新型生物标志物在炎症性肠病诊断中的新兴作用

核心提示：炎症性肠病（IBD）没有金标准试验。医师必须同时考虑临床、内窥镜和影像学以及血清学和组织学证据来正确诊断患者。内窥镜评价不仅昂贵，而且对患者造成不适，穿孔风险大。使用生物标志物帮助诊断和细分IBD是一个不断扩展的领域。本文在聚焦那些更新型的试验之前，谈及了目前临床使用的无创标志物，有可能对诊断和区分IBD非常有用。

欧洲炎症性肠病（IBD）诊断和管理循证共识指出诊断应该通过医师考虑很多因素包括临床和内窥镜评价以及组织学、血清学和影像学评估来完成。没有金标准诊断工具。

腹痛伴随或不伴随排便变化是一级护理的常见主要症状。大多数IBD患者饱受功能性肠病，包括功能性消化不良和肠道易激综合征。确实，功能性肠病占据胃肠科门诊患者的很大一部分（高达60%）。

医师面临的两难局面是如何区分功能性疾病患者与潜在的IBD患者。高达50%的功能性疾病患者被推荐进行不必要的内窥镜评价。

相反，真正的克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）案例常常出现延诊（也就是从症状出现到确诊的延时）。这种延诊在回肠CD案例中更为显著。

即使确诊了IBD，如何细分为CD或UC仍存在不确定度。进一步细分很重要，因为这两种情况的最佳治疗和管理方式是不同的。CD与UC的鉴别诊断困难，大约10%患者被标注为不确定性结肠炎（IC）。

因此，很明显，即使目前有很多可用的诊断工具，作为医师我们仍在努力做出准确诊断。

任何研究性试验在患者成本和舒适度上必须是可以接受的。内窥镜评价通常不仅对患者造成不适、昂贵，而且，风险比较大比如穿孔。近期法国一项研究发现每10000名患者的穿孔率在4.5-9.7之间。影像学检查，也许在小肠病理学研究中用处最大，但是在观察员间和观察员内变异方面具有缺点，而且很明显不允许组织学取样。

使用生物标志物帮助诊断IBD是一个不断扩展的研究领域。生物标志物是“一种特征，这种特征作为正常生物过程、致病过程或对干预措施的药理反应的指标，可以客观测量和评估”。例如：胆固醇水平。然而，还没有一个生物标志物的灵敏度或特异性足以单独用于确诊IBD。很多生物标志物只表明全身炎症，因此在用途上具有局限性。本文在聚焦新型生物标志物开发的最新进展之前，谈及了对IBD诊断和监测用途比较明确的那些生物标志物。

本文将关注在IBD诊断和监测方面新型生物标志物开发的最新进展。文献中报道了大量生物标志物。我们选择考虑无创获取的生物标志物，因为它们对患者来说更易接受，从而在临床应用上也最有前景。

对IBD诊断中新型生物标志物的英文文献的综述基于文献服务检测系统（PubMed）数据库包含的文章。利用逻辑算子AND对PubMed数据库进行个别搜索，包括术语：“生物标志物”，“炎症性肠病”，“克罗恩病”和“溃疡性结肠炎”。

通过摘要来筛查文章是否符合研究条件，所有相关文章都请求获取全文。然后核对被请求文章使用的参考文献，确定是否具有进一步研究的价值。

C-反应蛋白：在炎症作用下，肝细胞经过某些细胞因子刺激产生C-反应蛋白（CRP）。如果是活动期IBD，这些细胞因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-6和IL-1β。

在活动期IBD病例中CRP可能显著升高。但是，这种升高不是特异性的，而且在很多情况下均可产生，包括感染、自身免疫疾病、其他炎症疾病、恶性肿瘤以及细胞坏死。

CRP升高情况可能因人而异，取决于个体的免疫应答；但是，研究表明CRP升高在CD中比UC中更常见。究其原因尚不明确，但是可能与CD病例中更深入、更穿透性的炎症有关，而在UC病例中观察到的是表面粘膜炎症。研究还表明疾病部位可能影响CRP升高程度，与疾病严重程度无关。

在已知IBD患者中，已证明CRP升高与结肠镜检查活动性疾病和组织学重度炎症相关，因而有助于区分活动期IBD与静止期IBD。

红细胞沉降率：像CRP一样，红细胞沉降率（ESR）是衡量全身炎症的，不完全是IBD特有的。

该试验衡量红细胞在1小时内垂直下降的距离。ESR水平比CRP更晚达到峰值，下降速度更慢。鉴于此，ESR更适合监测疾病发作24小时后疾病活动度/治疗反应，而CRP可能在24小时内更有用。

