下一代测序在传染病诊断和管理中的应用 ——美国分子病理学会报告

作者:The Journal of Molecular Diagnostics
2021-12-16

下一代测序(NGS)技术正在越来越多地应用于传染病的诊断和监视。因此我们评估了NGS在临床微生物学中的应用。此次评估的重点是基因型药物的耐药性检测;临床标本中与疾病相关未知病原体的直接检测以及人宿主微生物种群多样性研究和菌株分型。我们将评估分为三个主要部分:1)临床病毒学应用;2)临床细菌学、分枝杆菌学以及真菌学应用;以及3)确认、质量控制和检测熟练程度的保持。尽管NGS在临床传染病检验中有着广阔的前景,但是挑战与机遇并存,这包括检验自动化、技术协议标准化、生物信息学途径应用、完善参考数据库、建立熟练程度测试和质量控制措施以及降低检验成本并减少周转时间,所有这一切都是NGS技术在临床微生物实验室推广的关键。


下一代测序(NGS)方法被认为具有测序更加深入、高通量或大规模平行测序的特点,由几种已经成功超越传统二脱氧核苷链终止方法(即Sanger)的技术组成。多种平台在测序化学方法,读长和通量能力上各不相同。随着这些平台的技术日益成熟,大多数实验室能够支付这些平台的使用费用。因此,这些平台对临床微生物实验室来讲尤其具有吸引力,特别是那些已经需要依靠分析方法进行病原体鉴别和表征检测的实验室。

表1. 目前NGS平台的特征

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微生物下一代测序研究通常使用两种测序策略即DNA扩增子靶向测序或全基因组测序(WGS)(图1)中的一种。第一种方法是利用特异性靶向引物进行PCR介导扩增,扩大目标基因组区域并进行选择性测序。该方法通常用于执行特征明确的基因组区域的测序(例如鉴别已知耐药性突变)。另一方面,全基因组的重组测序依靠非靶向文库制备,这种测序通常在微生物未知的情况下执行,目的是确定基因组的内容以及研究中的微生物的功能性潜能。WGS还可用于初级标本的独立培养病原体鉴别或微生物种群的表征描述。

文章将讨论上述方法在传染病检验应用的范例,并着重讨论细菌学和病毒学中出现的特殊情况带来的技术和信息学方面的挑战。NGS目前很少应用于临床微生物实验室中,但是随着标准化操作协议的完善、自动化水平的提高以及数据分析技术的进步,NGS将在传染病诊断和管理中发挥越来越重要的作用。


诊断病毒学的具体应用


病毒耐药性突变检测

在一些临床意义显著传染病的管理中,耐药性的出现是一个重要因素。基因型耐药性测试原仅用于大人群或批量测序,这样的测试包括Sanger测序特殊病毒基因的扩增。但是,Sanger方法在监视出现概率<15%-20%的病毒种群突变时灵敏度非常有限。但是NGS方法却能检测出现概率为大约1%的耐药性突变(DRM)。基于NGS基因型耐药性测试的原型病毒是HIV-1,并与基于Sanger的方法类似,新型的NGS试验已经开始使用已知的病毒基因组区域靶向测序来了解耐药性突变。作为研究程度最为深入的病毒,HIV-1将用作病毒耐药性NGS 测试相关概念详细讨论的范例。但是,基因组耐药性测试也已经用于其他病毒感染的临床管理,例如巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒以及流感病毒,可以设想NGS方法也将同样适用于这些病毒。

 

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图1 传染病诊断和监视测序方法图示。靶向扩增子测序使用特异靶向引物进行模板(绿条)富集,接着是与特异靶向引物部分互补(黑条)并包括测序适配子和条码的引物(蓝条)。全基因组测序使用酶促或机械片断化,然后是末端修复以便连接包含测序适配子和条码(蓝条)的引物。大小选择仅支持测序使用的预定读长的片断。要求对人体序列进行生物信息学移除,因为目标有机体的核酸通常仅占不到1%的核酸库。通过富集PCR扩增子制备片断化文库。


