MORGAM/BiomarCaRE研究的普通 人群中重复测量的经高灵敏度检验的 肌钙蛋白I与心血管疾病之间的联系

高敏肌钙蛋白I（hs-cTnI）浓度反映心肌应激。hs-cTnI在预测普通人群心血管疾病（CVD）风险的长期变化的作用尚不明确。

我们在丹麦的一项前瞻性研究中对5年的hs-cTnI进行了3次测量并研究hs-cTnI是否会发生变化。该研究有3875名参与者，年龄介于30-60岁之间，51%的参与者为女性，研究基线为无病，与最近进行一次hs-cTnI测量的研究相比，我们的研究改进了CVD事件的10年预测能力。我们使用联合模型（纵向和存活）模拟变化过程，并与使用单一hs-cTnI测量的Cox模型进行比较，该模型经过传统CVD风险因素调整，并经过差异统计评估。

10年间，中值hs-cTnI浓度从2.6ng/L变为3.4ng/L。hs-cTnI的变化预测10年的CVD风险（581次事件）；联合模型在经过CVD风险因素调整后得出的hs-cTnI（95%CI 1.15-1.48）风险比为1.31/四分位差。但是，与结合CVD风险因素但无hs-cTnI（c-指数0.744）的模型相比，联合模型在预测CVD方面的性能（c指数测量0.0041，P=0.03）仅比使用单一hs-cTnI测量（c-指数测量0.0052，P=0.04）的性能略微升高。

普通人群5年区间内的hs-cTnI变化预测CVD风险的性能更佳，但是最近测量hs-cTnI的结果（10年）在预测CVD风险方面也有效果。这简化了hs-cTnI作为普通人群CVD一级预防预后标志物的使用过程。

心脏肌钙蛋白是紧急状态下心梗和坏死的标志物，但是还可以作为普通人群预测CVD、心衰和死亡风险的长期生物标志物。80%-90%的普通人群中，使用高敏试验（hs-cTnI）可以检测出心脏肌钙蛋白I，因此在全年龄段人群中，与传统风险因素相比，在预测致命和非致命CVD方面hs-cTnI能提供更有预测性的信息。由于肌钙蛋白浓度低于传统肌钙蛋白试验检测限，在预后方面具有重要意义，亟待了解普通人群中肌钙蛋白浓度的生物学分布、长期变化以及与其他风险因素之间的关系。纵向研究能达到上述目的并估计测量的肌钙蛋白浓度变化在预测疾病风险方面的预后价值。普通人群（中值年龄57岁）6年中肌钙蛋白（hs-cTnT）随着时间增加的决定因素包括年龄、性别（男）、高血压、糖尿病和肥胖。稳定的冠心病患者人去中1年内的肌钙蛋白变化与心梗风险的增加有关。健康老年人群（>65岁）中，3-5年的肌钙蛋白变化与心衰、心血管事件、全因死亡以及房颤风险的增加有关。但是，结合这些变化能小幅改进风险预测。健康普通人群（平均年龄56岁）6年内的肌钙蛋白的变化不能改进冠心病的预测但是能改进心衰的预测。目前没有研究对较长时间跨度内普通人群中肌钙蛋白变化的预后影响进行评估。

利用年龄为30-60岁的前瞻性人群，我们在10年间采集了hs-cTnI和其他风险因素各3次，在随后的16年中对发生的CVD事件进行了随访，据此我们确定：

（a）hs-cTnI的变化与CVD风险增加是否有关；

（b）通过模拟hs-cTnI的变化能否改进CVD的预测。

我们开发了预后模型将10年的hs-cTnI变化趋势与最近进行的单一hs-cTnI进行了比较。

10年间采集3轮数据并进行26年随访。已经给出参与者的数量；一些个体丢失并且一些个体发生了事件（用丢失和蓝色表示）。给出参与者的数量以及参与者中不合格参与者的数量以及丢失协变量数据的参与者的数量。第一轮等级的全部参与者都包括在多重填充模型中，见方法。预后模型：我们将单一进行hs-cTnI和风险因素（吸烟、BP、糖尿病、HDL和非HDL胆固醇、BMI）最后测量的预后模型与仅包含风险因素的模型进行比较。接着我们将hs-cTnI和风险因素（结合到联合模型）10年变化的模型与仅单一测量hs-cTnI和风险因素的模型进行比较。

