全自动化学发光免疫平台检测维生素K缺乏 或拮抗剂II诱导蛋白的分析性能评估

虽然肝癌是男性第五位最常见的癌症，是女性第七位最常见的癌症，但其致死率高（死亡率为93%）[1,2]，肝癌是第三大癌症死亡原因。肝癌负担大约85%是在发展中国家，单单中国就超过了50%。肝癌高发区是西非和中非以及东亚和东南亚。除日本和南欧以外的发达国家，肝癌的发病率普遍都较低[1,2]。全球发生的原发性肝癌中，肝细胞癌（HCC）是主要的组织学类型，占肝癌总负担的70%-85%[3]。

乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）慢性感染是肝细胞癌的一个主要危险因素。估计全球约80%的肝细胞癌与HBV或HCV有关[4]。HBV携带者发生肝癌的风险是非携带者的223倍[5]。HCV感染是一些发达国家（包括日本）最常见的肝癌易患因素[6]。

最近，一些曾经的高危地区肝癌发病率下降，这可能与卫生保健条件改善使得HBV感染减少有关。相反，有些发达地区（包括美国和中欧）的肝癌发病率却升高，这可能与肥胖流行以及注射吸毒者不断传播所造成的HCV感染增多有关[7]。从1980年到2010年的30年间，美国年龄标化的肝癌总发病率升高了2倍，从2.63/100,000升高到8.07/100,000[8]。

肝细胞癌高死亡率的原因之一是其早期难以发现，由于早期没有症状，所以很多患者在早期没有进行治疗。通过对高危人群的监测，早期发现肝细胞癌患者是提高生存率的有效方法[9-14]。

维生素K缺乏或拮抗剂II诱导蛋白（PIVKA-II），也叫脱-γ-羧基凝血酶原（DCP），是凝血酶原这的一种异常形式。PIVKA-II是功能上有缺陷的凝血酶原，是因其N-末端10个谷氨酸残基的羧基化下降所致[15]。

肝细胞癌患者的PIVKA-II水平升高。PIVKA-II水平与其他两种肝细胞癌的标志物：甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白异质体（AFP-L3）的水平无关，因此PIVKA-II可与AFP或AFP-L3一起应用，互为补充，用作肝细胞癌的生物学标志物。所以，将两种标志物结合应用不但可提高诊断肝细胞癌的灵敏度，而且可最大程度提高诊断特异性[15-18]。日本肝病学会建议检测两种或两种以上肿瘤标志物来诊断小的肝细胞癌[19]。

研究表明血清PIVKA-II水平与肿瘤大小、血管浸润、肝内转移以及治疗后的复发率有关，因此PIVKA-II也可用作肝细胞癌患者预后的预测指标[20-24]。根据肿瘤特征确定最有效的治疗方法时，PIVKA-II可起到至关重要的作用。

PIVKA-II可用于辅助诊断肝细胞癌以及监测高危患者（HCV感染、肝炎/肝硬化、HBV感染）肝癌风险，已在日本应用20多年[19]。

本研究评估ARCHITECT i系统（Abbott Japan，Tokyo，Japan）全自动PIVKA-II免疫测定方法分析性能。

ARCHITECT PIVKA-II是2步法微粒子化学发光定量测定血清或血浆中PIVKA-II水平。用重组鼠单克隆抗PIVKA-II抗体3C10（Abbott Laboratories，IL，USA）[可识别PIVKA-II N-端γ-羧基谷氨酸（GLA）结构域（氨基酸13-27）中的表位]包被的顺微粒捕获待测物PIVKA-II。用吖啶标记的鼠抗凝血酶原单克隆抗体MCA 1-8（Abbott Laboratories）结合物（可识别凝血酶原N-端的表位）检测待测物-微粒复合物（图1）。

图1. Architect PIVKA-II测定方法的测定原理。捕获抗体识别γ-羧基谷氨酸（GLA）结构域（氨基酸(aa)13-27）中的表位，示踪抗体识别凝血酶原部分的表位。

第一步，将30μl样品、50μl检测缓冲液和50μl抗PIVKA-II抗体包被的微粒混合孵育18分钟。洗涤后，加入50μl吖啶标记的抗凝血酶原抗体结合物，孵育4分钟。再次洗涤后，向反应混合物中加入预激发液和激发液。用相对光单位（RLU）测量上述过程中所进行的化学发光反应。用光学系统检测的相对光单位与样品中PIVKA-II Ag的量有关。这种测定是全自动进行，自最初吸取样品开始30分钟内就能得出测定结果。这种方法的测定范围设计为10-30,000mAU/mL。校准品用含有牛血清白蛋白的缓冲液稀释PIVKA-II抗原制备而成。校准品的水平是0、40、100、300、5000和30,000mAU/mL。