HIV-1

HIV-1阳性患者人群的流行病学研究显示高效逆转录病毒疗法存在耐药性突变能预测治疗效果。因此,目前建议在首次使用该疗法的患者进入临床护理阶段时进行DRM基因组测试,不仅如此,在已经使用该疗法但出现病毒学失效的情况时,也建议进行DRM基因组测试。一些研究比较了NGS和Sanger方法在发现次要耐药性变异方面的性能,研究显示NGS方法至少可以鉴别一半Sanger测序无法鉴别的DRM。已经证明这些存在的变异能预测疗法失败后增加的风险。


在评估次要变异时的一个主要考虑是将PCR扩增、文库制备或测序期间生成的真突变与假突变区分开来,这包括不匹配、插入/删除,以及PCR介导重组产物,如嵌合的序列。但是显然这对具有低病毒载量的临床标本来说有问题,因为用于文库制备的病毒副本量太小,而且即使使用高保真度聚合酶,混合的病毒群落可能也不能被准确地再表达。由于早期PCR周期内的随机事件或引物退火效力的差异,一些变异具有的差异化扩增能改变最终的PCR产物混合物。一个可能的解决方案是评估给定NGS试验以及不同病毒浓度的实验误差率,并设定上述试验误差率次要变异检测的安全阈值。例如,一个已知基因型的质粒可以从属于NGS和Sanger测序,假设全部的NGS调用由于文库制备和/或NGS误差不能被Sanger真值确认,则文库制备的步骤可以使用随机序列标记的引物,这样每个模板会有一个唯一的标识符。这样的话,每个原始模板模块就生成了一致的序列,从而纠正在文库制备和测序期间生成的随机误差。另一个解决PCR偏移的方法是对相同的临床标本执行多重独立扩增并混合其产物作为文库制备的模板。新型的生物信息学工具已经开始用于处理NGS数据,以降低误差率并调用真正的低丰度病毒变异。


许多HIV-1研究显示与Sanger测序相比NGS方法具有更出众的性能,临床已经引进了一些NGS HIV-1耐药性试验。其中最具综合性的是DEEPGEN HIV(由俄亥俄州克利夫兰大学病例医学中心开发)。该试验评估了蛋白酶、逆转录酶和整合酶基因的耐药性突变,并预测了HIV-1受体嗜性。该试验具有0.37%-0.39%的平均误差率,次要变异灵敏度为5%,并能在一次运行中对多达96个样品进行多路传播。其他两个试验使用HIV-1 env V3环深度测序进行HIV受体嗜性评估,这两个试验临床已经可以使用,分别是British Columbia Center for Excellence in HIV/AIDS (Vancouver, BC, Canada)提供的HIV-1 CCR5嗜性试验(V3)和Quest Diagnostics(Madison, NJ)提供的HIV-1 Co-receptor Tropism with Reflex to Ultradeep Sequencing。这些试验和DEEPGEN HIV已经将预测非CCR5嗜性作为表型准确度的黄金标准(Trofile; Monogram Biosciences, South San Francisco, CA)并在检测次要CXCR4-tropic变异方面比Sanger测序具有更高的灵敏度。

    

更重要的是,NGS检测低丰度HIV-1耐药性变体的临床意义还有待完全彻底的表述。一些研究回顾性地评估了在首次接受治疗的患者人群和已经接受治疗单出现病毒学失效的患者人群中NGS检测低丰度耐药性变异的影响。尽管NGS检测的具有低丰度DRM的患者在疗法失败后仅表现出有限的风险上升,但总体来说,与NGS和Sanger方法都能证明的高丰度突变相比,实质上的失效风险更高。