虽然ESR的用处相当有限，但是其很常用于监测IBD。ESR受到很多因素影响包括年龄、性别、贫血、血质不调和怀孕。

Yoon等人发现CRP和ESR只与内窥镜活动适度相关，而且检测内窥镜活动缓解的灵敏度低表明单独使用CRP或ESR不足以准确反映内窥镜严重程度。

另外，最新meta分析显示ESR水平不能预测IBD。IBD的最高预测概率是在ESR水平为200mm/h时，1.6%。

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCAs）：针对中性粒细胞细胞质颗粒的抗体。这些抗体可以用间接免疫荧光法（IIF）检测并表现出三种主要的染色模式：均质型（cANCA），斑点型（sANCA），和周边型（pANCA）。已证明周边型ANCA（pANCA）在UC中显著升高。

Joossens等人发现在其前瞻性随访研究中，64%的UC患者为pANCA阳性[抗酿酒酵母抗体（ASCA）阴性]。进一步研究计算出pANCA在UC中的概率为55%，在健康对照者中的概率为32%。

在UC中，非典型pANCAs的出现与左侧疾病治疗抗性和早期手术有关。这表明pANCA的存在对鉴别需要免疫调节剂早期干预的UC患者有用。

ASCA：酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞壁中甘露聚糖的抗体。

相比较而言，pANCA在UC中滴度较高，而高ASCA水平对CD的特异性更高。包含60项研究的meta分析研究了7860名IBD患者和3748名对照，证明了ASCA+/pANCA-组合试验对成年CD患者与UC患者的鉴别力，灵敏度55%、特异性93%。ASCA/pANCA水平还与回肠疾病对应表型，疾病发作时年纪轻，狭窄，以及穿透行为和多次肠道手术有关。

ASCA/pANCA检测虽然特异性水平高，但是灵敏度低，限制其在区分CD和UC方面的常规临床使用。

粪钙卫蛋白：钙卫蛋白是锌、钙结合蛋白，属于S100家族，主要来源于中性粒细胞和单核细胞，也能在活化巨噬细胞内检测到。

钙卫蛋白存在于血清、唾液、脑脊液、尿液和粪便中。它是一种极其稳定的蛋白，在粪便样品中不作处理7天以上仍然不会改变。

炎性过程发生时，钙卫蛋白由于中性粒细胞脱粒作用释放出来，因此对胃肠道炎症的特异性非常高。

文献中很多研究均关注粪钙卫蛋白（FCP）用于诊断和监测IBD的准确度。粪钙卫蛋白首先于1980年被描述，至今已成为广泛使用的试验。一项meta分析计算出FCP的灵敏度和特异性分别为95%和91%。另外，结果还表明FCP优于其他血清学标志物包括CRP和ESR。

国家卫生保健优化研究所（NICE）建议使用FCP作为诊断工具帮助鉴别诊断IBD和肠道易激综合征（IBS）。在一级和二级护理中使用时，FCP可有助于减少不必要进行内窥镜评价的转诊数量。包含13项研究的meta分析认为FCP检测将使需要内窥镜检查的成人数量下降67%，但是由于假阴性结果使8%的成人诊断延迟。关于FCP检测的备受争议之处在于适当临界值的确定，结果高于临界值被视为阳性。大多数中心将相对低水平50μg/g作为临界值。

Pavlidis等人在一级护理中接受了粪钙卫蛋白检测的成年患者群体中研究了这个问题。在临界值为50μg/g时，FCP检测的阴性预测值（NPV）为98%，阳性预测值（PPV）为28%。将临界值增加到150μg/g得出可比较的NPV 97%，和更高的PPV 71%。

结合这些数值，计算出通过将临界值增加到150μg/g，结肠镜检查和可屈性乙状结肠镜检查申请下降10%，代价是漏诊4例IBD（n=686）。

粪乳铁蛋白：乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，覆盖大多数黏膜表面。它存在于中性粒细胞内，在急性炎症情况下被激活。与粪钙卫蛋白相似，乳铁蛋白在粪便中可最多保持稳定5天。随着中性粒细胞渗入胃肠道，粪乳铁蛋白水平显著增加。结果发现粪乳铁蛋白水平在活动期IBD中比在非活动期IBD、IBS和传染性肠病中显著升高。一项研究报告粪乳铁蛋白对UC的灵敏度和特异性分别是92%和88%，对CD的灵敏度和特异性分别是92%和80%。

