分析前变量影响生物库中 人类生物样本的完整性

作者:Ellervik C
2021-12-16

摘 要:

背景:临床化学实验室发生的误差大多归结于分析前误差,生物样本的分析前变量对后续研究结果的分析有显著影响。因此,对于未来应用生物样本进行诊断及预后判断的个性化医疗,控制这些变量是根本。

内容:本篇综述的重点即为检验影响生物库中人类生物样本的分析前变量,主要关注血液、唾液和尿液样本,同时讨论相关的成本效益。

总结:一项研究的质量依赖于生物样本的完整性。涉及到对后续研究结果分析的影响,应充分考虑分析前变量。目前,生物样本研究文献并不常规记录这类分析前变量。今后,应用生物样本的研究应当详细描述样本的分析前处理,并且分析、阐明受这些分析前变量影响产生的结果。


生物样本库的工作即为,为将来研究使用,从而进行生物样本的收集、加工、运输、储存(生物保存)及检索。循证实践对于生物样本库的未来至关重要,但仍需更多的科学研究。多种因素影响临床生化的最终结果,例如:分析前生物或环境变量、分析前技术变量、分析变量及分析后变量(图1)。“分析前”这一术语定义为任何事物出现于分析阶段之前,因此,基本上所有发生在出库之后分析一份生物样本之前的所有步骤,称之为生物样本库的分析前处理。分析前变量就是影响生物样本完整性及随后研究结果的处理因素,无论是系统的还是随机的,它都可以引起体外修饰,从而反向影响最终结果。当研究结果偏离预期,我们通常质疑结果的分析完整性,而不是分析前完整性。即使研究分析方法完美,也可能得到错误的结果,临床化学实验室发生的误差大多归结于分析前误差,分析前误差可导致错误的研究结果或系统性偏差。由于研究的质量取决于生物样本的完整性,所有评估和控制分析前处理是将来最佳利用生物样本的基础。


此篇综述主要关注血液、唾液和尿液以及衍生物DNA、RNA和蛋白,阐明分析前变量影响人类生物样本的完整性。


 生物样本收集的分析前因素

所有生物样本应当视为生物危害品,并且所有涉及生物样本的操作应当遵循实验室安全总则。队列研究收集生物样本是样本大小、数量与样本类型、自然增长率、位置、花销、运输物流和储存设备之间的平衡。最终的参与率依赖于对参与者的合理要求。一类应用生物样本的研究,其处理流程并不总是适用于其他类型的研究。因此,决定收集特定用途的生物样本的类型和大小,影响着后续所有的分析及逻辑。


收集生物样本可以是有创的(如:血液)、微创的(如干血滴DBS),或是无创的(如尿液、唾液),血液、唾液和尿液是临床分析常用的。微创和无创方法的使用,使得珍贵的血样使用量最小化,并且由于减少花销、无需特殊人员、收集方便、受试者更愿意捐献样本等优点,从而增加研究总体的样本量(表1)。患者是否愿意捐献生物样本,对于儿科生物库来说尤为重要。


生物和环境因素同样影响研究后续结果分析(表2),这些因素的总变异可能会影响分析物的表达水平。因此,将这些因素标准化、详细记录,并在解释或比较或合并研究结果的时候纳入考虑范围内,就显得尤为重要。每隔一段时间对相同个体进行重复检测可减弱分析前和分析变异的影响。也可进行较长时间间隔的连续性检测,以获知随着时间的延长而发生的变化和影响。


在临床化学实验室,与生物样本交接相关的分析前变量同样会影响样本的数量或质量(比如:错失、错误、或重复收集,数据入库差错、错误的患者或样本编号、样本量不足、样本稀释、贴错标签、样本丢失)(表3)。另外,没有知情同意、忘记或丢失知情同意书、有限制性知情同意的生物样本,其分析获得的价值也是有限的。


表1:主要生物样本类型的优缺点

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表2:影响血液、尿液和唾液中下游检测分析物的生物和环境变量

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表3:生物样本库内血液和干血滴的分析前变量、推荐和所需文件

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表3:生物样本库内血液和干血滴的分析前变量、推荐和所需文件