CMV

CMV是另一种在基因型耐药性方面具有临床意义的的病毒,而且对移植受体尤为重要。CMV的耐药性率随着患者人群的不同而改变,在实体器官移植受体人群中为5%-12.5%;在造血干细胞移植受体人群中则为2%-5%。由于DRM可以因持续的药物曝露而累积,并潜在导致存活期缩短以及发病率上升,所以及时地对CMV耐药性进行检测至关重要。不仅如此,合理地在耐药性鉴别后改变疗法已经证明能够更快速地清除病毒。目前,已明确了两个CMV基因中的CMV耐药性突变,它们是DNA聚合酶UL54和磷酸转移酶UL97,这两者在编码序列中的表达<6kb,这使得DMV非常适于基于NGS的扩增子测序,这项试验与靶向HIV蛋白酶和逆转录酶试验类似。实际上,最近介绍了一项NGS试验,证明在具有大病毒载量的临床血浆样品中,该试验具有低试验误差率(0.189%)以及可靠的CMV DRM检测率。


CMV阳性群体次要人群耐药性变异临床效果的影响尚未进行大型临床试验评估。但是,有新的证据证明NGS可以促进即将发生的耐药性的检测并有助于疗法的优化。NGS病毒耐药性研究也有望鉴别新型的DRM假设,在经过合理的表型确定后,可以合并到CMV DRM数据库和基因解析系统,这种情况同样适用于HIV-1。这些自动化工具已经显示有助于改进序列分析并在与人工测序的比较中推动工作流程的进步及标准化进程。


临床标本的病毒鉴别

概念验证研究已经证明WGS能够在先前常规分子测试结果为阳性的大量标本类型中鉴别普通的以及与临床相关的病毒。在其他NGS已经成功适用的诊断病毒学领域,WGS也能在抗病毒药剂疑似无效但无法检测的临床环境中通过传统的诊断方法鉴别病毒病原体。许多病毒不能通过传统的分子技术培养或鉴别,其他方法如克隆,Sanger测序费时费力,只能用于无菌样品如脑脊液。病毒家族内的微阵列靶向高保守区域适用于检测已知病毒名,但不能鉴别与该阵列寡核苷酸序列不相似的新型病原体。相比之下,NGS则可以实现高效、高灵敏度和无差别的临床标本病毒检测。这类研究的通用方法从根本上与靶向测序不同。首先,目标病毒通常未知,不能使用特异靶向引物进行选择性扩增。因此,必须使用专业的实验室和生物信息学策略富集来自人体核酸的病毒RNA或DNA。其次,如果病毒为新型病毒或与已知相关病毒大不相同,则可能没有参考序列进行测定序列的绘图。这需要对病毒基因组进行重组。


由于临床标本的核酸为显著的宿主来源,病毒的富集和/或宿主序列的损耗是NGS在临床标本中灵敏地发现病毒的重要步骤。实验室对病毒粒子纯化和富集的方法包括病毒培养、超速离心、密度梯度离心以及在保留衣壳保护病毒粒子的同时,核酸酶样品移除宿主核酸预处理。病毒基因组富集的核酸扩增方法包括循环基因组病毒的滚环扩增;使用比人体相比于病毒核酸接触更加频繁的限制酶点;接着是适配子的连接和PCR扩增;使用宿主核酸特异靶向寡核苷酸(例如rRNA)以及使用逆转录和扩增进行干扰。更新的方法是与杂交法结合使用抗转录寡核苷酸作为诱饵捕获病毒核酸,但是诱饵的设计至少需要对病原体预先进行一些了解。用于从包含混合的人体和微生物序列的初始读取库中减除宿主序列的计算工具正在开发中。由于病毒序列占初始定向读取库的比例不到1%(表2),因此这个过滤步骤至关重要。

表2. 原始人体临床标本中描述单独培养NGS病原体鉴别的选择研究

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此外,一种推定的而病毒病原体是否包含DNA或RNA基因组通常未知,需要进行总核酸提取。使用随机引物扩增对生成足够的模板进行文库制备可能是必要的。解决该RNA病毒问题的一个有趣方法是使用Phi29噬菌体聚合酶基多点位扩增进行随机引物逆转录和cDNA扩增。该测序平台(表1)的选择还要求仔细考虑,因为读长和序列深度可能影响基因组重组和病毒检测。