PIVKA-II抗原用人凝血酶原（Enzyme Research，IN，USA）按照Bajaj等人[25]所述的热脱羧方法制备。通过与Picolumi PIVKA-II测定方法（Eidia，Tokyo，Japan）比较得出PIVKA-II抗原值。

AFP阳性标本来自ProMedDx，LLC（MA，USA）。外观健康人的正常标本来自ProMeDx，LLC，C-C Biotech（CA，USA）和Denka Seiken Co., Ltd.（Tokyo，Japan）。本研究所用的所有的人标本都是按机构审查委员会所批准的方案采集的。

测定方法的不精密度按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）指南EP5-A3[26]进行评价。测定3个水平用缓冲液制备的PIVKA-II质控品、4个水平用血清制备的样品以及3个水平用血浆制备的样品，这些样品都用3个批次的试剂和包括3个不同版本的4台仪器（2台i1000SR、1台i2000SR和1台i2000）进行测定，每个标本重复3次，每天分开测2次，测定20天。用1:10自动稀释方案检测点加PIVKA-II抗原、抗原水平为~75,000mAU/mL的高浓度血浆样品。

空白限（LoB）、检测限（LoD）和定量限（LoQ）按照CLSI指南EP17-A2[27]确定。用3个批次的试剂和5台仪器（2台i1000SR和3台i2000）测定4份0浓度样品和8份低浓度PIVKA-II样品（0.625、1.25、2.5、5、7.5、9、10、15mAU/mL），每个样品重复2次，测定5天。空白限定为0浓度样品值的第95百分位数。计算检测限时，用Shapiro-Wilk检验证实最低浓度PIVKA-II样品呈正态分布，其95%的重复测定结果都超过了空白限。证实呈正态分布后，用下述公式计算检测限：LoD=LoB+(Cβ*SDS)，式中Cβ=1.645/[1-1/(4*f)]，f=SDS的自由度，SDS=低浓度样品的标准差（SD）。定量限定为总误差为30%（10%偏倚+2×10%CV）的最低浓度。用各台仪器所有试剂批次的合并数据计算空白限、检测限和定量限。

用9台仪器和3个批次的试剂进行试剂机载稳定性研究。30天内，用保存在仪器上的试剂在20个测试点按每个样品重复5次测定3个水平用缓冲液制备的PIVKA-II质控品、4个水平用血清制备的样品以及3个水平用血浆制备的样品。检测开始时建立校准曲线，用保存的校准曲线确定每份样品的浓度。评价随时间延长样品浓度的变化趋势。按照CLSI指南EP06-A[28]，用点加了PIVKA-II抗原的2份血清标本和1份血浆标本评价稀释线性。按照测定范围，用ARCHITECT PIVKA-II校准品稀释剂将标本由100%稀释到0.01%。进行回归分析，将稀释标本的实测浓度与根据相应未稀释标本浓度得出的预期值进行比较。

检测超过测定方法测定范围的高水平PIVKA-II样品，评价高剂量钩状效应。高水平PIVKA-II样品用点加PIVKA-II抗原的混合血清制备，抗原水平分别为60,000、100,000、200,000、300,000、400,000和600,000mAU/mL。所有样品都用4台仪器（3台i2000和1台i1000SR）按每个样品重复5次测定。每份样品的平均RLU都与校准品-F（最高水平校准品）的平均RLU比较。

用7种采血管，包括普通血清管（Terumo，Tokyo，Japan）、SST管（Becton，Dickinson and Company (BD)，NJ，USA）、EDTA K2管（Terumo）、EDTA Na2管（Terumo）、肝素锂抗凝管（Terumo）、肝素锂PST管（BD）以及肝素钠抗凝管（Terumo），从16名正常人采集标本，用这些标本评价标本类型的等效性。向每份标本中加入20mAU/mL或200mAU/mL的PIVKA-II抗原，每个样品重复3次测定。将每份标本PIVKA-II值的平均值与相应普通血清管标本的平均值比较。

按照CLSI指南EP7-A2[29]评价了潜在干扰物质（包括内源性物质、营养补充剂以及治疗药物）对测定的干扰。每种物质都用合适的稀释剂稀释，然后加到用点加高滴度标本所制备的5份低水平血清样品和5份高水平血清样品中。将制备所加物质所用的稀释剂按相同的方式点加到低水平样品和高水平样品中，作为对照。所有样品都按重复12次测定。将每份试验样品PIVKA-II值的平均值与相应对照样品的平均值比较。

每个样品和每种仪器测定的总不精密度见表1。在所研究的20.28- 78,800.74mAU/mL浓度范围内，变异系数（%CV）为2.8-5.4。

空白限、检测限以及定量限的范围分别是0.00-0.63mAU/mL、0.73-1.61mAU/mL以及2.38-8.25mAU/mL（表2）。

试剂机载稳定性结果说明样品浓度没有显著变化。从第1天到第30天浓度变化率的95%可信区间是2.0%-3.2%。

用3个样品得出的这种测定方法在3.85-39,991.70mAU/mL范围内的线性结果见图2-A。每个样品预期值与实测值之间的Spearman相关系数均为1.00。稀释样品的回收率为89%-105%。