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 血 液

应由经过培训的员工进行生物样本的收集,特别是儿童采血,必须是在儿童静脉采血方面有专业经验的员工。采样工作人员的专业性对于保证生物样本的质量是至关重要的,同时也可避免捐赠者的不快,如果再次采血,可导致捐赠者不愿捐赠生物样本。


根据后续研究方向、预期当前和未来分析物的不同,多种含不同添加剂的采血管可选择(表3-5)。所需血液成分根据采血顺序不同而改变,第一次采集最具代表性。不同颜色的采血管代表其中有不同的添加剂。临床化学实验室总原则推荐:根据采血管中添加剂的不同进行特殊顺序的采集,以避免交叉污染(检验医学部有适合的指南),但这种方式对于闭合系统中的生物样本完整性意义微乎其微。由于不同厂家可能使用不同的添加剂或抗凝剂,不同批次的产品会导致偏移,所以整个研究过程中及组间(实验组/对照组,协作组)都应使用同一品牌的采血管,甚至最好是同一批次(试研究时间长短决定)。由于随着时间的延长,采血管内的真空状态减弱,由此会影响血液充满采血管,所以应当检查采血管的失效日期。并且采血设备和采血管的成分(管塞、管塞润滑剂、管壁、表面活性剂、促凝剂和分离胶)可能会干扰内源性分析物、添加外源性物质或是结合血液中的成分,从而导致后续这些因子的检测发生偏移。体位的不同(站立、坐位、仰卧)可引起血浆容量的改变,从仰卧到坐位到站立,逐渐增加血液浓缩的概率,从而增强分析物表达水平的改变。使用太细的针采血会导致溶血,继而影响血细胞计数和钾浓度的结果。长时间使用止血带会引起血液浓缩和分析物浓度的改变。尽管采血管说明书中推荐混匀血液,但是一项近期研究表明,相比较混匀的情况下,没有混匀并未对分析物的结果引起临床上的显著差异。溶血、黄疸和高脂血可导致假阳性或假阴性的不可靠结果出现。过度填充会增加血液/添加剂比例,从而产生错误结果。


一般来说,EDTA抗凝管适合检测DNA(全血、白膜层)、血液学检查(全血)、血红蛋白A1C(糖化血红蛋白;全血)以及多种蛋白(血浆);氟化钠采血管适用于检测血糖;含肝素锂的血浆适用范围较广,例如:铁离子浓度、甲状腺激素、肾功能、肝酶、C反应蛋白和其他蛋白;含枸橼酸化合物的采血管更适宜检测凝血功能,该检查需要特别注意,过分摇晃容易引起溶血或血小板凝集,从而影响结果。不恰当的静脉采血方式会导致止血系统错误激活而造成溶血。在多种凝血实验中,长时间的静脉淤血会引起血液浓缩,生成不可靠的变量。


在那些缺乏物资的偏远地区,DBS是收集生物样本的较简便的方法。DBS来源于外周毛细血管的血液(表4),量小(50-100μL),存放在专用的纸卡上。样本需在室温下水平静置3-4小时以干燥,如果样本出现凝结、分层、过饱和、量不足、潮湿、血清环、明显溶血的迹象或是外源性污染等情况,将会被拒收。收集纸便宜、相对容易制造、印刷,且有良好的吸附能力。DBS可有多种用途(表4、5),纸张类型、处理纸张的化学品、纸张厚度、应用的血容量、血液的密度和黏度不同,可引起后续分析的提取回收率、基质效应、分析物稳定性和色谱分析的不同。与静脉穿刺相比,DBS的优点为:低成本、相对无痛操作和样本易收集、运输、储存(表1),但是温度、阳光直射、湿度和潮气都是影响DBS样本稳定性和分析物复苏的直接因素(表2)。


影响代谢组学和蛋白组学的分析前样本收集因素有:生物样本类型(全血、血清、血浆、DBS)、采血管添加剂、蛋白酶抑制剂、溶血、血容量、不同管内的聚合物、分析前暂存温度以及从收集到分析的延迟。这些因素可产生基质效应,或是影响敏感性、复苏或分辨率。对蛋白完整性的处理、加工和储存可能会引起体外蛋白修饰(如:蛋白水解、氧化、降解、聚合),由此可能成为生物标记物研究中的混杂因素。在代谢组学和蛋白组学分析中,DBS的缺点是需要检测技术发展和批准生效,且小量的样本足够使用。


