实验室测量EDTA血液的HbA1c水平。可能的情况下在血液采集后5天内执行测量，否则将样品储存于-70℃。请注意在这些POCT设备上检测血样时通常不将血液采集到EDTA试管，但是由于研究需要获得患者同意，所以不能就地试验。

根据研究方案，128份EDTA静脉全血样品分别等分为三份，每份750μL，装入2mL微管并储存于-70℃。2010年3月，这些样品通过干冰运输到外部实验室，供IFCC SRM、Bio-Rad Variant II NU和 Menarini HA8160分析仪测量。接收时样品储存于-70℃，使用时解冻。按照实验室的标准操作程序，在不同的天分6批分析样品与研究提供的IQC材料（Bio-Rad Laboratories Ltd.的冻干制品Lyphochek®水平1和2）。根据厂商说明复溶IQC材料，等分试样并储存于-20℃。

1.10 额外研究

利用IFCC SRM、Menarini HA8160和实验室Tosoh G8分析仪，在随后的试验/天测量分层涵盖整个范围（n=23）的等分试样子集的HbA1c水平，重复测量两次。

1.11 统计分析

将数据输入到excel表格，输入完成后由另外一名人员核查。使用Excel和Analyse-it 2.22版本（Analyse-it Software Ltd., Leeds, UK）执行统计分析。HbA1c结果由研究中心报告为DCCT统一单位，在分析前用以下公式IFCC=（NGSP-2.15）×10.929转化为IFCC单位。其他实验室用IFCC和DCCT双重单位报告HbA1c。本文引用的CVs是从DCCT统一单位（%）计算而来，但是应该注意的是，根据转换公式的特点用IFCC单位计算的CVs更高。

通过每种方法的Bland-Altman差异图，比较不同的HbA1c测量方法与IFCC SRM。列出了每个数据点，基准线（无差异），平均差和1.96 SD线。计算每个试验与IFCC SRM的Pearson相关系数（r2）。学生t-检验用于提供各种其他比较的p值。研究期间，糖尿病中心

Tosoh G7分析仪被升级为G8分析仪，利用来源于两个系统分析样品的线性回归方程重新调整（re-alignment）结果（G8 HbA1c=0.9532 ×G7 HbA1c+0.1138, n=49）。全球HbA1c测量标准化共识声明发布后，也就是Tosoh对校准品值实施了新“目标（anchor）”，需要更进一步调整结果。厂商提供的回归方程如下；重新调整的HbA1c=0.917×原来的HbA1c+0.407, n=729。实验室Tosoh G8分析仪不需要重新调整，因为该系统的所有分析都是在转变之后完成的。国家质量保证计划（NEQAS, UK）将Bio-Rad Variant II NU与其他Variant II分析仪区分开来，但是Bio-Rad证实各种Variant II系统之间不存在显著差异。

审查以诊断为目的接受OGTT和获得并行HbA1c测量结果的患者数据集，使用这些数据集和本文中转诊到大学医院进行糖尿病治疗的患者数据集的概率密度函数图，以评估常规试验与IFCC SRM之间的偏差的影响，见图2和3。

图1.（a）由不同IFCC校准现场方法与IFCC SRM测定的HbA1c值散点图和回归线，n=128。IFCC SRM，上面的直线从左至右：●Tosoh G8，●Menarini HA8160，●Siemens DCA 2000®+，下面的直线从左至右: ●Bio-Rad VARIANT II NU，●Primus Ultra2，●Bayer A1cNow+。

（b）由不同IFCC校准现场方法与IFCC SRM测定的HbA1c值差异图，n=128。符号颜色的意义同（a），基准线，---平均差，…1.96 SD。

（c）2013年9月/10月经厂商重新校准（校准品批号ZS3001）后与使用具有GFH1研究所用校准品等当偏移的校准品（批号ZS2002）时Tosoh G8 IE HPLC分析仪的差异图，n=45。

图2. IE HPLC试验的偏移对糖尿病患病率的影响，研究人群为在英国伯明翰和澳大利亚接受OGTT试验并且获得并行HbA1c测量结果的患者。4083名具有糖尿病风险因素的澳大利亚患者（Bio-Rad Variant II Turbo IE HPLC分析仪）。1457名空腹血糖受损的英国患者，6.1-6.9 mmol/L（Tosoh G8 IE HPLC分析仪）。

图3. 接受OGTT试验患者和糖尿病患者分析方法比对获得的HbA1c的概率密度函数图。符号颜色的意义同图1a。

2.结果

经过IFCC SRM测量，128份血样的HbA1c范围在5.3%-11.9%（34-107 mmol/mol）之间，见表2。获得的试验间CVs与厂商引用的CVs相当，免疫测定POCT方法分散增强表示不精密度，见表1和图1。在分层的23个样品子集中，IE HPLC分析仪两次重复测量的差异最小，IFCC SRM HbA1c平均差（1SD）为-0.06%（0.09），p=0.004（-0.7（0.9）mmol/mol）；Menarini HA8160分析仪（仅仅n=19）平均差为0.05%（0.10），p=0.046（0.5（1.1）mmol/mol）；实验室Tosoh G8分析仪平均差为-0.02%（0.07），p=0.171（-0.2（0.8）mmol/mol）。