可能大多数成功发现病毒案例的关键方法是生物信息工具的选择。当参考基因组已知时,对于扩增子测序试验,读取定向软件典型地适用严格地错配序列规则将误差最小化。反之,在病原体未知的情况下,如果目标病毒与参考大不相同,则不太可能绘制测定的序列并将之纳入病毒数据库。生物信息学工具必须重组测定的序列并通过鉴别重叠的序列将之纳入连续的序列,随后将连续的序列纳入基因组中。才产生长序列的测序方法结合信息学将有助于连续序列的重组(表1)。组合的序列可使用严格程度略低的算法与公共数据库比较来鉴别相关的病毒。重复序列在重组中是一项重要的挑战,因为他们会干扰PCR扩增,加速基因组的绘制。目前正在开发解决这个问题的推算和试验策略。表2总结了一些具有代表性的研究,这些研究均使用NGS方法鉴别未知病因传染病患者的病毒病原体。

对检测病毒而言一项重要的警示就是患者存在病毒并不意味着患者因此患病。传统意义上证明一种微生物是疾病的致病源通常要满足Koch的假定条件:受影响宿主身上发展推定的致病病原体但非健康对照,其次将这种病原体进行培养,在健康的宿主接种后出现该病症症状。但是,越来越多的证据表明许多病毒不能被培养,因此在证明这种微生物致病的因果关系方面,传统的方法更加困难。这些指导原则评估了微生物相关性的要求,但是同时也使该微生物是否致病的判断原则更加苛刻。例如,有必要使用免疫染色和分子方法证明在受影响组织内存在病毒,建立病毒副本数量和疾病严重程度的相关性,或者显示疾病从急性爆发到恢复期血清标本的血清转化。


临床细菌学、分支杆菌学和真菌学的特殊应用


通过靶向测序或WGS进行鉴别

基因组方法很有可能有助于细菌、分枝杆菌和真菌感染的诊断和管理,包括病原体鉴别、病毒性因子表征描述、菌株分型、以及抗生素耐药性标志物。传统的临床微生物学依靠培养隔离病原体,接着进行生化检测。最新的矩阵辅助激光吸附离子飞行质谱法鉴别感染有机体的类属。这些试验经济实用,每项测试具有更快的周转时间,更适用于一线诊断。但是概念验证研究证明NGS在同时使用rRNA和WGS靶向扩增子对原始人体标本进行微生物鉴别时具有显著的潜力。


rRNA测序

Sanger rRNA基因测序常用于微生物实验室的细菌和真菌鉴别。不仅如此,NGS rRNA测序是微生物菌群研究的基础。对细菌而言,这些方法使用引物靶定保守的16S rRNA序列,通过能提供足够序列多样性的变量插入区指定生物学分类,通常是种群水平。由于16S rRNA基因特定区域可能比其他区域支持更广的细菌光谱扩增,所以引物的选择很重要。此外,在一些案例中,一些特定种群水平鉴别序列变异的数量可能不足,所以可能只有特定种群或种群水平可以进行分类。


信息学对NGS取得的16S rRNA测序数据的解析很关键。长度、数量、测序测定序列的质量以及实际的微生物污染都是影响病原体鉴别的因素都有可能使微生物菌群多样性分类产生偏移。例如,常用的DNA提取试剂盒通常会被环境中的细菌污染,导致对低初始细菌载量的样品如脑脊液、血液或组织活检标本产生过高估计。数据分析工具包括误差纠正方法和扩增衍生嵌合序列的删除。通过专业途径如QIIME、核糖体数据库项目和Mothur对处理过的数据或原序列进行分析,基于至少97%序列一致性将类似序列聚集到运算分类单位进行系统发生分析。此外,根据测序平台和测序数据质量建立质量过滤参数用于这些途径进行标准化。细菌鉴别的准确度很大程度上取决于用于分析的参考数据库的完整程度和适用范围。已经有一些广泛的数据库用于16S rRNA,包括SILVA,该数据库包含超过300万的小亚基和超过250000大亚基细菌rRNA基因序列,可以基于超过400000 16SrRNA序列计算分类关系。


NGS靶定的16S rRNA测序可立即用于表述混合感染,尤其适用于那些包含不能培养或不能存活的有机体的案例。该方法已经成功地直接应用于大脑脓肿、淋巴结活体组织、囊性纤维化和乳突脓肿提取物的分析。