Sidhu等人研究了在接受胶囊内窥镜检查的患者中小肠克罗恩病粪乳铁蛋白水平之间的关系。他们发现粪乳铁蛋白在经过胶囊内窥镜检查诊断为小肠CD方面的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83%。

像粪钙卫蛋白一样，粪乳铁蛋白在测量IBD活动度上是一种灵敏度高和特异性强的标志物。它有助于区分炎症性肠病和非IBD，并且能够排除水平升高的IBS。

以前研究过的粪生物标志物：应用于IBD诊断、严重程度评估和疗效监测的其他粪便标志物包括新喋呤和多形核中性粒细胞（PMN）-弹性蛋白酶。Nancey等人发现粪新喋呤与CRP相比，与内窥镜活动的相关性更好。作者们还发现新喋呤在预测和监测IBD粘膜损坏严重程度上准确度堪比粪钙卫蛋白。

已证明PMN-弹性蛋白酶能够区分活动期IBD与非活动期IBD以及IBS，诊断准确度74.1%，高于CRP（64%）。

S100A12是钙结合蛋白家族的一员（类似于FCP），是促炎介质的刺激物，在室温下最多可稳定7天。

已证明S100A12的灵敏度和特异性水平分别高达86%和96%，优于FCP。结果还表明与其他生物标志物相比，S100A12与肠道炎症的相关性更好，并且有可能用于疗效监测。

然而，虽然S100A12很有价值，但是未应用于常规实践，需要更多研究来证实其在IBD评估方面的用途。

抗外膜蛋白C：抗外膜蛋白C（anti-OmpC）是直接针对大肠杆菌外膜孔蛋白C转运蛋白的抗体。据报道anti-OmpC见于55%的CD患者，而在UC患者和健康对照中数量不高。

研究表明anti-OmpC在辅助诊断ASCA阴性CD患者上具有一定价值。在ASCA阴性的患者中，anti-OmpC的流行率被报告为5%-15%。

鞭毛蛋白抗体：在鉴别结肠炎小鼠的共生细菌蛋白时发现显性抗原是鞭毛蛋白。强烈的免疫应答见于一种特殊的鞭毛蛋白，anti-CBir1。50%的CD患者与CBir1具有IgG反应性，而在UC患者和健康对照中这个比例分别只有6%和8%。

在非典型的pANCA阳性CD患者中，40%-44%显示为anti-CBir1阳性，与之相比非典型的pANCA阳性UC患者只有4%为anti-CBir1阳性。

因而，anti-CBir1检测可有助于鉴别非典型的pANCA阳性CD和UC患者，与ASCA无关。

另外，研究发现anti-CBir1抗体在独立于其他血清学标志物之外与CD患者的回肠受累有关，而且表明CD患者易受狭窄性和穿透性疾病影响。

近期，Schoepfer等人证明59%和57%的CD患者与两种新的鞭毛蛋白抗体，anti-A4-Fla2和anti-Fla-X发生反应，与之相比只有6%的UC患者显示与两种抗体反应，这表明anti-A4-Fla2和anti-Fla-X可用于鉴别CD与UC。

Anti-I2抗体：从活动期CD的固有层单核细胞中识别出一个细菌DNA的片段（I2），研究表明该片段与荧光假单胞菌有关。

据报道Anti-I2阳性率在CD中为30%-50%，在UC中为2%-10%，在不确定性结肠炎中为36%-42%，在健康对照中为4%-8%。Anti-I2也发现于其他炎症性肠炎患者中（19%）。

抗糖抗体：研究发现CD患者表达不同致病细菌和真菌细胞壁糖表位的抗体。这些抗多糖抗体包括抗laminaribioside糖抗体（ALCA）（18%-38%），抗chitobioside糖抗体（ACCA）（21%-36%），和抗mannobioside糖抗体（AMCA）（28%）。CD患者发现ALCA, ACCA和AMCA的比例分别为18%-38%，21%-36%和28%。

Ferrante等人发现ALCA、ACCA和gASCA（类似于ASCA）中至少一项为阳性的CD患者可与UC患者区分开来，灵敏度77%，特异性>90%。然而，在区分CD患者与健康对照时，特异性下降到70.3%。

整体来说，很多研究发现这些抗多糖抗体的灵敏度较低，这也是限制其用途的一个原因。

胰腺抗体：研究发现外分泌胰腺的抗原特异性胰腺抗体（PABs）存在于20%-30%的CD患者中，但是只存在于2%-9%的UC患者中，在极少数非IBD相关疾病患者中也可以发现。