研究设计

RCPH（健康和预防研究中心）的MONICA1人群代表丹麦哥本哈根的11个自治市。从自然人群注册者中随机挑选30、40、50和60岁的男性和女性。这些参与者在1982-1984年[第1轮（R1）]接受检查，接着在1987-1988年间接受复检[第2轮（R2）]，在1993-1994年间再次接受检查[第3轮（R3）]（图1）。参与者接受体检，问卷调查，每次检查时采集血样。使用标准的方法对吸烟状况、血压（BP）、体重指数（BMI）和血脂进行测量。糖尿病定义为自我报告医生诊断糖尿病，根据每轮研究注册时的糖尿病用药或糖尿病史判定。该研究得到了伦理委员会的批准，患者知晓并同意所有检查和病历随访。在注册时，报告先前存在心血管疾病（心梗或中风）。结局为第一次出现的主要心血管事件（包括第一次致命或非致命事件或可能的心梗、冠心病死亡或无归类死亡、不稳定型心绞痛、心血管重建以及很有可能的缺血性中风）。通过与国家死因注册机构和公立医院进行联系完成随访，截止到2009年12月，仅有40名参与（1.05%）者没有完成随访。根据MONICA标准确认注册诊断。

生物标志物测量和调整

从血液中分离血清并储存在4℃（1-3天）环境中运输到实验室，接着储存在-20℃的环境中随后储存温度低至-80℃。在MORGAM/BiomarCaRE实验室中测量生物标志物。通过ARCHITECT STAT高敏肌钙蛋白免疫分析（雅培诊断，ARCHITECT i2000SR）测定hs-cTnI浓度。检测限（LOD）为1.9ng/L，值低于估算值（见下文）。该试验在内的为5.2ng/L时支持10%的变异系数。该浓度的批内和批间CV为4.3%和6.3%。由于偏态分布，对hs-cTnI进行；立方根转化与先前的研究保持一致。

统计分析

丢失数据发生在第3轮，原因可能是参与者没有参与检查、风险因素信息不足或生物标志物检测的血清不足。但是，跟踪了这些参与者至关重要的状态。参与者的风险因素数丢失被最小化（<0.1%）。生物标志物数据丢失率介于0.15%至8.8%之间，R1的hs-cTnI数据丢失率为4.8%，R2为8.8%，R3为0.51%。通过捕获hs-cTnI和其他变量纵向轨迹的多重填充（MI）模型补足丢失数据。输入的值被应用到风险预测分析模型中。R1注册的个体包括在填充模型中。结合男性和女性的MI模型包括传统CVD风险因素和生物标志物以及随访开始和结束时的参与者状况。利用链接的方程建立20个输入的数据集。对除hs-cTnI外的所有变量预测平均值匹配，同时使用正常线性回归模型。丢失的值低于LOD的值时，从截尾正态分布中提取输入的值，否则要从正态分布中提取输入的值。时间—事件的信息包括在填充模型中。对R3测量了hs-cTnI和风险因素但可能在该轮前存在数据丢失并输入数据的参与者的受限数据集执行灵敏分析。

预测方法

预测模型见图1。我们开发了预后模型将10年间hs-cTnI的变化趋势和最近单一测量的hs-cTnI进行了比较。我们需要保持测量周期（10年的变化）与随访周期分离，因为预后模型不能使用“未来的测量”（即该案例的R2或R3）作为预测因素；因此新的基线被设置位于第10年，因为在这个时间点后就可以开始16年的随访。

建立考克斯（Cox）风险比例模型，该模型包括心血管风险因素如性别、收缩压（SBP）、HDL胆固醇、非HDL胆固醇（区分总体HDL胆固醇和HDL胆固醇）、糖尿病、吸烟状况和R3测量的BMI。R3测量是随访的基线，年龄作为分析的时间跨度。随访延长到最长16年。对这个模型而言，在R3增加hs-cTnI测量（模型2）。以ng/L的形式按照hs-cTnI浓度立方根乘以0.4报告风险比（HR），大致符合该人群的四分位数范围。

模型2与模型3-5比较，结合hs-cTnI历史和1-3轮测量的心血管风险因素。模型3与模型2类似但使用1-3轮hs-cTnI的变化而不是R3的hs-cTnI浓度作为预测因素。R3前发展的CVD排除在分析之外。

