用转录介导的扩增技术检测（西班牙） 加泰罗尼亚献血者中戊型肝炎病毒（HEV） 的血清学盛行率和HEV RNA

背景：戊型肝炎病毒（HEV）是对输血安全的新威胁。本研究的目的在于测定加泰罗尼亚献血者的HEV免疫球蛋白（Ig）G和RNA盛行率。

研究设计和方法：在2013年6月至12月期间，从Banc de Sang i Teixits（西班牙巴塞罗那）的匿名、无报酬献血者中采集了将近10，000例样品。用Wantai和Mikrogen免疫测定法并行检测1082例捐赠样品子集的HEV IgG，以进行血清学研究。用Procleix HEV试验（95% 检测限是7.9 IU/mL）分别检测样品（个体-捐献核酸试验[ID-NAT]）是否存在HEV RNA。Procleix重复反应捐献结果经过内部实时聚合酶链反应（PCR）试验证实。

结果：IgG抗HEV在加泰罗尼亚献血者中的盛行率分别是19.96%（Wantai试验）和10.72%（Mikrogen试验）。用Procleix HEV试验筛查9998例样品，得出3份经实时PCR证实的IgM和IgG抗HEV阳性捐献样品，病毒载量分别为250、564和2755 IU/mL。最高病毒载量的捐献样品是3f基因型。HEV RNA阳性率是1/3333捐献样品（0.03%；95%置信区间，0.01%-0.09%）。

结论：Procleix HEV ID-NAT筛查系统提供了加泰罗尼亚献血者中存在HEV RNA的证据。需要更多的数据来评估HEV感染对危险患者的影响，从而设计增加患者安全的最佳方案。

戊型肝炎病毒（HEV）是小型的无包膜病毒，属于戊型肝炎病毒属。戊肝感染最初于1980年代爆发流行性非甲非乙型肝炎被发现。随后该病毒cDNA被克隆和测序。影响人类的HEV基因型至少有4种。基因型1和2疾病见于资源有限的国家，主要通过粪口接触和污染水传播。基因型3和4在世界各地都有发现，多与食用未煮熟的肉类和贝类有关。急性感染的临床征兆包括恶心，呕吐，身体不适，食欲不振和黄疸。这种疾病的病程通常具有自限性，孕妇和免疫力低下患者除外（可能发生爆发性肝炎）。戊肝感染在免疫力低下患者，尤其是实体器官移植受者，和人体免疫缺陷病毒患者中可能转为慢性。

HEV感染通常是亚临床的，因为很多研究证明免疫球蛋白（Ig）G抗HEV在普通人群和献血者中的盛行率高。近期欧洲数据表明HEV IgG在德国献血者中的盛行率是6.8%，在荷兰献血者中是27%，在法国南部高发病地区是52%。虽然这些差异在一定程度上可能是由于采用的试验所致，但是显然相当大比例的欧洲成人暴露在HEV环境中。HEV RNA在血液和血浆捐赠者体内的盛行率有所报道，输血传播的HEV感染案例在日本、法国、英国和沙特阿拉伯也有记载。

在西班牙，对加泰罗尼亚人中所做的2项血清学研究证明5%的儿童和8%的成人具有HEV感染史。然而，尚没有西班牙献血者实际HEV盛行率的数据。本研究的目的在于评估HEV暴露（IgG）和活性感染（HEV RNA）在加泰罗尼亚献血者中的盛行率。

材料和方法

献血者样品  

从2013年6月至12月，在Banc de Sang i Teixits（西班牙巴塞罗那）通过常规血液筛查共采集了9998份献血者样品。在匿名处理之前记录了每位献血者的性别和年龄。除了常规血液捐赠，没有采集附加样品。每位献血者采集了2份EDTA血浆样品和1份血清样品，在检测之前样品均保存在-30℃。该研究获得了机构审查委员会对于Vall d’Hebron大学医院临床项目的批准。