影响DNA和RNA的生物因素有:性别(女性比男性产量高)、年龄(年龄越大DNA产量越低)、BMI(BMI越大产量越高)以及吸烟(吸烟者比从未吸烟者DNA产量高)。带粉手套上脱落的粉末可能会使得PCR反应假阴性增高。


对于脱循环细胞DNA(ccfDNA),推荐使用血浆,并且避免溶血。ccfDNA浓度在室温或4℃下可维持稳定状态4-6小时。


RNA易受自然界中酶的影响而降解,影响RNA数量、质量、基因表达分析的分析前收集相关因素有:采血管类型、去酶状态、管内添加剂、生物样本类型、血容量、提取前的暂存温度和提取延迟。从Tempus管中提取的RNA产量高于PAXgene管,但是,两种管都能提取出高质量的RNA。脐带血中提取的RNA产量高于成人血(高3-4倍)。血量采集未达标也可影响基因表达。

血浆、血清和其他生物液体中,RNA量均较低。需要特别防范生物样本受RNA酶的污染而导致RNA降解。miRNAs的检测和数量易受多种分析前变量的影响,如:饮食、锻炼、种族、海拔、药物、化学品、吸烟、较大的个体间变异、溶血、凝血时间和温度。EDTA或是枸橼酸血浆都是抗凝的。


表4:生物样本库内血液和干血滴的分析前变量、推荐和所需文件

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表5:后续分析的采集样本类型表

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 尿 液

尿液可多种方式收集:24h、时间点收集、过夜、晨尿、次晨或是其它时间点。生物库收集尿液多用于后期检测多种分析物,包括蛋白组、代谢组、核酸(DNA或RNA)、核苷酸、核苷、miRNA(表 5)。接收药物治疗的患者或个体,其尿液中miRNA水平通常高于健康人群。如果需要进行多项研究,那么这些研究的分析前需求各不相同,就需要在收集后加工前提供多个生物样本或是进行分装。


尽快有多个指南适用于即刻尿液分析(试纸、肉眼观、管型和细胞、微观、白蛋白/肌酐),但是针对多数生物样本的生物标记物研究的最佳分析前处理指南依分析物不同而不同。


添加剂的使用有助于24h尿液收集中特定分析物的保存。有多种不同的保存方法,但是没有一种保存剂可以适用所有尿液分析。添加保存剂及保存剂的量可改变尿液容量,增加干扰检测方法的潜在几率。根据下游分析物以及处理或储存的时间不同,决定尿液样本是否需要冷藏或是放置于冰上暂存(表6)。离心会导致一些分析物丢失,尿液也可能受试纸或细菌污染。正如血样采集,尿液经过滤后会干扰检测或是结合分析物。24h尿液收集完成即是覆盖了整个24小时,24h尿液收集完成可以通过PABA(对氨基苯甲酸)鉴定,因为PABA是完全即刻有尿液排泄的。通常使用肌酐浓度或尿比重调整尿液点收集的滴度。其它针对尿液的分析前变量列于表5。


 唾液

唾液及口腔黏膜细胞样本比血样采集有很多优势(表1):属于非创伤性操作、花费小、易采集、可用于临床样本采集难度较大的情况(儿童、残疾人、害怕扎针的患者)、操作更安全、可用于自检,且可邮递传送样本。唾液可用于一些血液中检测的分析物及生物标记物组学研究,例如:疾病诊断(局部和全身)中代谢组学、转录组学、基因组学、蛋白组学、miRNA和微生物组学(表5)。缺点是分析物浓度较低,而优点是唾液中提取的DNA只能是捐赠者本人的全基因组DNA,而源于血液的样本可能出现他人的DNA,比如:经过多次输血或是骨髓移植后。唾液DNA也是研究血液肿瘤全基因组DNA的一个重要资源。