模型4包括重复测量的分析和出现心血管事件的时间。它是一个联合模型（JM），结合了1-3轮的重复测量和CVD风险。该模型有2部分，一个hs-cTnI纵向趋势多层模型和一个心血管事件比例风险存活模型。多层模型包括反映每个参与者hs-cTnI不同初值随机截距及其与其他协变量之间的关系，以及从基线开始的时间的随机斜率。第一次检查时的性别和年龄（测量年龄的横截面影响）以及从基线开始计算的时间（测量年龄的纵向影响）是该模型的固定影响。存活模型包括：性别、SBP、HDL胆固醇、非HDL胆固醇、糖尿病、吸烟状况和BMI，每轮更新。通过多层模型的估计将hs-cTnI包括在存活模型中。为全部随访数据调整该JM但是确认步骤涉及仅使用R3后随访数据的模型4（见下文）。

我们还利用和模型4相同的协变量、相同时间间隔和事件数量（模型5）将时间依存性协变量纳入Cox模型。所有存活模型利用年龄作为时间跨度。Cox模型排除R3前发展的CVD。JM不使用已经发展为CVD个体的可用信息。分析排除第一次检查出的CVD患病案例（2.18%，n=83）。

预测模型的调整和确认

使用c-指数和利用10年CVD可能性的净再分类指数（该指数由使用R3作为基线的模型衍生）评估模型1-5。利用10倍交叉确认调整风险评估，基于相同数据集评估模型的性能。利用Rv3.1.1对男女两个性别都进行分析。我们的研究符合TRIPOD（对个体预后或诊断的多变量预测模型的透明报告）报告预测模型的指南。

参与者的特点

每轮检查的参与者的特点见表1。从R1到R3，糖尿病患病率从2.2%上升到4.3%，吸烟率从46.7%下降到39.5%。BP治疗率从5.8%增加到12.5%。SBP从123.3mmHg增加到129.9mmHg。

hs-cTnI范围从R1的0-173.0ng/L到R3的0.3-164.6ng/L。3轮检查中值hs-cTnI浓度变化为2.6ng/L到3.6ng/L再到3.4ng/L，总的变化见图2。R1检查时，68.2%的患者的hs-cTnI高于LOD（>1.9ngL）（61.2%男性，38.2%女性）；R2检查时90.4%参与者的hs-cTnI高于LOD（50.8%男性，44.9%女性）；R3检查时84.9%的参与者的hs-cTnI高于LOD（55.1%男性，44.9%女性）。R1到R3 95%的hs-cTnI变化相对较小，介于-3.5-6.48之间。男性观测到较高的hs-cTnI浓度，但是随着时间的推移男女这两个性别的hs-cTnI都会升高。随着时间的推移从R1到R2整个人群hs-cTnI值升高，导致CVD案例增加，从R2到R3达到一个较高的平台期。

R1到R3 hs-cTnI的斯皮尔曼相关系数为0.59-0.69（R1到R2，P=0.60，R2到R3，P=0.69，R1到R3，P=0.59）。尽管低于3轮观测到的SBP相关性（R1到R2，P=0.76，R2到R3 P=0.75，R1到R3 P=0.67）或HDL的相关性（范围0.75-0.81）但是接近。3轮检查BMI的相关性较高（范围0.85-0.91）。

hs-cTnI浓度变化历史和CVD之间的关系

R3后的随访期间内（1993-1994，中值随访期16.6年），444名参与者罹患CVD。对心血管风险因素（表2模型2）进行调整后，按照hs-cTnI立方根的千分位差，R3的hs-cTnI（95%CI 1.08-1.30；P<0.001）是CVD风险强大的预测因素（HR1.18）。10年间的hs-cTnI变化（R3-R1差异）对风险因素进行调整后与CVD呈正相关（HR1.16；95%CI1.02-1.31；P=0.023）（表2模型3）。