16S rRNA标靶NGS测序还可用于研究细菌群落、或微生物菌群基因组多样性。例如16S rRNA超变量区域已经用于研究细菌性阴道疾病,揭示了细菌的异质性。另一方面,囊性纤维化患者的下呼吸道微生物菌群的研究以及艰难梭菌患者的粪便或炎症性肠道疾病的研究已经显示疾病的恶化与细菌多样性下降有关,这可能由抗生素的使用引起。特别的是,最近小儿克罗恩病的微生物菌群研究显示肠道微生物生态失调的不同模式,包括肠杆菌、巴斯德菌、韦荣氏球菌和梭杆菌丰度上升,以及Erysipelotrichale、拟杆菌和梭菌的丰度下降。这种模式的与疾病的严重程度有关病因抗生素的滥用而更加严重。这个结果表明特定的疾病与正常微生物菌落构成的多样性失调有直接关系,并不仅仅因为单一的病原体所致。实际上,复发性艰难梭菌感染患者的研究已经显示健康参与者的粪便为生物管理与肠道细菌多样性恢复和关键菌群的再生密切相关,这些细菌包括拟杆菌和厚壁菌,减轻了大多数受体的症状。尽管基因组方法可以通过改变微生物菌群对疾病的作用来阐明这种机制,但是在患者管理中进行微生物菌群描述从而进行诊断的方法还有待建立和完善。


WGS

与基于rRNA的NGS方法不同,WGS方法支持功能和分类更加详细的分析,当对一种培养的病原体进行测试或对整个微生物群落进行表述时,这个领域称作宏基因组学。WGS方法还可以有助于患有疑似感染的患者,在培养或其他标准诊断方法都失效时发现细菌病原体。这时,可以使用无差别的方法对直接取自患者的标本进行测序,这和上文描述的发现病毒的方法类似。该方法的潜在诊断效用说明在严重联合免疫缺陷与复发性脑膜炎的儿科案例中,WGS可以与快速、专业的生物信息学途径相结合在取得脑脊液标本48小时内检测圣地罗西钩端螺旋体序列。表2显示了代表性的WGS研究,在表2 的研究中WGS用于单独培养的细菌病原体鉴别,为出现感染症状但病因未知的患者进行诊断。


WGS的数据分析比16Sr RNA测序更具挑战性。当对临床标本进行直接测序时,需要对数据中的人体序列和测序误差进行过滤。此外,推定的细菌测定序列则必须指定参考基因组或对连续的序列进行基因组重组,进行基因预测和生物功能分类。该领域使用最广泛的工具之一是宏基因组学RAST服务器。另一个进行临床病原体鉴别的工具是SURPI途径,它可以在大约100分钟内分析大于10x106测定序列,该工具可以在基于云平台和单独服务器上同时运行。但是,无论是生物学分类还是功能注释,其可用性都可能被参考基因组限制。在这方面大范围的努力正在进行探索人宿主细菌宏基因组学,如人微生物群系项目和人肠道宏基因组学项目,这两个项目大大扩展了细菌基因组数据库。结合上述和其他类似的努力,人体微生物群系已经从1070个个体的1267个宏基因组发展为具有完整的基因分类,包括9879896个基因,覆盖三个大洲的庞大体系。


一些组织已经评估了WGS在临床微生物学实验室进行细菌鉴别和特征描述的可行性。一项研究通过130中培养体测序对常规使用WGS的可行性进行了评估,这些培养的微生物包括厌氧菌、分枝杆菌和真菌。从菌落收获带获得分析数据大概需要55小时,其中大部分的时间(39小时)用作测序。将WGS结果、矩阵辅助激光吸附离子飞行质谱的到鉴别结果与传统的培养和生化方法进行比较证明其具有良好的相关性:135个样品中的115个(88.5%)显示了已知的结果,但是由于覆盖范围不足以及公共可用数据库中缺乏使用的参考基因组,130个样品中的15个不能被鉴别。因此WGS能够鉴别大部分传统方法可以鉴别的有机体,但是周转时间实质上被减缓了而且也没有进行耗费分析。