唾液和口腔黏膜细胞可用管子或卡片采集。唾液采集可以是全唾液,也可以是腺体特异性唾液(表6)。全口腔唾液采集可用多种方法采集,静息状态下(引流/被动流涎、吐痰、吸引、拭子)或是刺激(糖、口香糖、酸)。特异腺体采集是有创的、较复杂的检查,需要专业技术人员。唾液收集应该在进食后至少2小时,采集前需使用漱口水,并且样本放置在冰上,尽量减少细菌反应和蛋白水解而影响唾液成分。对于蛋白组学分析,可添加蛋白酶抑制剂混合物。可使用环境温度和储存设备,以减少储存空间和花销,简化运输要求。刺激下的唾液产生更多变量(组件和组内),但是却比非刺激的更易复苏分析物。全蛋白浓度(蛋白组学)似乎在多种采集方法间无较大差异,但是各种分析物水平视具体收集方法而定。被动流涎的唾液更粘稠,实验室操作难度较大。分泌唾液的量和成分依气味、味道、疾病状态、捐赠者所服药物、年龄、行呗、饮食、血型、生理状态、流速、生理节律、唾液腺的种类和大小以及刺激持续的时长和类型而定。


口腔黏膜细胞可通过漱口水、拭子或细胞刷采集,漱口水方法的缺点是:捐赠者要漱口后吐掉,漱口水通常味道不佳,有时还会引起口腔内灼烧感。


 生物样本加工


血液

血清或血浆应尽量与血细胞分开。许多分析物可在不冷藏的条件下维持稳定24-48小时,但是仍有一些分析物对于采集至冷藏期间的温度和时间较敏感。部分分析物推荐采集至低温保存不超过2小时。推荐使用温控冰箱。完整的生物库血样准备工作流程应与自动化分血系统相配合,产量越高,对自动化分血系统的需求就越高,以确保每份血样容量相同,将血样平均分配至每个分装管内。9-10ml全血可以分装为:血浆(6-7ml),淋巴细胞和单核细胞(1-2ml),红细胞和其他细胞(1-2ml)。由于单核白细胞可连续生长发育,因此是血液中唯一能够培养细胞系的细胞类型。


自动化分血系统可以识别分离胶和血液成分分层,也可分成血浆和血清,能够识别采血管上的条码、脱盖、分层、按照预先设定的量分装至储存容器中,然后再对应相应的储存容器条码。储存容器条码应该是二维码,最好是与储存管相符合以维持条码长时间保存。自动化分血系统应具备完整的样本追踪能力。该自动系统的优点包括样本处理误差小、预防由于重复操作带来的损伤,同样依赖人操作,并需要确保适合的样本追踪。自动化分血系统需要与自动化DNA提取系统相连接,以此获得较高的生物库产出,这样确保了样本追踪、标准化、DNA高质和高产量。对于一些低产出或经费较低的实验室,只需要人工操作就行,但增加了误差的风险。


应在开始处理生物样本时就进行分装,而不是拖到相关实验开始时,因为反复冻融可能对某些情况不利(比如:RNA)。如果采集处离实验室较远,那么可以进行简单处理,如:现场离心、分装、分出血清、分离血浆和白膜层,并将样本放置在可转运的冷藏容器中。但是,较复杂的步骤如:血细胞分层或是培养需要更高端的实验室设备,这不适合较小的低端现场处理。这时候就建议分成多个小份,以减少未来反复冻融那个的可能。近期一项研究证实了使用384个模块化样本储存管系统进行高产出、高密度、低容量的血样本处理和分装,高密度样本研究允许将血样分装成多个70μl/份的小样本。由此作者提出了样本仅用一次的概念,以避免多次冻融。


编码并贴标签对于样本追踪极其重要,要确定标签位置、大小、编码类型(一维码/二维码)、编码密度和分辨率。标签应该是唯一的,且高粘附性,最好是低温稳定、嵌入储存管内及以二维码标识。说明识别码类型、机构名称、使用多种识别码和数字码日期应该可以尽可能减少错误的发生。临床化学实验室中由于标记不当(标记不全、贴错标签、无标记、标签掉落、标签破坏)而产生的总生物样本废品率大约占0.2%至7.6%,唯一的解决办法就是重复采样,强烈不建议重新标记。