血液学检测

9998份捐赠血清样品的一个子集，由首批连续采集的1082份捐赠样品组成，接受了HEV IgG抗体检测（图1）。血清学研究的样品量是根据之前研究报道的德国献血者流行率6.8%±1.5%（Z值=1.96）计算而来的。依据厂商说明，用Wantai IgG酶联免疫测定（ELISA）试验（中国北京，Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co.）和Mikrogen IgG ELISA试验（Mikrogen GmbH）分析血清样品是否存在HEV IgG。重复检测2次最初反应的样品，至少其中1次反应才认为是阳性。

用Wantai IgM ELISA（Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co.）和Mikrogen IgM ELISA（Mikrogen GmbH）检测阳性HEV IgG样品是否存在HEV IgM抗体（用Wantai和/或Mikrogen方法之一即可）。重复检测2次最初IgM反应的样品，至少其中1次反应才认为是阳性。

HEV RNA筛查试验和确认方法

在圣迭戈Hologic公司，配套使用全自动核酸检测分析系统（Procleix Panther系统，加州埃默里维尔Grifols Diagnostic Solutions，Inc.与加州圣迭戈Hologic，Inc.联合开发）与Procleix HEV试验检测9998位献血者每位一份EDTA血浆样品，进行HEV RNA筛查（图1）。

图1. HEV研究设计。*试商期；**内部实时PCR。

Procleix HEV试验基于转录介导的扩增（TMA）技术，在全自动平台Panther系统上完成。分析灵敏度板包含连续稀释的HEV WHO国际标准品（PEI Code 6329/10）和体外合成的对应HEV基因型和亚型的转录本板，被用于评估试验灵敏度。在Panther系统上用HEV试验检测分析灵敏度板。TMA试验显示用WHO标准品得出的95%检测限（LOD）是7.9IU/mL（表1）。该试验检测了所有4种主要HEV基因型（1、2、3和4），采用HEV 1，2，3a，3b，3f，和4c的RNA转录本得出的95% LOD范围是7.9-17.7copies/mL（表2）。

表1. HEV WHO国际标准品（PEI Code 6329/10）分析灵敏度板的LOD

本研究在全自动核酸检测分析系统上对样品分别进行检测。重复检测最初TMA反应的样品，只有在重复检测结果为反应的情况下才认为一份样品是阳性的。

在Sanquin Diagnostics（荷兰阿姆斯特丹）对独立的EDTA血浆样品进行检测并对HEV ORF3的74-bp片段进行扩增。用Virus Spin Kit（荷兰KJ Venlo，Qiagen，QIAamp MinElute）从0.4mL血浆中提取出RNA，再根据厂商方案洗脱成50μL溶液。在提取之前加入MS2噬菌体作为内部质控品。扩增使用50μL中的20μL洗脱液，该洗脱液包含12.5μL病毒一步法预混液（加州卡尔斯巴德，Life Technologies，TaqMan Fast）、0.2μmol/L HEV探针（FAM-ATTCTCAGCCCTTCGC-MGB）、0.6μmol/L HEV正向引物（CGGTGGTTTCTGGGGTGA）、和0.9μmol/L HEV反向引物（GCRAAGGGRTTGGTTGG）。用实时PCR系统（瑞士巴塞尔，Roche，LightCycler 480-II）和标准PCR条件执行聚合酶链反应（PCR）。反应一式两份，用MS2特异性引物和HEX/BHQ1标记的TaqMan探针进行或不进行MS2检测。该试验的LOD下限（95%临界值）之前确定为25 IU/mLHEV RNA。利用基于首个WHO HEV RNA国际标准品的校准曲线，从PCR循环阈值（Ct）反向计算得出HEV病毒载量。

基因型测序

按照厂商的说明，通过PCR扩增测定HEV基因型，然后用AMV RT和GoTaq DNA聚合酶（威斯康星州麦迪逊，Promega）对ORF2域的326-bp片段进行测序。利用Baylis及其同事描述的HEV参考序列和基因库的附加HEV序列，通过计算机软件（威斯康星州麦迪逊，Promega，DNASTAR，Lasergene；新西兰奥克兰，Biomatters，Geneious）完成序列分析。用Tamura-Nei模型计算遗传距离；该系统树是用邻接法构建的。