实验室/POCT方法与IFCC SRM之间的HbA1c差异显著，所有p值均<0.001，见表2和图1。很小的正偏差出现在Bio-Rad Variant II NU分析仪+0.33% HbA1c（3.6 mmol/mol），和糖尿病中心的Tosoh G8分析仪+0.22% HbA1c（2.4 mmol/mol）。对于常规医院实验室的Menarini HA8160分析仪，偏差非常小-0.04% HbA1c（-0.4 mmol/mol），类似于两次重复测量之间的差异。负偏移出现在Primus Ultra2亲和色谱分析仪-0.23% HbA1c（-2.5 mmol/mol）和DCA 2000®+免疫测定分析仪-0.13% HbA1c（-1.4 mmol/mol）。方法之间的偏移差异经过该研究的内部质控结果和全国室间质评计划证实。A1cNow+一次性、免疫测定试剂盒在EDTA血液中的差异为-0.7% HbA1c（-7.7 mmol/mol），与2013年美国病理学家协会（CAP）的数据类似，可能归因于EDTA的存在。研究结束时利用实验室Tosoh G8 IE HPLC分析仪重新测量冷冻于-70℃的23份EDTA血样，证实了Tosoh G8 IE HPLC分析仪与IFCC SRM之间的偏移最大，+0.30%（0.12）（+3.3（1.3）mmol/mol）HbA1c，p<0.001。

在英国伯明翰，1457名空腹血糖受损（6.1-6.9 mmol/L）的患者由其家庭医生推荐进行OGTT以诊断糖尿病，并在糖尿病中心利用Tosoh G8分析仪测量其HbA1c水平。在澳大利亚墨尔本，4083名由于各种原因存在糖尿病风险的患者被推荐进行OGTT，并利用Bio-Rad Variant II Turbo分析仪测量其HbA1c水平。从数据集中排除了血红蛋白正常的患者。图2表明用不同的IE HPLC分析仪测量两个人群的HbA1c时，研究鉴别的较小偏差对糖尿病患病率的影响。本文报告的方法比对和OGTT数据集的概率密度函数图，如图3，突出了糖尿病患者和刚被诊断为糖尿病患者的HbA1c分布差异，还强调了不同的HbA1c测量方法的偏移。

2013年10月引进修订的Tosoh校准品以后，导致产品信息宣传单列出的HbA1c值下降，也就是GFH1研究鉴别的与IFCC SRM的HbA1c范围偏差。校准品批号（ZS2002）与本文所用的校准品批号可比较，45份血样的中值四分位距（IQ范围）是HbA1c 7.5（6.3–9.7）%，即（58（46–83）mmol/mol），最小值5.4%（36 mmol/mol）和最大值12.3%（111 mmol/mol），而对于修订校准品，中值四分位距是HbA1c 7.4（6.2–9.6）%，即（57（44–81）mmol/mol），最小值5.4%（35）mmol/mol和最大值12.0%（108 mmol/mol）；r2=0.999， p<0.0001。校准品之间（修订校准品[RC]与GFH1研究校准品[PC]）的差异（平均1SD）是-0.23mmol/mol（0.06%）或-2.5mmol/mol（0.6%），如图1c。线性回归方程如下：HbA1c[RC]=-0.044+0.9866 HbA1c[PC]，单位为% 或HbA1c[RC]=-0.797+0.9866 HbA1c[PC]，单位为mmol/mol。校准品修订后，IQC也反映出检测偏移变化，如附加的宣传单“使用校准品批号ZS3001时校准品和质控品值”所示，Tosoh 2013年9月发布的IQC引用了新范围。

3.结论

同一患者的HbA1c变化达到0.5%（6 mmol/mol）-1.0%（11 mmol/mol）及以上在糖尿病管理中被认为是临床上显著的，目标值是6.5%（48 mmol/mol）或 7.5%（58 mmol/mol），视情况而定。然而，由于单一临界值HbA1c≥6.5%（48 mmol/mol）被推荐用于诊断糖尿病且前期糖尿病的HbA1c范围在5.7%（39）或6.0%（42 mmol/mol）到6.4%（47 mmol/mol）之间，HbA1c试验的性能评估标准已经变了，因为很小的试验性能变化将导致人群分类变化。