研究表明,离心前血样放置超过24小时会引起大多数分析物发生明显变化,延迟处理或许是解释为何三分之一的化学和血液学分析物中超过10%发生变异的原因。因此,推荐立即将血清、血浆从血细胞中分离出来,从而更好地在室温下保持分析物的稳定性。但是,如果无法避免血浆或血清与血细胞接触时间较长,那么推荐使用血清,因为血浆中分析物稳定性相对较差。凝固血样的分析前处理因素包括不恰当的离心速度和时间、离心不配平、移走血浆时粗暴处理和吸取血细胞层。凝血功能检查用的血浆应该是乏血小板的(血小板计数<10×109/L),可通过特定转速离心两次。如果未来要对冰冻血样进行凝血功能检查,那应将血样去血小板处理。


枸橼酸稳定血样比EDTA抗凝血和培养用淋巴细胞获得更高的DNA、RNA产量。新鲜和冰冻全血获得的DNA产量相同。相较于冰冻全血和新鲜血液,全细胞团(ACP)可分别提取80%和90%的DNA。冻存白膜层和剩余血细胞的DNA产量都仅有ACP的一半,且产量变化较大。DBS样本提取的DNA量极少,但研究表明该DNA是全基因组扩增,可用于全基因组相关研究。


处理时间是DNA产量分析前变量的重要来源,研究证实减少血样采集至冷藏、冷藏至离心的时间延迟,可大幅度增加DNA产量。对DNA产量起负调节作用的主要因素是溶血。


ccfDNA推荐血浆双重离心,这样能保证无任何细胞存留(后者可以在长时间储存后完成)。如果血样处理后不着急立即提取核酸,那么样本必须储存在-80℃;如果立即提取,那么血浆必须4℃储存3小时,在冰冻前分装成多个适合单次使用的小份。ccfDNA需要在-20℃储存,并且冻融不超过3次。


分装延迟可影响转录组学、代谢组学、蛋白组学相关物质,而储存温度影响较小。


尿液

分装前,必须将尿液混匀,以保证每个小份中的尿液比重和成分均质。根据后续分析物决定是否需要离心,如果是研究蛋白组学和代谢组学,推荐轻微离心。


唾液

依据后续分析物和唾液粘性的不同,可能需要离心,但是离心有改变或丢失部分唾液成分的风险,现没有确切的最佳离心速度。处理延迟可能导致蛋白峰的增长或降低,这有可能是通过唾液中某些蛋白酶消化作用导致。延迟RNA提取可在长期储存的唾液中添加稳定剂。总的来说,全唾液和口腔灌洗技术优于细胞刷或拭子,因为前者可提供高质量、高产量DNA,并且是高比例的高分子DNA,但是仍低于血样。


 生物样本运输

生物样本运输包括从部门间到国际运输的所有运输方式。错误的包装、标记、分类、标签或是错误完成运输文件记录都会引起延误或海关拒收,由此就可能影响生物样本完整性。运输过程中影响生物样本完整性的变量有:季节、运输时长、延误、距离、运输方式。国际运输特别容易在清关时延误。运输过程中可用电子设备追踪和监测温度。建议不要把所有的收藏品或是相同的样本放在一起运输,而是应该运输少量收藏品,并总是分开相同的样本。


运输全血、血浆、血清、白膜层、尿液、DNA和RNA需要冷藏设备、冷冻机、特别包装、干冰,甚至是价格较高的运输物流。多日运输的话,准备足够的冷却材料至关重要。所有的管子都应保持垂直、向上、旋紧盖子放置,这对血样管特别重要,因为这样放置可以减少溶血发生,并且对非抗凝管,可防止纤维蛋白接触管盖。轻柔操作减少样本晃动的几率,从而减少溶血发生的风险。长距离运输应该使用防震转运箱。DBS应在采集后24小时之内,室温运输至实验室。血液、尿液、唾液、DNA或RNA通过商业运输可能会遭遇极端的季节性气候,长期大规模的跨国研究应考虑到这些因素。需运送至处理室的样本不能用于研究极其不稳定的生物标记物,或者在运输前处理,以保证运输途中的稳定。