丙氨酸转氨酶测量

依据国际临床化学和检验医学联合会给出的标准方法（无吡哆醛磷酸盐活化），在生化分析仪（德国柏林，Roche，cobas 6000）上分析评估丙氨酸转氨酶（ALT）水平。正常的ALT范围在男性中是8- 44IU/L，在女性中是7-34IU/L。

统计分析

盛行率用百分比单位表示，95%置信区间（CI）和定量变量则用均值和标准差表示。皮尔森的卡方检验用于比较比率，t检验用于比较均值（纽约阿蒙克，IBM，SPSS Statistics）。用评分方法（北卡罗来纳州卡瑞，SAS Institute，SAS企业指南，版本5.1）计算HEV RNA盛行率的95% CI。为了评估Procleix HEV试验的分析灵敏度，通过概率单位分析确定了50%和95%的检测率（SAS Institute，Inc.，SAS企业指南，版本5.1）。

结      果

血清盛行率

对1082位献血者执行HEV IgG测试（53%是男性；年龄在46±12岁之间）。由Wantai试验测定的粗略总HEV IgG盛行率是19.96%（在1082份样品中，216份样品重复检测结果为反应性；95%CI，17.60%-22.32%）。由Mikrogen测定的HEV IgG盛行率是10.72%（在1082份样品中，116份样品重复检测结果为反应性；95%CI，8.90%-12.60%）。阳性样品的平均ELISA信号/临界值（S/CO）比分别是8.44±5.19（Wantai）和2.93±1.78（Mikrogen）。Mikrogen IgG试验检测为阳性的所有样品，经Wantai IgG试验检测也为阳性。

HEV IgG抗体的盛行率根据献血者的人口统计学特征变化而变化。两项试验都发现，与女性献血者相比，在男性献血者中阳性率明显更高（Wantai，22.6% vs. 17.1%，p=0.029；Mikrogen，12.8% vs. 8.4%，p=0.001）。另外，HEV IgG抗体的盛行率随着献血者的年龄增加而成比例地增加（见图2）。对所有年龄组而言，Wantai试验的阳性率高于Mikrogen试验，在61岁以上的献血者中差异最大（39% Wantai vs. 17% Mikrogen）。然而，在两项试验中盛行率都随着年龄显著增加（p < 0.001）。

图2. 按照年龄组分类，在1082位献血者中抗HEV IgG的盛行率。（■）Wantai IgG ELISA检测出来的抗HEV IgG阳性献血者的比率；（■）Mikrogen IgG ELISA检测出来的抗HEV IgG阳性献血者的比率。

表3概述了HEV IgM检测的结果。在216位IgG阳性的献血者中，研究发现13位献血者对至少一种方法显示IgM阳性。其中9位只对Mikrogen IgM ELISA显示阳性，3位只对Wantai IgM ELISA显示阳性，而样品ID-831用两项ELISA试验检测时都显示阳性。这13份IgM反应样品都没有可检测的HEV RNA。

HEV RNA筛查与HEV RNA反应结果确认

HEV RNA研究利用Procleix HEV试验在全自动核酸检测分析系统上分析了9998份样品。4份样品最初有反应，其中1份样品在重新检测附加样品时显示阴性，因此根据研究设计的定义被认为是假阳性结果；另外3份样品在重复检测时有反应。基于这些结果，HEV试验的临床特异性被确定为99.99%（95% CI，99.94%-100.00%）。表4总结了3份HEV RNA反应样品的特征。它们属于一位女性和两位男性献血者，显示了正常的ALT水平和始终一致的HEV IgG和IgM阳性结果。为了获得近似数量的HEV病毒载量，在TMA试验中连续稀释和重新检测样品。按照1:32稀释时经终点稀释计算两份样品（ID-3678，ID-8689）的估算定量值是290 IU/mL，按照1:316稀释时样品ID-9575的估算定量值是2900 IU/mL。

用独立的样品在内部执行实时定量HEV PCR试验确认这3位献血者的HEV RNA反应性。经确认3份样品为阳性，且定量结果与TMA试验中终点稀释法获得的估算病毒载量相关，分别是ID-3678 250 IU/mL、ID-8689 564 IU/mL和ID-9575 2755 IU/mL（见表4）。

