维生素D实验室检测进展
维生素D为脂溶性类固醇衍生物，主要来源于膳食和紫外线光照皮肤后合成，进入肝脏后被羟基化为25羟基化维生素D（25(OH)D），进而在肾脏内转化为维生素D的活性代谢物1,25双羟维生D （1,25（OH）2D），由肾脏分泌后进入血液循环(1)。由于25(OH)D是维生素D在血液中的主要运输形式，浓度高且稳定，半衰期长（2-3周），因此血液中25(OH)D水平被认为是衡量人体内维生素D状况的重要指标。根据2011年美国内分泌专业委员会最新发表的维生素D临床指南，包括孕妇及哺乳期、婴幼儿等各年龄段的人群都推荐其血清25-OH维生素D最佳水平在30ng/mL以上，25(OH)D≤20 ng/ml为缺乏，25(OH)D在21～29ng/ml为维生素D相对不足(2)。
由于人类生活方式改变（室内生活时间变长，防晒霜和防晒衣物的普及）及自身原因（皮肤黑色素含量，皮肤维生素D产生减少和破坏增加），维生素Ｄ缺乏在世界范围内普遍存在，影响着30%-50%的人(3)。随着对维生素D的研究不断深入，发现维生素D缺乏不仅会引起骨骼健康失衡，导致骨质疏松，跌倒和骨折等，还与多种疾病息息相关，如肿瘤、心血管疾病、糖尿病、中风、类风湿关节炎、多发性硬化症、帕金森氏症、不孕不育等(4)。因此，通过临床实验室检测维生素D水平，进而评判是否缺乏的需求也迅速增加。体外诊断公司相继开发了测定25(OH)D的免疫学方法，为实验室提供了自动化检测手段。
维生素D检测方法简介
目前常用的维生素D 检测方法主要包括基于色谱的高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱法（LC-MS/MS），和基于抗原抗体结合的免疫学方法，包括放射免疫、酶联免疫（ELISA）、化学发光法等。
虽然HPLC和LC-MS/MS灵敏度和精确度较好，可以分别检测出25(OH)D2和25(OH)D3的含量，但需要特定检测设备，机器昂贵，需要熟悉仪器的有经验技师操作才能得到准确的结果，且检测速度不适于大批量的临床标本，不适于临床应用推广。
免疫方法中，放免检测由于存在放射污染，目前已基本被淘汰。ELISA方法手工操作，结果易受人为因素影响。所以目前临床多采用化学发光免疫分析法检测25(OH)D。此类方法无需萃取步骤和色谱分析，全自动化学发光平台操作简便、自动化程度高，精确度和灵敏度亦可满足临床需求。但需要注意的是，早期多采用竞争性蛋白结合分析法由于会受到内源性维生素D结合蛋白的影响，其灵敏度和特异性不佳，远不及近年来得到广泛认可的采用25-羟基维生素D特异性抗体结合法进行检测的真正免疫方法。该方法由意大利索灵诊断公司（DiaSorin）首创，经过30多年发展，根据全球维生素D检测的权威第三方机构DEQAS(Vitamin D External Quality Assessment Scheme)的信息，目前索灵诊断公司全自动化学发光检测平台拥有超过30%的全球25(OH)D检测用户。
维生素D检测的技术难点
对于血清25(OH)D浓度的检测目前仍存在一定技术挑战(5)，包括：
1.血液中的维生素D通常与结合蛋白（VDBP）结合，所以首先必须将其从血清中的VDBP中解离下来；
2.利用抗体或重组结合蛋白重新捕获25羟基总维生素D, 并排除其它形式干扰；
3.排除样本中VDBP及其它抗体（IgG 、IgM、嗜异性抗体）的干扰；
4.排除3-差向异构体的干扰；
5.达到临床可接受的精密度、敏感度、线性等参数要求
血液中3-差向异构体、VDBP以及嗜异性抗体等干扰，易造成维生素D检测的假阳性升高，使维生素D缺乏患者检测值表现为正常而贻误治疗。
重视维生素D检测标准化
临床对于维生素D检测需求增加，不少体外诊断产品公司也相继开发了维生素D检测试剂盒，但是由于缺乏国际公认且可互通的维生素D参考物质，不同维生素D检测方法，以及市场上的多种维生素D检测方法之间存在差异。有时甚至结果差异显著，影响临床判断(6)。
为了缩小维生素D不同测试间差异，使病人结果具有一致性，2010年美国疾病控制中心预防中心（CDC）、美国国家卫生研究院食品补充品办公室（NIH ODS）与美国国立卫生研究院（NIH）、国家标准和技术研究院（NIST）和比利时根特大学合作，共同提出维生素D标准化项目（Vitamin D Standardization Program，VDSP）(6)。该项目收集40份美国病人标本，并用LC-MS/MS进行检测，维生素D浓度范围涵盖5.04-60ng/ml，作为被赋值的标准品，被分发至生产厂商以及经挑选的实验室进行检测。