 长期储存和复苏

依据样本将来的用途,决定短期还是长期储存。同时应确定生物样本是否就地保存、集中保存或是都有。这些取决于多种因素,比如:样本大小、自然增长率、采集和处理过程的复杂程度、物流、花销、质量问题以及生物样本库管理因素。如果样本适用于多种研究,推荐将样本副本放置在靠近中心实验室的地方,以便实践。若是计划储存样本超过一年,建议将样本储存在中央库房。同时推荐将副本放在不同电路供应的设备中,或是不同的地理位置,以抵抗设备故障或是自然灾害,还需要一个或多个备用冷藏设备(推荐设备是空的)以防设备故障。依据后续分析物的不同,可使用多种储存条件。长期储存的分析前变量列在表3。最需要关注的问题就是冻融次数,可能是冰冻样本在运输过程中无意间发生的或是冷藏设备故障,也可能是因为单管分装的样本反复使用,再放回冷藏设备中而引起的。


具备可追溯性、位置监管和生物样本管理的LIMS(实验室信息管理系统)改善了样本检索和数据的可靠性。生物样本是极其珍贵且难以替换的,如果样本完整性破坏,那就无法用于今后的研究。因此,检索样本最重要的就是只检索需要的,使得需要量降至最低。为防止所有库内生物样本彻底毁灭,推荐在其他地方放置样本副本。


血液

相比较新鲜样本,长期储存后分析物稳定性的研究,以及样本的复苏率,是决定长期储存影响的重要因素。长期储存后复苏率可能会上升或下降,因而在评估疾病与分析物相关性时,分别引起风险率增长或降低。血清在-80℃储存,可维持化学、激素和蛋白分析物稳定达13个月,但是根据分析物和储存时间与稳定的不同,化学、激素、酶、维生素和蛋白分析物的长期稳定性显示出差异。保存13至17年间的肝素、EDTA或是枸橼酸抗凝血样,储存于-80℃或液氮对于组学研究(代谢组学、蛋白组学、转录组学、表观基因组学)并无系统性的影响。同样,储存于-20℃和-80℃下2年的DBS,对代谢组学研究也并无影响。但是应避免长期室温储存和反复冻融。从使用生物稳定技术室温保存、或是低温(-20℃)、超低温(-80℃)保存的全血样本,或者-80℃保存9个月的白膜层中,可提取量足、纯度高、完整度较好的DNA。活细胞可在室温下稳定48小时,但必须是经培养的或是液氮中冻存的,以维持活力。将融化的EDTA抗凝全血或白膜层放入RNA保护剂中,可为芯片实验提供保质保量的RNA。用于miRNA研究的血浆或血清应该在去RNA酶冻存管中保存于-80℃,或立即提取miRNA。


尿液

除另外特殊后续研究,最好是将无添加剂的样本长期储存在低于-80℃的温度下。无任何保存添加剂的尿液,在-22℃条件下储存12至15年,其内多数临床化学分析物(包括肌酐)可维持较高的长期稳定性和检测有效性。针对蛋白组和代谢组的研究,室温保存下的尿液会导致蛋白逐渐降解。冻融循环对蛋白表达图谱影响极小,但仍需避免反复冻融。


唾液

预期后续研究决定储存流程。蛋白表达随着多样的储存温度、储存时长、冻结率变化而变化,但冻融次数影响极小。蛋白谱推荐储存温度为-80℃。直接4℃保存24小时后冻存,和将唾液样本分装后立即-80℃保存相比,两者在mRNA、C反应蛋白、皮质醇和细胞因子含量方面无差异。口腔基因自我采集试剂盒可在室温下储存8个月,提取的DNA数量和质量无减少。


提取的DNA

-80℃保存依旧是DNA储存最常见的方式,稀释、较高储存温度、多次混悬及反复冻融都导致DNA降解增多。现已有DNA室温保存的特殊技术,使得这些提取物运输便捷,这个方法将储存空间最小化,减少电力和运输花销,有助于无机械或冻存设备可用的情况(比如:船运或乡村地区),或是作为备用储存方案。使用该技术,室温下或是高温下(50℃或是70℃)的早衰实验中储存8个月,DNA并无降解。


