免疫层析方法学 灵敏度的探讨

免疫层析法[1、2]快诊试剂因为其简便、快速、设备简单等优点，近年来在床边临床诊断领域获得快速发展。关于免疫层析这种方法学检测试剂的优缺点也不乏专业评述，包括灵敏度、准确性、精密度、稳定性等等性能指标。这些评述中褒贬皆有。最主要的分歧在于对该方法的灵敏度的看法存在较大分歧。有的学者或商家号称通过某种物理信号放大或修饰等方法可以极大地提高灵敏度，而某些终端用户却认为实际使用情况与预期相差甚远。为什么会有如此巨大的分歧？这个疑问困扰着业内众多人士。我们不考虑极其个别的虚假宣传的现象，单从纯技术的角度在中立客观的立场，来试图对以上问题进行探讨。

我们经常听到某些厂家或学者宣称采用某种特殊物质制备标记抗体能够大幅度提高检测灵敏度云云。对于这种说法我们暂不评论是非。先来探讨检测灵敏度的影响因素。影响检测灵敏度的首要影响因素是抗体的亲和性，抗体和抗原的亲和力越强，灵敏度越高，试想如果抗体和抗原根本就不结合，何谈灵敏度？抗体的亲和性决定着灵敏度的潜在最高限，同理，后续方法学的建立，标记物信号的放大都是试图尽可能接近这个潜在最高限而不能超越。其次是反应时间也决定着灵敏度的高低。当反应速率不变的情况下，抗原和抗体混合的时间越长越接近达到反应平衡，越获得更高的灵敏度。在化学发光免疫诊断试剂中，抗原与抗体在液相中充分混合至少反应10分钟以上，有时还需要震荡反应以提高反应速率，因此比较容易获得较高灵敏度。免疫层析法试剂是通过样本裹挟着标记物侧向层析，流过T线或C线的瞬间发生免疫反应，这个过程一般只有几秒钟，另外免疫层析法试剂一般是室温静置反应，因此不能通过震荡或提高温度来加快反应速率。最后在化学反应平衡不变的情况下，可以通过增大反应物的浓度即抗体的浓度提高检测灵敏度。在实际应用中就是通过增大包被抗体和标记物的量来提高灵敏度。而NC膜的抗体吸附量是不可能无限增大的，因此往往只能在标记物的制备上做些文章。胶体金标记物是通过物理吸附的方式将抗体连接到金颗粒表面，因此抗体吸附量是最低的，其他几种免疫层析法标记物的制备都是通过共价偶联的方法将抗体偶联到微球表面，因此相对来说这几种免疫层析法的灵敏度会高于胶体金。就免疫层析法与磁微粒化学发光法比较而言，磁微粒化学发光法在包被端就采用共价偶联法制备，它的抗体吸附量远大于NC膜的吸附，所以在其他条件一致的情况下，免疫层析法试剂总是比同类型的化学发光法试剂的灵敏度差一点的。

随着科学技术的进步，免疫层析法又细分出众多分支，其核心就是通过在抗体上标记不同的示踪物质，通过检测这些示踪物的不同物理信号来提高灵敏度，有的商家甚至号称自己的产品能达到化学发光同类产品的灵敏度。作者也对不同的示踪物进行了调研，大体分类如表1。

表1所描述的不同标记物的优点往往都是商家的主要宣传点。往往将标记物的信号采集的灵敏度与整个试剂的灵敏度混为一谈。从上述的影响灵敏度的各种因素我们分析了对于免疫层析试剂而言，其所谓的灵敏度是指检测抗原的灵敏度，它是一个综合的结果，某一单一参数的提高不能以偏概全。

通过以上分析，我们认为灵敏度不可能无限制的提高，总有一个潜在的最优值。一切后续的方法学改良都是尽量接近这个值，通俗的说是任何的操作改进只是少减分。影响灵敏度的众因素中抗体的亲和性是根本，而标记物的制备特别是共价偶联法制备的标记物容易损害抗体的亲和性。其微观过程是：抗体的特异性和亲

表1.免疫层析法标记物分类

和性是由Fab段的几个氨基决定的，共价偶联时添加的偶联剂，比如戊二醛或碳二亚胺等活化抗体时，这些小分子偶联剂是无法定向识别位点的，如果将Fab段的氨基偶联上，就会大大降低抗体对抗原识别的特异性和亲和性。外在表象就是试剂检测基质血清的信号明显升高，这并不是背景信号，这是实实在在免疫反应以后的标记物发出的信号，因此不可能通过表1中的各种后续的细枝末节的改良来提高灵敏度。表1中各种标记物提高灵敏度的前题是标记过程不伤害抗体的亲和性和特异性。

因此我们认为提高灵敏度首要关注的应该是改进标记工艺，将抗体的损伤减少到尽量低。另外对于用户来说需要知道试剂的灵敏度并不是某单一的试剂组分的灵敏度，它取决于整个试剂的整体工艺，这样才能不被宣传和实际应用间的巨大差异而困扰。

总之，免疫层析方法学的开发不能无限追求不可能达到的目标，也不能因为某一个物理参数的优越性而无限的强调。在科学的前期设计规划的基础上方可开发出整体指标均比较优异的方法学。

参考文献：

【1】任志奇，吴英松，刘天才，新型免疫层析技术的研究进展。广东医学.2013（01）

【2】李阳，王云龙，免疫层析技术的研究进展。中国卫生检验杂志。2015（11）

【3】杨小姣，胶体金免疫层析快速检测氯霉素技术研究。西北农林科技大学。2007（06）

【4】史存芳，基于金磁微粒的心肌钙蛋白I免疫层析检测方法的建立，西北大学。2013（06）

【5】周蕾; 杨瑞馥; 郭兆彪; 黄惠杰; 黄立华，上转发光免疫分析系统的研究及其在POCT中的应用。中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编。2011（05）

【6】李淑群，基于胶体金和量子点免疫层析技术的研究及应用，苏州大学。2013(05)

北京华科泰生物技术有限公司 供稿