基因型病原体的特性

除了有机体的鉴别,NGS方法可用于鉴别基因型耐药性、毒性和标志物,还可用于菌株分型。尽管表型抗菌剂耐药性测试已经标准化了,但是其还可用于有机体限制数量如耗时数周缓慢生长的有机体分枝杆菌肺结核。改进灵敏度和周转时间的分子试验已经适用于一些耐药性标志物;但是一些分子机制试验的抗菌剂级别的耐药性分析仍然不尽人意。因此有必要进行多种试验的联合。基于WGS的基因分型可以简化工作流程且能通过同时审查全部可能的基因型耐药性机制,无需基于PCR的单独试验,尤其是在测序用于其他目的的时候如鉴别、菌株分型或毒素基因检测。由于新药的耐药性机制已经在公共数据库进行过分类和表述,如ResFinder和ARG-ANNOT,所以该方法很可能进行推广。使用BLAST审查用户提供的序列,列出抗菌素耐药性基因的清单。一些概念验证研究已经评估了NGS预测细菌耐药性模式的能力,Koser等人已经对此进行了审查。尽管基因型耐药性预测具有可行性,但是敏感性测定正在细致入微地进行并在接受挑战。尤其是基因型试验的缺点是不能提供抗菌剂敏感性的定量检测。尤其是如果存在耐药性基因或突变确认变异或可诱导的耐药性,则需要进行表型试验。同样,在单独使用时,如果在基因层面不能进行完整表述或缺乏给定数据库,则可能出现耐药性模式预测失败。处于这些原因,即使在耗费和周转时间都出现持续下降的情况下,WGS很可能不能取代现有的性价比较高的用于快速增长的有机体的耐药性试验(表型或分子试验)。基于WGS的耐药性测试最大的价值在于其适用于缓慢生长的有机体如使用多药方案的M.肺结核,表型试验对于数量有限的药物来说可行但也很复杂,基因的数量以及需要靶定基因间区域,对综合分子试验来说靶定方法价过高。


NGS-下一代测序

实施临床目的细菌WGS的其他区域用于医院爆发研究的菌株分型。传统意义上,通过片段分析方法(例如脉冲场凝胶电泳)或基于序列的技术(例如多位点序列分型)执行菌株分型。但是分型方案仅适用于有限数量的有机体,当前的分型主要在参考或公共卫生实验室内执行,这意味着结果通常不可用于可控的临床时间框架内。但是基于细菌WGS数据的单核苷多态性分析可在不间断的疾病爆发的时间段内执行,并不受是否建立分型方案影响,而且与大多数基于测序的分型方案相比分辨率更高。在这种方法中,为WGS数据指定参考基因组,基于预先建立的质量度量鉴别和过滤单核苷多态性,接着执行系统发生分析评估细菌分离菌的相关性。该方法的在医院疾病爆发研究的环境中用于重构传播途径的可行性已经被最近的一些小型研究证明。但是在医院疾病爆发的环境中使用WGS的经济实用性以及是否与传播事件保护的相关性仍需论证。


确认、质量控制和熟练程度的保持


在临床实验室中任何诊断试验的使用都需要分析确认和临床确认,而且监视、质量控制文件和熟悉程度的测试同样需要万分的仔细(表3)。在这方面,尽管测序方法相同,临床实验室内执行的用于患者护理的NGS和研究环境中的NGS却有很大差异。美国医学和基因组学学会公布了详细的NGS临床实验室标准。不仅如此,美国病理学会制定了分子病理学实验室执行临床NGS试验的NGS认可检查表。该分子病理学NGS检查表详细规定了湿洗清洗台工作和生物信息学的文件、确认、质量控制和质量监视的要求,包括指南和数据存储,同时还对新技术的实施和软件发布进行了评估。尽管没有特别针对传染病的应用而开发,但是该检查表为当前微生物NGS检查表的开发提供了框架。