RNA

影响分析物数量、质量或基因表达的分析前储存相关变量有:温度、储存时间、RNA浓度及反复冻融。现已有室温干燥保存RNA的技术,该技术与冻存RNA类似,可保存1年做后续分析,包括RT-PCR和RNA测序。


 总 则

可能的话,应该考虑预期实验的类型,但是并不是都能在计划或样本收集阶段预知实验方法,这就可能限制或影响分析结果。生物样本库操作流程的任何步骤都应详细记录,保证数据有效、可信、研究组间和组内可比较。应该循证制定分析前最佳实践和标准操作流程(SOPs),并组织预实验,这样可以找出关键步骤,在正式研究时节约时间、减少重复实验的花销。对于病例对照研究或多中心研究,分析前收集、处理、运输和储存应相似,如果可行的话,集中的、极少部分当地处理,以避免不可控的、无法检测的变量。SOPs偏差、区别和记录不当都会影响实验结果、结果解释、结论,并有可能导致诊断错误、治疗不当,甚至是危及患者安全。这种情况对于国际研究合作和样本交换是极为重要的。生物库内生物样本的分析前步骤越复杂,发生错误的风险就越大,那么就越需要自动化处理。研究越小,失败对于标准化的影响越大。


科学杂志上报道的关于生物样本分析前状况的信息参差不齐。分析前数据应与研究者生物样本处理流程一同记录,并在文章中列出作为质量指标,以评估、解释、比较、验证和复制实验结果。可利用针对生物样本的改良研究质量指南(BRISQ)。


已有研究尝试鉴定内源性敏感生物分子标记物,并找出对冻存样本进行质量评估的外源非侵入性质控技术。单个生物标记物不可能提供关于样本质量的所有信息,而非侵入性质控技术看似更可靠。


 花 销

建立、运作和维持生物样本库是比较昂贵的。分析前处理极大程度地影响经济,集中处理比非集中处理花费少,经过培训的员工能够节约样本收集时间和工资成本,分析前误差会导致花费增加、结果延迟,因为需要额外的花销收集替换样本。研究质量低下会引起假阳性,从而需要增加成本收集更多样本,但却使得研究把握度下降。生物样本运输费用也应纳入预算中,且这些费用随重量、距离、运输工具和当地条件不同而变化。另外,依据样本预计存储样本的年数,还应该预估运行和维持生物库的费用,并且与直接分析而不是储存样本所需花销相比较,但这样可能会随着时间推移,分析物丧失稳定性和可检测性。而且,新兴技术可利用较小量的样本做检测,应该在样本收集的过程中考虑到这个问题,因为样本量越少,花销越少,且参与率提高。室温保存也是一项新兴技术,可使储存空间最小化,并减少电力和运输开销。


 结 论

用于诊断或预后的个性化医疗中,生物样本的分析前处理是未来使用的基础。对于生物标记物探索和开发,分析前需求和文件与生物标记物临床表现评估的分析需求同等重要,特别是需要美国食品和药品监督管理局批准的时候。如果分析前步骤做不好,那么也没有必要检测生物样本了,因为其后续实验结果不合格。分析前决策应根据对后续分析的潜在影响而制定。分析前最佳实践和SOPs都应循证而定,且在研究开始前开展试点可行性分析。研究步骤应根据BRISQ或是其它最贱实践指南详细描述分析前流程。应充分考虑分析前变量,在研究中作为协变量一同分析,如:年龄和性别。比较或合并多个不同研究中的结果时,研究者应考虑分析前条件的差异。


本篇综述内列出的原则和证据,现被认为对生物样本建库和相关临床分析的成功极其重要。尽管如此,仍然需要鼓励生物样本库专职人员提出一些循证方法,以减少分析前变量的影响。同样重要的是,应该在文献中报道生物样本分析前变量的相关研究,并将结果纳入生物样本库最佳实践,特别是对不断增长的、以频繁生物样本和数据进行交流的全球合作意义重大。



摘自:Clinical Chemistry

编译:南京医科大学第一附属医院 田蕾

校审:上海万格生物科技有限公司 周学迅

转载:eBiobank