每条线表示参与者的10年3轮检查hs-cTnI值的变化。趋势（蓝线）显示男性和女性的hs-cTnI随着年龄增加儿增加。线条明显地显示出颜色较深的区域存在更多的点。蓝线表示数据最适合的平滑的线。

hs-cTnI浓度纵向趋势与CVD之间的关系

R1后的随访期内（中值随访期27.5年），观测到581个CVD案例。调整过风险因素后，JM中hs-cTnI与CVD呈正相关，按照立方根的千分位差HR为1.31（95%CI 1.15-1.48）；P<0.001（表2模型3和表3）。具有时间依存性协变量的Cox模型生成的HR是1.22（95%CI 1.12-1.32）P<0.001（表2模型5）。这2个模型说明了每轮心血管风险因素的hs-cTnI的变化水平。

根据JM的纵向部分，再R1这个时间点时，hs-cTnI随着年龄增加，从基线时间（系数0.016，95%CI 0.014-0.017，P<0.001）算起增加0.007个（95%CI 0.006-0.008，P<0.001）立方单位。男性hs-cTnI高于女性0.226个立方单位（CI0.205-0.247，P<0.001）（表3）。

肌钙蛋白的预测模型

利用Cox模型基于444个CVD事件估计10年CVD风险的可能性。具有心血管风险因素的模型1的c指数为0.744（95%CI0.717-0.772）。在这个模型中增加R3最近一次测量hs-cTnI的值，能有限地改善预测（c指数0.750，改进0.0052 P=0.043）（表4）。用10年hs-cTnI变化提花最近hs-cTnI测量的模型3不能改进单一hs-cTnI测量的预测（模型2）。结合hs-cTnI和CVD风险纵向趋势的JM，模型4改进了预测，但与模型2相比改进幅度微乎其微。模型4的c指数为0.754（95%CI0.726-0.782），与模型2相比改进0.004（P=0.03）。与模型2相比，模型4的连续NRI测量为0.23（P<0.001）。

灵敏度分析

调整过风险因素后，JM中hs-cTnI与CVD呈正相关，基于hs-cTnI立方根的千分位差，HR为1.30（95%CI 1.15-1.47）。在R3将hs-cTnI测量增加到心血管风险因素（模型2）后，基于304个CVD案例（c指数改进0.004，P=0.089）与模型1比较时（c指数0.755）不能改进预测。结合hs-cTnI变化的模型没有一个能改进预测（与利用R3单一测量hs-cTnI的模型相比）。

与单一测量hs-cTnI相比，监测普通人群的肌钙蛋白随时间变化能否改进未来CVD事件的预测，我们对此提出了疑问。我们侧重于10年的CVD风险，这是CVD风险评分一个既定的度量标准。我们能在现实中比较单一测量和纵向测量的性能。我们在纵向人群中进行了测量，并明确该规定了测量的间隔（10年hs-cTnI的变化）和用于预测的随访期（16年），作为预后模型，不能使用“未来”的测量作为预测因素。因此位于第10年的时间点作为新的“基线”，该时间点成为预测的起始点。与比较研究相比，我们的研究的测量间隔较长，事件数量也较多；我们使用联合模型更加灵敏地监测hs-cTnI的变化（模型4）。我们发现普通人群的hs-cTnI水平随着时间的推移而上升并与致命和非致命CVD事件有关。我们的发现适用于较大的时间跨度，包括年轻人群，因此先前得出的hs-cTnI或hs-cTnT变化与心衰、心血管死亡和全因死亡风险增加的关系显然针对老年人群（>65岁）和罹患冠心病的中年人群。我们发现3轮测量hs-cTnI可以更好地预测CVD风险并改进预测性能。但是对普通人群进行风险预测时，取得的效果不大，且在预测长期CVD风险方面，与最近的单一hs-cTnI测量相比，也没有显著的实际进步。

这一关联显示hs-cTnI的变化显著与心血管疾病有联系，确认了之前与心血管死亡和冠心病之间关系的报告。这些研究没有对肌钙蛋白进行分类，因此降低了精确度和预测能力，而我们对肌钙蛋白进行的是连续测量。与n=1797或n=3448份样品相比我们对研究的n=3178份样品有更加显著而紧密的置信区间。不仅如此，连续hs-cTnI的HR不直接与类别变量的HR比较。这一关联显示在增加其他更新的风险因素后，hs-cTnI的变化结合JM具有显著的独立效果，强调了其他风险因素的独立的预后价值。与SBP预测CVD相比，我们量化了hs-cTnI变化的影响。SBP的变化的预测效果CVD是hs-cTnI变化的2倍，这个结果丝毫不令人吃惊，因为SBP本身就是CVD关键的可修正风险因素；但是hs-cTnI让一些现有的风险因素如HDL胆固醇和BMI的效果黯然失色。hs-cTnI和hs-cTnI的变化为鉴别处于较高CVD事件风险的个体提供了可能性但是目前的风险因素却做不到这一点。