主要酶原糖蛋白2（MZGP2）近期被认定为PAB的初级自身抗原，促进了相关技术发展以便在临床实践中将其鉴别出来。

2014年，Pavlidis等人的研究通过新型ELISA技术，在迄今为止以这种方式被测的最大IBD群体中评估了PABs的临床相关性。他们证实了抗MZGP2抗体对CD的高特异性和与疾病严重程度表型的关联。IgA抗MZGP2抗体在早期疾病发作的CD患者中更为普遍（P=0.011）。另外，抗MZGP2阳性患者更常患有伴随回肠受累的广泛性病变。病程越长的患者越有可能具有IgG抗MZGP2抗体。

α-1抗胰蛋白酶和粒细胞集落刺激因子：Soendergaard等人研究了疾病活动度不同的65名UC患者和40名健康对照的血清样品。他们测量了α-1抗胰蛋白酶（AAT）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的水平。

AAT水平能够区分轻度、中度和重度UC，性能比CRP好。

另外，作者们发现在被诊断为UC的患者中测量AAT和G-CSF组合有足够的统计功效以区分具有轻度、中度和重度疾病活动度的患者。

最近，很多全基因组关联研究（GWAS）在调查UC和CD特异性基因组图谱时发现许多易感位点。

Ellinghaus等人发现两个基因变种PRDM1和NDP52决定了CD的易感性。PRDM1接近GWAS识别的一个CD区间，编码一种由T细胞和B细胞表达的转录因子。NDP52编码一种在胞内细菌自体吞噬过程和信号分子中发挥作用的蛋白质，支持自体吞噬在CD发病机理中所起的作用。

IBD芯片欧洲项目研究了大量CD-单核苷酸多态性以确定其对这种疾病临床病程和表型的影响。研究发现NOD2基因是最重要的遗传因子，是回肠部位、狭窄性和穿透性CD的独立预测因子。NOD2还与更复杂的病程和是否需要手术有关。

更新的CD和UC GWAS meta分析报道了从75000多个病例和对照获得的重大发现。作者们识别了71个新关联，使已证实的IBD易感位点总数增加到163。他们发现大多数位点与CD和UC表型都有关。有趣的是，IBD和分枝杆菌感染的易感位点之间存在相当大的重叠，表明宿主对分枝杆菌与患者对IBD的反应路径相同。

从传统上来说，CD与Th1细胞因子谱有关，而UC与Th2细胞因子谱有关。但是，这种概念自从Th17细胞和Treg细胞被发现后受到了挑战。GWAS指出IL23R和参与Th17分化的另外五种基因（IL12B, JAK2, STAT3, CCR6和TNFSF15）都与CD易感性有关，在一定程度上也与UC有关。

至于遗传学在IBD诊断中的临床应用，有些焦点聚集在从内窥镜活检得到的结肠组织中识别出遗传标记。von Stein等人识别了在IBD中差异表达的七种基因，使用临床诊断作为金标准有可能区分UC、CD和IBS患者（P < 0.0001）。

最近，为了继续这项研究，对病程更为复杂的78名患者（38很可能为UC、18名CD、22名IBDU）的活检材料进行相同的基因组合检测。测试结果导致很多初次诊断为UC和CD的患者的初步诊断发生变化，并且表明大多数IBDU患者和急性结肠炎患者的诊断在临床上是可能的。

表观遗传学描述的是影响基因表达但是不改变DNA序列的基因-环境交互作用。

微小RNAs（miRs）是单链的非编码RNAs，长度大约为22个核苷酸，在整个演变过程中高度保守。由于它们在1990s年代已被描述，至今已发现超过1600个人类miRs。miRs被RNA聚合酶转录成pre-miR，然后分别在细胞核和细胞质内加工。miRs调节基因表达和很多生物过程比如细胞增殖、分化和死亡。miR表达变化与许多疾病包括IBD有关。

很多研究着眼于IBD患者vs对照以及CD患者 vs UC患者外周血样品中的miRs图谱。结果发现若干miRs上调或下调了。一项儿科研究还发现与健康对照相比，儿童血清样品之间的某些miRs水平差异表达。

近期Schaefer等人的一篇文章发现CD与全血中6个miRs的表达变化有关，而UC与全血中9个miRs的表达有关。他们还发现UC和CD患者唾液中不同miRNAs的表达变化。

他们认为特异性miRNA表达模式与UC vs CD有关，因此检查唾液和血液样品中的miRNA表达有利于监测或诊断IBD患者。

代谢组学是指生物样品中很多小分子代谢物的研究，以便测定特定细胞过程的潜在指纹图谱。

目前用于代谢组学的主流技术包括1H NMR光谱法，气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）和液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）。这些技术具有极其灵敏、成本效益好、高通量的优势。