虽然常规HbA1c测量方法是用IFCC参考方法校准的，但是要弄清楚IFCC校准方法和NGSP认证方法是否存在影响诊断程序的准确度和不精密度差异。本研究显示，在血样范围内（作为与糖化无关的常数），两台IE HPLC实验室分析仪获得的HbA1c值明显高于IFCC SRM的HbA1c结果。与IFCC SRM相比，Tosoh G8 IE HPLC分析仪正偏差（平均差）HbA1c 0.22%（2.4 mmol/mol），p<0.001，Bio-Rad Variant II NU IE HPLC分析仪正偏差HbA1c 0.33%（3.6 mmol/mol），p<0.001；两者偏差均较小。常规医院实验室的Menarini HA8160 IE HPLC分析仪与IFCC SRM之间的差异显著，p<0.001，

但是偏差更小，负偏差-0.04%（-0.4 mmol/mol）；该结果并不令人惊讶，因为该IE HPLC分析仪与IFCC SRM使用的分析仪相同，不过是用厂商的校准品而不是IFCC SRM校准品校准的。

被研究的特定HbA1c试验的偏差将导致不同比例的人群被诊断为糖尿病，取决于使用的试验。本研究于2007年至2010年期间执行，将在两个接受OGTT试验的人群中观察到的正偏移转化为IFCC SRM HbA1c值使糖尿病的患病率降低了大约三分之一，英国伯明翰使用Tosoh G8分析仪获得的HbA1c结果从36%降低到22%，澳大利亚墨尔本使用Bio-Rad分析仪获得的HbA1c结果从24%降低到15%，见图2。由于执行了该研究，我们被告知正偏移出现的原因是Bio-Rad调整了他们的校准，证据可见2013年CAP评审。

另一个实验室亲和色谱分析仪与IFCC SRM相比，HbA1c负差-0.23%（-2.5 mmol/mol），p<0.001，使常规实验室分析仪之间的HbA1c差异可能达到0.6%（6mmol/mol）。与IFCC SRM相比，使用该分析仪将低估糖尿病的患病率。虽然不精密度可接受，但是由于人造校准材料而不是血液产生的基质效应在校准过程中可能引入偏移，见图3。实验室/POCT方法之间的细微差异在NGSP认证的准确度限度内。

本研究的局限性在于只包括少数分析仪和特定批次的试验耗材和校准品。另外，有些样品是经过-70℃储存后在研究结束时才测量的。但是，研究结果与厂商的期望一致，并经过内部质控和全国室间质量保证计划证实，例如英国室间质评服务（UK NEQAS）和CAP。A1cNow+一次性试剂盒的性能可能受到EDTA影响，因为在研究完成后其厂商在试剂盒说明书中指出EDTA具有干扰性。本文不包括常规自动化临床化学分析仪广泛使用的免疫测定方法，这些试验不检测异常的血红蛋白。在近期发表的一篇文章中，免疫测定方法与Bio-Rad IE HPLC分析仪相比，相关性r2=0.996，但是散点图显示出Bio-Rad（9.5%（80 mmol/mol））与Cobas c502（8.6%（70 mmol/mol））的读数差异显著。

IFCC校准方法之间的差异与未充分考虑使用的HbA1c测量分析仪而在一定程度上归因于研究人群一致。在以前发表的一篇文章中，我们将英国与澳大利亚的OGTT数据与并行HbA1c测量联系在一起，尚不清楚引用的HbA1c范围差异是否与人群、取样或分析仪有关。在伯明翰，糖尿病中心用Tosoh G8测量HbA1c，而在澳大利亚则用Bio-Rad Variant II分析仪测量HbA1c；本研究发现这两种分析仪与IFCC SRM相比，偏移差不多高。图2中两个人群的HbA1c分布显示了常规IFCC校准方法之间的结果差异将如何影响被诊断为糖尿病的患者数量。图3说明了基于不同诊疗人群的HbA1c试验性能要求。值得注意的是自从2012年6月起伯明翰使用HbA1c诊断糖尿病以来，医院实验室的HbA1c年工作量增加了75%，相反只执行了少数OGTT试验。

2013年9月/10月，Tosoh引进了一种新的校准品使他们的HbA1c值向下修订，产生的结果与本研究中的Menarini分析仪和引进修订校准品后Bio-Rad IE HPLC分析仪的结果相似。本文展示的Tosoh IE HPLC数据没有按照新的修订校准品调整，但是2013年10月的比较数据表明本研究发现的与IFCC二级参考方法的偏移已被消除，见图1c。

总而言之，目前除了糖尿病患者治疗以外，以诊断为目的的IFCC校准与NGSP认证HbA1c试验的特殊性能要求存在一定争论。虽然HbA1c与OGTT试验的关系存在很大争论，一直有系统综述来评价HbA1c的诊断价值，但是很少讨论HbA1c测量方法。在广泛的HbA1c范围内，本研究鉴别的IFCC校准方法之间的偏差即细微差异将显著影响糖尿病的患病率估计。在评估个体/人群的HbA1c时，考虑HbA1c测量方法（以及厂商所做的校准修订）很重要，尤其是当HbA1c用于诊断目的。

         （摘自DIABETES RESEARCH AND CLINICAL PRACTICE，版权归其所有，仅供内部学习）

编译：王小茜