高达600,000mAU/mL的情况下未见高剂量钩状效应（图2-B）。浓度越高的样品其RLU越高，没有样品的RLU低于校准品-F的RLU（30,000mAU/mL，测定范围的上限）。

普通管血清标本与各种不同标本类型之间测定值的差异见表3-a。每种标本类型的平均差异为-0.4%到3.7%。

潜在干扰物质的影响见表3-b。试验样品与对照样品之间的平均差异为-6.4%到7.2%。

表2  用5台仪器得出的LoB、LoD和LoQ

图2. 线性和高剂量钩状效应评价。A)用稀释比和未稀释样品浓度算出的PIVKA-II预期浓度与3个样品的实测浓度的关系（A-1和A-2：血清样品，A-3：血浆样品）。B)4台仪器测出的PIVKA-II浓度与相对光单位（RLU）之间的关系。在不超过600,000mAU/mL的情况下，浓度越高，则RLU越高。

本研究评价了ARCHITECT PIVKAII测定方法的分析性能。结果表明这种测定方法有良好的精密度和很高的灵敏度。这种方法的最低定量限范围较大（2.38-8.25mAU/mL），但相对于报告的临界值40mAU/mL[30]，其最高定量限低于10mAU/mL。结果证实在测定范围内线性良好，浓度不超过600,000mAU/mL的情况下未见钩状效应，常用治疗药物、营养补充剂以及内源性物质未造成干扰。我们的结果说明ARCHITECT PIVKA-II测定方法可以用各种不同类型的血清和血浆样品进行测定。

在日本PIVKA-II已普遍用作肝细胞癌的特异性肿瘤标志物。日本肝病学会建议对有丙型肝炎慢性肝病、乙型肝炎慢性肝病以及肝硬化的高危患者进行定期筛查，每隔2-6个月测定一次肿瘤标志物，同时进行超声检查[19]。由于PIVKA-II、AFP和AFP-L3是相互补充的生物标志物，所以测定2种或2种以上肿瘤标志物有助于肝细胞癌的精确诊断[15-18]。日本国民医疗保险包含了AFP、PIVKA-II和AFP-L3的测定。

虽然快速测定PIVKA-II水平对确定合理的治疗方案非常重要，但迄今为止，即使日本也不能做到这一点。因为日本最常用的PIVKA-II测定试剂盒所需的配套仪器并未普遍用于诊所和医院。因此，多数标本需要运送到商业化的临床实验室进行测定，从最初采集标本算起，需要数天时间才能报告测定结果。由于日本第二大常用试剂盒Lumipulse PIVKA-II不能用血浆标本进行测定，所以采集血样后必须放置30分钟以上，才能使血液凝固，因此门诊患者当天的常规诊治过程中难以在治疗之前得到测定结果。

虽然人凝血酶原可被凝血级联过程中激活的丝氨酸蛋白酶消化成多个小片段[31]，但是这种测定方法既可以测定血清中的PIVKA-II，也可以测定血浆中的PIVKA-II，而且不受待测物降解的影响，也不会受这些小片段的干扰，因为ARCHITECT PIVKA-II测定方法所用的两种抗体都能识别PIVKA-II N-端的表位。

当前市场上所售的PIVKA-II测定试剂盒有一些缺点。Picolumi试剂盒的制备样品需要手工稀释步骤，而Lumipulse和μTAS Wako DCP不能用血浆样品。我们的ARCHITECT PIVKA-II测定方法操作方便，是完全自动化的测定方法，其分析性能良好，处理量大（测定200次/小时），并且标本也无需预处理。这种ARCHITECT PIVKA-II测定方法可用各种不同的血浆样品和血清样品。由于血浆样品不需要凝固的等待时间，所以采样后得出测定结果的时间早于血清样品。这些特色使得门诊患者就诊时可以当天检测并在治疗之前当天就得出测定结果。

这种检测方法是很方便的自动化方法，可供诊所、医院和临床实验室使用，测定血清以及血浆标本中的PIVKA-II。该方法可支持全面使用PIVKA-II进行肝细胞癌的管理，有助于及早检出高危人群中的肝细胞癌。

（本文节选自Development and evaluation of analytical performance of a fully automated chemiluminescent immunoassay for protein induced by vitamin K absence or antagonist II）

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Kenju Fujita a, Hideki Kinukawa a, Kenichi Ohno b, Yumiko Ito b, Haruhisa Saegusa b, Toru Yoshimura a

a Research and Development, Abbott Japan Co., Ltd., Chiba, Japan

b R&D Center for Diagnostic Reagents, Denka Seiken Co., Ltd., Niigata, Japan

  雅培贸易（上海）有限公司 供稿