我们的统计方法在通过监测hs-cTnI变化检测风险预测的显著改进方面足够灵敏。评估纵向hs-cTnI趋势时，JM灵敏度可能是包括CVD结局的结果，可以避免淡化hs-cTnI和CVD之间的关系，但是Cox时间依存性模型似乎低估了hs-cTnI的真实风险。但是中值hs-cTnI浓度在10年间相对较低，从2.6ng/L变化为3.4ng/L，处于可预测的趋势中。尽管大部分患者的浓度低于心梗诊断的临界值，但是浓度的变化很频繁。3轮测量的hs-cTnI浓度彼此相互关联并与其它心血管风险因素如SBP类似，但是关联性低于BMI，随着时间推移显示出较强的可追溯性。可检测的hs-cTnI浓度从R1的68%上升到R3的84.9%，这与其他普通人群和其他先前的纵向研究的水平一致。hs-cTnI浓度水平随着年龄增长，似乎最近一次的hs-cTnI测量足以优化预测，因为这代表着hs-cTnI与老年人群的关联变得具有足够的预后价值。其他研究发现预测结合hs-cTnI/ hs-cTnT的变化取得的效果微乎其微，但是已经擦去了不同的统计方法排除直接比较。McEvoy等人比较了具有CVD风险因素以及2次测量TNT δ变化的模型，2次测量间隔6年，人数3448，622个CHD事件。他们发现增加hs-cTnT变化在鉴别方面没有改进效果（c指数差0.0004，P值0.1）。这与我们调整过的模型一致，该模型包括hs-cTnI的δ变化（表4，c指数差-0.003，P值0.11），尽管模型不直接与给定的肌钙蛋白测量和统计方法比较。但是，他们没有发现结合TNT的变化能改善心衰和全因死亡率。在老年人群中收到的效果也微乎其微。deFilippi等人在Cox模型中将2年内hsTNT的相对变化作为协变量，略微改进了心衰和心血管死亡的分类[IDI（综合鉴别改进）]，但是不能改进大约8年随访的老年人群的c指数。Eggers等人将5年的hs-cTnI相对变化作为具有4年随访的Cox回归的时间依存性协变量，发现不能改进老年人群（>65岁）的心血管死亡的鉴别（n=32个事件）。在该人群中使用类似的方法，hs-cTnI的变化与心血管事件（n=163）的关系并不密切，效果不及GDF15（生长分化因子15）或NT-proBNP（N端脑钠肽前体）。hs-cTnI的变化与极限hs-cTnI比较或非正式地与单一最近测量hs-cTnI相比较。通过比较我们明确检验了与单一hs-cTnI测量相比，肌钙蛋白的变化是否能增加10年风险模型的预后信息，并且已经形成在其他人群中进行检验的框架。

丢失数据对纵向研究而言产生了局限性，因此难以区分数据是随机或非随机丢失，MI最大限度地包括可预测模型的相关信息。研究中丢失数据的参与者遗漏的信息能弱化相关性并引起偏移。因此我们将灵敏度分析的数据集限制在R3时可用的数据集。我们不能排除样品退化影响生物标志物测量进而高估hs-cTnI变化的可能性。但是先前的研究已经发现hs-cTnI评估长期储存能保持稳定，如果样品以相同的比率恶化，则不应该影响模型中hs-cTnI的预测值，即使影响了绝对浓度。26年间，药物使用的变化可能影响hs-cTnI的预测价值，但是关于这种影响存在的数据非常少。

总之，尽管hs-cTnI的变化改进了预测，但是它不能实际改进最近的单一hs-cTnI测量。最近的单一hs-cTnI测量足以预测10年的CVD风险，简化了hs-cTnI作为初级CVD预防主要稳定标志物的使用过程，认可了大型普通人群CVD10年风险hs-cTnI模型的预测效果。但是，其他的因素如运动量、高血糖和肾功能会影响hs-cTnI的变化。需要进一步的工作检验hs-cTnI监测较高风险患者的风险变化以及有助于靶向疗法选择方面的潜力。