HEV测序只能在3份已证实阳性样品的最高病毒载量样品（ID-9575）中进行，显示HEV基因型3f。因此，对加泰罗尼亚献血者的HEV RNA筛查结果是在9998份样品中3份样品确认为HEV RNA阳性（1/3333），相当于HEV RNA盛行率为0.03%（95% CI，0.01%-0.09%）。

讨      论

研究对加泰罗尼亚献血者的血清学研究表明，根据所用的IgG试验，结果大不相同。Mikrogen IgG ELISA的HEV暴露率是11%，但是在Wantai IgG ELISA中观察到20%反应率。还有几项研究报道了献血者的HEV IgG盛行率：苏格兰是4.7%，德国是6.8%，希腊是9.4%，荷兰是27%，英格兰和北威尔士是11%，法国比利牛斯则高达52.5%。然而，研究的结果必须与采用相同试验的其他HEV IgG反应率报告相比较。考虑到这点，研究的发现稍高于德国献血者的观察结果（Mikrogen试验显示6.8%盛行率），与荷兰献血者的结果相似但偏低（Wantai试验显示27%盛行率）。与本地区有关HEV IgG盛行率的先前研究相比，研究发现献血者的总体盛行率高于普通人群的盛行率（HEV IgG Biokit试验测量的结果是7%）。此外，所用的IgG检测方法能够解释相似人群中的盛行率差异。另一个发现就是暴露率在男性中比在女性中稍高但是具有统计学意义，同其他研究结果。

如本研究所示，加泰罗尼亚献血者一直暴露于HEV环境中，暴露率在老年个体中更高，符合先前其他研究所述的结果。

这种依赖于年龄的盛行率是由于一生中均匀暴露于HEV还是由于过去这些年的群体依赖性暴露尚不得而知。近期一项对荷兰献血者的储存样品研究表明，在过去HEV暴露率较高，随后在一段长时间内发生率较低，近年来又升高。13位献血者显示IgM阳性和IgG阳性的事实可能表明，当前加泰罗尼亚地区存在戊肝暴露风险。但是，只有一份样品在两项IgM ELISA试验中始终显示反应性，而且IgM S/CO反应水平低于3份已证实为IgM和HEV RNA阳性的捐赠样品。从研究的研究和其他研究的数据可以明显看出，在利用不同的市售HEV血清学试验评估HEV IgG和HEV IgM反应性时，性能特征不同。因此，为了比较不同地区与健康人群和患者组的盛行率与趋势，可能需要血清学方法的技术标准化来统一结果。

HEV活性感染的主要局限性之一是缺乏灵敏的，高通量的，CE认证或FDA批准的器械来检测是否存在HEV RNA。在本研究中，利用全自动核酸检测分析系统（Procleix Panther）对接近10,000例捐赠样品进行了核酸扩增技术（NAT）分析。该试验最近获得了CE认证，使研究能够对所有样品进行单项试验（ID-NAT），与很多其他研究相反，它们是对48-480份样品组成的迷你样品量进行HEV RNA评估的。Procleix HEV试验的95% LOD被确定为7.9 IU/mL（95%置信限，6.6-9.8 IU/mL），并且基于本研究的数据，该试验的临床特异性是99.99%（在分析的9998份样品中，只有1份样品重复检测没有反应性）。Procleix HEV试验的高灵敏度结合ID-NAT或小样品量NAT检测能力使之成为HEV RNA盛行率研究的有用试验，可用于研究潜在的筛查方案，也许还可用于患者诊断。