获得该维生素D标准化项目认证主要包括两个阶段。第一阶段，生产厂商及实验室使用实验室开发的测试来检测维生素D，样本来自于40份赋值的血清样本用于校准。数值由JCTLM验证的参考方法测定；使用这些样品校正可以使厂商与实验室根据ISO17511建立的测量具有溯源性。对于免疫学方法，参与者收到一组内部标准品与病人参考样本匹配。第二阶段，当参与者对初始样本确认校正后，美国疾病控制中心预防中心（CDC）分四批每批10个盲样来确认和监测校正的稳定性。当参与者通过了连续的四次调查，他们会获得1年的认证。每年进行一次重新认证，标准是5%的平均偏倚以及10%的不精确度，从而保证25(OH)D的检测在不同的时间、地点和实验室获得准确性和可比性。2014年，意大利索灵诊断(DiaSorin)LIAISON®25-羟基总维生素D化学发光定量测定试剂盒未经内部调整就获得了由美国CDC等权威机构主导的维生素D标准化项目（VDSP）认证。
作为全球第一家进行维生素 D检测试剂研发和推广的公司，索灵诊断(DiaSorin)自1985年推出第一盒维生素D放免检测试剂盒，在过去的3年中，一直致力于维生素D检测的技术开发，于2004年推出化学发光全自动检测平台，该产品线性范围为4-150ng/ml，覆盖了从严重缺乏、不足、充足、过量到中毒的多个医学决定水平。2014年率先在全球推出检测活性1，25双羟维生素D试剂，获得美国FDA批准。Christopher-John L. Farrell等曾就多种维生素D检测方法进行比对，包括LC-MS/MS，索灵放免检测、IDS酶联检测以及索灵、雅培、罗氏、西门子全自动化学发光检测，其中索灵25-羟基总维生素D化学发光检测试剂在4种化学发光检测产品中，与LC-MS/MS相关性最佳，相关系数达到0.949(7)。作为维生素 D检测领域的领导者，索灵诊断为全球的维生素 D检测实验室和临床提供了可靠的工具，为人类健康发挥了不可或缺的作用。
参考文献：
1.Carter GD,et.al. Accuracy of 25 hydroxy vitamin D assays：confronting the issues. Curr. Drug Targets,2011,12(1):19-28.
2.Holick et al. Evaluation, Treatment, and Prevention of Vitamin D Deficiency: an Endocrine Society Clinical Practice GuidelineJ Clin Endocrinol Metab, July 2011, 96(7):1911–1930
3. Lavie CJ, Lee JH.Vitamin D and cardiovascular disease will it live up to its hype.J AM Coll Cardiol,2011,58(15):1547-1556
4. Mitchell G. Scott,et.al. Vitamin D:The More We Know, the Less We Know. Clinical Chemistry 60:12(2014):1-4
5. Markus Herrmann.The measurement of 25-hydroxy vitamin D–an analytical challenge. Clin Chem Lab Med 2012;50(11):1873–1875
6.Christopher T. Sempos et.al. Vitamin D status as an international issue: National surveys and the problem of standardization. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 32–40
7. Christopher-John L. Farrell et.al. State-of-the-Art Vitamin D Assays: A Comparison of Automated Immunoassays with Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Methods. Clinical Chemistry 58:3, 531–542 (2012)
索灵诊断医疗设备（上海）有限公司 供稿