1H NMR光谱法是至今最广泛应用于IBD患者不同生物流体研究的方法。很多研究报告了IBD患者和健康对照以及CD和UC之间代谢图谱的差异。

以上描述的这些研究主要集中于氨基酸检测，TCA循环中间产物，脂肪酸代谢物和嘌呤代谢。

肠道细菌的代谢物在尿液中检测到。任何肠道菌群变化（已证明在IBD发病机理中发挥重要作用），都可能影响尿液代谢图谱。因而，将尿液代谢物作为IBD的潜在生物标志物是一个很有吸引力的选择。

Williams等人的研究利用1H NMR光谱法调查了CD和UC患者的尿液代谢图谱。他们发现IBD患者的马尿酸盐水平（来源于微生物区系的一种代谢物）显著下降。

其他研究利用1H NMR光谱法也证明IBD患者存在低水平马尿酸盐，另外，马尿酸盐可以区分IBD患者和健康对照。

大量研究表明利用1H NMR光谱法分析血清和血浆的代谢图谱能够区分UC和CD，但是可靠性低于鉴别UC/CD患者与健康对照的可靠性。

进一步研究发现氨基酸和TCA循环相关代谢物的图谱能可靠区分UC和CD，而且氨基酸的代谢图谱与疾病活动度有关，表明在监测IBD方面具有作用。

与健康对照相比，IBD患者粪提取物的代谢图谱表明短链脂肪酸的水平显著下降。

肠道菌群以及粪提取物代谢物的图谱也可能进一步指示IBD患者的肠道细菌失调，从而确定疾病的发病机理。

代谢组学和IBD领域的另一进展是将呼吸试验作为潜在的生物指标。

近期Kurada等人的综述发现文献中只有12篇小研究评估了呼吸代谢组对IBD诊断的价值。在诊断和鉴别IBD时，这些研究测量的挥发性有机化合物（VOCs）主要包括戊烷、乙烷、丙烷、丁烷和一氧化氮（NO）。

Kurada等人证明与健康对照相比，IBD患者（CD>UC）的戊烷水平升高，Pelli等人的发现也是如此。此外，Pelli等人还表明乙烷和丙烷水平都与IBD有关（两者P值均≤ 0.001）。研究表明UC患者呼出的NO比CD患者高。

至于疾病活动度，一项研究发现呼吸戊烷水平与WBC扫描摄取直接相关。结果发现乙烷水平也与疾病的内窥镜活动相关。

虽然研究发现一些很有价值的结果，但是呼吸分析还没有准备好用于临床。需要进一步研究来确定IBD的准确呼吸代谢组模式。

蛋白质组学在鉴别新的生物标志物方面是更新的发展领域。它基于健康和病态组织的蛋白质表达分析并执行蛋白质谱分析。

Meuwis等人研究了120名患者（30名CD，30名UC，30名炎性对照和30名健康对照）的血清。他们识别了急性期炎症的4种蛋白（PF4、MRP8、FIBA和Hpα2）。

最新研究调查了白介素-10敲除[IL-10（-/-）]小鼠的循环蛋白生物标志物，该模型建立了一种在结肠中占据主要地位、依赖时间的类IBD疾病。他们识别了与早期无炎症IL-10（-/-）小鼠相比，在中晚期IL-10（-/-）小鼠血清样品中不同程度累积的共15种不同的蛋白，表明蛋白质谱在评估疾病严重程度和疗效上具有作用。

IBD诊断和鉴别需要更准确和成本效益好的生物标志物。为了容易被患者接受和避免具有危险的侵入性评估比如内窥镜，无创生物标志物的发展很重要。

当前的血清检测包括CRP和ESR，便宜、可靠但是特异性不高，因此不够理想。基于粪便的检测比如粪钙卫蛋白是特异性更高的工具，很多有利证据支持其用于临床。

应该注意的是，至今为止，虽然近期取得了进步，但是在测试结果为阳性的情况下，不做验证性的结肠镜检查，没有可靠的生物标志物可以确诊IBD。而是，这些无创试验目前被用作内窥镜评价的辅助工具和避免不必要的程序，阴性结果表示不存在潜在炎症和病理状态。

无创取样的临床价值最高，并且随着代谢组学、遗传学和蛋白质组学的最新进展，现在更多工具可用于开发灵敏度高和特异性强的生物标志物来诊断和区分IBD。

本文谈及了在不断扩展的IBD生物标志物领域取得的重大进步。但是，需要更多工作来将这些新技术应用到日常临床实践中。

（摘自World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics，版权归其所有，仅供内部学习）

编译：王小茜