表3. 临床微生物学基于NGS测试的性能特征评估

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然而,NGS在临床传染病环境中的应用面临着挑战,这些挑战源于人类遗传疾病或癌症的诊断环境。例如。由于NGS逐渐地被临床微生物学采用,特征明确以及经过广泛测序的参考微生物有机体将被要求用作质控品和熟练度素材。补充参考菌株,模拟序列数据对于确保充分的生物信息学途径方面也很必要。这些电脑模拟的质控品和熟练程度挑战将对微生物宏基因组学的临床特征、低水平DRM检测以及难以或不能培养的有机体鉴别尤其重要。


目前用于临床传染病测试的NGS都作为实验室开发的测试执行,因为美国食品和药品监督管理局没有批准任何一项临床微生物学NGS试验。尽管如此,FDA对用于临床微生物学的NGS的常规监督尤其仔细,尤其是用于微生物鉴别和抗菌药耐药性标志物检测的NGS。FDA已经发表了讨论性的文章细化临床微生物学使用的NGS诊断器材管理批准/许可的临床应用和确认方法。该文件报告称FDA正致力于一个大于550的高质量管理级序列数据库的编撰,这些序列来自于具有临床相关性的,将用于管理审核的细菌微生物。FDA批准的传染病NGS体外诊断的可能性将可能有助于标本处理、文库制备以及测序和数据解析的标准化,确保NGS产生的基因型结果的准确性和再现性。这项标准和质量保证尤其重要,假定易受污染的微生物DNA普遍存在于使用的NGS提取试剂盒和试剂,以及那些无菌标本运输容器中,将是一件很糟糕的事情。


结  论


在此我们审查了临床微生物学NGS方法用以鉴别和表述医学重要病原体的应用领域。许多研究已经进行了概念验证试验或研究调查,基于NGS的试验也已经被微生物学实验室有选择地用于诊断。常规应用很有可能会增加成本、周转时间但能充分降低复杂性,使NGS能作为现有比较经济的、值得考虑的更简单方法,对当前使用的试验进行补充。例如GnuBIO已经开发出了一种台式测序仪,能够自动执行目标富集、执行基于荧光共振能量转移的数字测序,并能在3小时内对提取的核酸进行序列分析。随着这样的技术不断发展成熟,NGS在传染病测试中的普遍应用也将指日可待。


依靠扩增子测序的靶向NGS试验如HIV耐药性测试,如果其灵敏度由于Sanger测序并能累计数据支持低丰度耐药性突变的临床相关性,择期会成为首先引入临床的测试。基于NGS rRNA基因扩增子测序在具有高感染可能性且不能对致病微生物进行培养,或出现疑似混合感染时,可能也会广泛应用于病原微细菌和真菌的鉴别。WGS策略在测试优化后能提供比培养或当前分子方法更快的临床可控数据时,也可有助于无菌标本的病原体鉴别。更重要的是,NGS方法和生物信息学途径能准确鉴别和表述病原体的能力需要严苛地确认并与传统诊断技术相比较。


基因组疗法最大的吸引力是WGS能在一次实验中提供病原体的全部相关信息,包括种群鉴别、菌株分型、毒性检定和抗菌剂耐药性。事实上,在临床微生物学实验室中广泛实施的NGS会要求增添昂贵新设备,尤其是需要对实验室工作人员进行训练使其熟悉可靠的生物信息学。生物信息学途径需要具有人性化的界面能让用户直接从测序设备中输入数据并与复杂的构建良好的参考基因组数据库进行完美匹配。


因此,在现在这个时候,NGS的作用是补充而不是取代传统的诊断测试。有一项重要的障碍,即使在最精密的临床实验室中,尽管大规模的宏基因组学的努力如人类微生物群系项目定义了大量的序列和功能之间的新相关性,但是许多临床相关微生物的基因分型表型相关性也是未知的。最后,NGS方法在传染病诊断测试中的远大的前景需要临床微生物学家能够成功地开发试验,解析和评估NGS数据并将这些数据应用到适当的临床环境中。


              (摘自《The Journal of Molecular Diagnostics》,版权归其所有,仅供内部参考学习)

编译:张凯

审校:王小茜