在本研究中研究确定了3位献血者的重复HEV TMA试验反应结果，这点通过实时HEV PCR试验证实，得出活性HEV感染的盛行率是0.03%（95% CI，0.01%-0.09%）。因而，研究的数据表明大约每3000位加泰罗尼亚献血者中有1位携带可检测到的HEV RNA。根据定量PCR估算的HEV病毒滴度和稀释标本后获得的结果，当检测样品量达到32份捐赠样品时，每份已证实为阳性的捐赠样品预计可被Procleix试验检测出来。本研究观察到的盛行率在欧洲有关血液和血浆捐赠者的其他报告范围内。近期一项血浆捐赠者研究采用内部方法分析了迷你样品量为96份捐赠样品的HEV RNA，作者发现在瑞典血浆捐赠者中HEV RNA盛行率为1/8000，在德国血浆捐赠者中这个比例为1/4500。在荷兰，献血者的HEV RNA盛行率为1/2700（17/45，415），也是利用HEV RNA内部试验，迷你样品量为48-480。根据这些研究，可以得出结论，在欧洲HEV RNA常见于无症状的献血者中。

HEV通过血液成分的传染性在日本、沙特阿拉伯、法国和英国有过描述。在法国，HEV RNA阳性的血浆单位被输注到两名具有完全持久的病毒血症的患者体内。这一发现特别令人担忧，因为这些血浆单位虽然经过amotosalen病原菌灭活，但是仍能够传播HEV给患者。经测定被输注的病毒是HEV基因型3f。尽管没有报告病毒载量是多少，仍有可能是因为病毒载量太高而超过这种病原菌灭活方法的杀病毒能力。但是，考虑到对合格献血者的HEV RNA检测频繁，令人惊讶的是迄今为止只记载了少数HEV RNA传播案例。这可以解释为不同因素的共同作用。首先，HEV感染在有些患者中可能未被诊断出来。其次，通过输血暴露于HEV的患者如果已经具有HEV IgG中和抗体或他们能够在亚临床暴露之后自发清除感染，则会免疫。最后，很多HEV RNA阳性献血者有可能具有低病毒载量（与抗HEV中和抗体共存），这可以减少血液制品的潜在传染性。本研究确定的3位献血者很可能属于后面这一类。例如，加泰罗尼亚地区血站大概每年收集250,000份血液捐赠样品。因此，利用本研究发现的HEV RNA盛行率95% CI 0.01%-0.09%进行粗略计算，得出每年存在危险的捐赠样品数在25-225之间。在近期英格兰的一项研究中，作者发现HEV传播受到献血者中存在HEV IgG和/或IgM、血液成分中剩余血浆量和病毒载量的影响。据他们报道，HEV RNA阳性血液成分的总体传播率是42%，虽然大部分患者解决了感染问题，但是受者的病毒血症持续时间取决于免疫抑制的程度。需要进一步的多中心研究来确立有无抗体的捐赠样品的最小感染量，以说明HEV剩余传播风险。

面对这么多的不确定度，考虑附加的血液筛查或血液成分安全措施为时尚早。献血者选择在这里似乎不适用，ALT水平在研究的3位HEV RNA阳性献血者中是正常的。一旦实施，应该通过迷你样品量或ID-NAT执行普遍HEV RNA筛查，这就造成了成本、技术缺陷和血液发放后勤等问题。与巨细胞病毒筛查方案相比，以易感患者为目标产生HEV阴性结果的选择性检测不可行，因为易感患者包括具有潜在肝病的受试者和任何免疫力低下的个体（肿瘤血液学患者，实体移植受者，早产新生儿等）。所有这些因素说明了加泰罗尼亚50%以上输血患者的情况。此外，建议优先筛查某些血液成分（也就是，血浆输血，不管是检疫血浆还是灭活血浆）的HEV RNA，因为这些成分可能携带最高的HEV传播风险。然而，同样地，其他成分比如血浆量高的分离血小板也可以被选择用于HEV NAT筛查。

总而言之，HEV暴露在加泰罗尼亚献血者中的盛行率是11%-20%，取决于采用的血清学试验，而ID-NAT可检测的HEV病毒血症盛行率是0.03%。需要更多通过血液成分传播HEV剩余风险的确切机制和因素数据。最后，由于在欧洲经食物传播HEV感染的高背景发生率，在设计增加血液安全的最佳方案之前首先辨别使患者置于HEV感染风险的因素胜于一切。

（摘自Transfusion，版权归其所有，仅供内部参考、学习）

编译：王小茜