免疫组织化学检测设计控制过程 及标本要求

IHC检测包括：分析物，即靶分子（抗原），生物标志物，被测量；待检测的标本，即检测系统的基质（组织或细胞）；在检验前（分析前）标本采集；试剂或过程的前处理；手工或自动染色系统；试剂，即前处理试剂、一抗、阴性对照试剂、检测试剂、底物；用于检测系统确认的校准品；验证每个终端实验室整个检测系统的质控品；观察组织切片IHC反应后的评分算法；IHC的临床应用，即提供数据以支持临床预期人群特标标本的医疗决策。

研究者、实验室试验开发人员或制造商可以发现并开发免疫组织化学分析过程，商品化制造商通常开发用于大规模检测的IHC检测，虽然文献中已有IHC检测从发现到完成测试的支持性数据，但仍需进一步的研究建立分析正确度，研究的内容包括抗原的鉴定和分离、抗原的量化、蛋白质化学技术以及抗原转染细胞系的基因识别技术。动物抗体的诱导包括免疫动物、生产单克隆或多克隆抗体，并考虑哪种抗体能与常规固定、加工的组织标本上的抗原发生反应。

IHC的预期用途涉及研究者、试验开发者、制造商、病理学家、临床医生及提供标本的患者，决定了检测的性能规范特征，这一点适用于所有项目的IHC检测。IHC检测应用功能免疫学和形态学，包括肿瘤细胞谱系的鉴定；受体活性或通路活化；导致疾病或治疗的生物学过程或通路的基因蛋白产物；疾病自然史或常规治疗的预后标记；以及治疗选择和监测的预测性标记。生物标志物的量化及性能特征的鉴定包括特异性、敏感性、重复性及稳定性。

IHC检测的开发者可以是基础研究员、实验室项目的开发者或商品化试剂的制造商。所有开发者应收集客观理论依据以确保设计实施的每一阶段（如用免疫印迹法检测特定抗原抗体的免疫反应性）满足规范。实验室可以用其他技术评估抗原抗体的交叉反应性、亲和性、亲合力以及组织固定的最佳类型。根据预期用途检测阴性、阳性肿瘤验证灵敏度和特异性。所有开发者须应用临床患者标本确认IHC检测的每一步骤，并记录满足预期用途的客观检测结果。IHC检测设计控制过程的确认是确定鉴定靶抗原的方法，及分析和临床性能特征是否满足IHC检测预期用途的重要过程。

对于分析和临床性能的确认而言，通过独立比较检测的临床结果确定具有一定频率的预期阳性、阴性结果，从而应用终产品检测一系列患者标本。对于确认过程而言，可在检测环境中应用和产品设计类型相符的IHC检测。IHC检测确认的过程分为检验前、检验中和检验后：

（1）检验前（分析前）：选择分析类型和标本类型，标本收集、保存、固定、处理、加工、包埋、切片、载玻片制备、抗原检测；

（2）检验中（分析中）：显微镜观察；

（3）检验后（分析后）：通过手工或自动显微镜观察已制备好的IHC载玻片，报告结果，研究并根据解释和建议作出临床决策。

为确保检测系统的质量，研究者、终端实验室及制造商必须有客观的检测程序。根据预定义的质量标准将每个新批次的试剂与参考批次进行比较，确保性能一致。多克隆抗体的基本定义是由单一动物产生所有的抗体，而单克隆抗体的定义应包括抗体的加工和制备。终端用户应检查收到的每样试剂，由于试剂可能受不同条件的影响（包括运输和储存条件），即使试剂来自相同批次，也不可能全部货次的试剂均满足规范。在美国和其他国家，商品化的IHC试剂盒是由制造商提供的说明书、前处理试剂、一抗、检测试剂以及阴阳性质控材料组成。当终端实验室的病理学家想评估将新IHC试剂盒引入到其实验室的可行性时，可根据制造商的使用说明进行测定。该测定过程的目标是确定IHC检测的临床效用。

从研究人员到终端实验室病理学家，每个执行IHC检测的实验室必须执行质量控制和质量保证过程，以保证IHC检测的性能规范。除此之外，还须研究IHC检测的临床效用，研究过程可能涉及研究者、开发者、制造商对IHC检测的验证及终端用户的相关性研究[2]。在设备最开始使用时应规范其临床效用，发现新的应用程序。在不改变检测性能的情况下，不需要对分析进行额外的验证或确证研究；如果检测性能发生改变，则该分析须被视为新的检测项目进行验证和确证研究。表1显示的是生物标志物从研究到建立临床病理学数据的层及要求，以支持临床结果预后的预期用途和治疗结果的预测（该方案修改自NIH-NCI早期检测研究网络框架，并经Hewitt等人修改。[3]也适用于其他生理和病理生理检测的建立）。

组织获取、固定和加工过程可能缺乏科学性，甚至有时是经验性的。由于新的免疫组化检测的开发作为预测性指标以指导患者治疗，检验前（分析前）的影响因素变得尤为重要。终端用户应了解目前指南的局限性，并根据本研究和建议更新当前的做法。

3.1标本采集

IHC使用最广泛的标本是手术病理标本，标本的采集通常涉及医疗系统不同领域的不同人员。为确保用于患者诊断和管理结果的准确性及可重复性，规划和协调变得尤为重要。临床医生，通常是外科医生，在获取活检标本或细胞学标本前应向病理学家咨询标本选择、处理、运送、固定和加工的要求。临床医生对标本的选择直接影响用于诊断的组织质量，通常，除常规苏木精、伊红和过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）染色所致之外，标本处理程序的偏差会导致标本完整性的丧失。所有的病理学实验室应有关于标本从临床医生到实验室的运送和处理标准化操作规程，其中还应包括患者保密性问题、生物危害问题、标本正确识别方法、医生指令以及可接受的标本和处理程序，标准化操作规程必须分发给提供标本的实验室。

活检或手术切除整个肿瘤组织以及与之相连的正常组织，当肿瘤太大而不能完全切除或处于不能切除的位置时，可能需要采集多个标本以保证肿瘤的代表性。当肿瘤是异质性的时，也需采集多个标本表征肿瘤的级别和异型。根据IHC的靶抗原，处于肿瘤标本边缘的正常组织可能包含作为整个IHC处理过程内部质量控制的组织，例如肿瘤内的正常血管和基质可能作为部分抗原的内部质量控制组织。近几年来，图像指针和穿刺活检正逐渐取代切除活检，因为这些技术对患者的伤害性小，可以作为门诊手术之一，且规模小的标本能缩短检测结果的周转时间。多针穿刺活检可以检测肿瘤的异质性，穿刺活检允许固定剂快速地渗透组织，并最大限度地减小手术切除、标本收集、固定延迟和加工过程造成的伪像。然而，用福尔马林固定组织的过程要求足够的反应时间，并减小组织碎片的大小。

3.2 标本处理

无论是实验室的开发人员还是商品化IHC检测的制造商，都应该为病理学家建立书面协议以指导临床人员处理IHC标本。标本在手术室采集后应尽快送到病理实验室，以便及时检查、解剖和固定。固定延迟会导致不正确的免疫组织化学染色结果，雌激素受体的分析中发现固定延迟会造成免疫反应性降低，蛋白水解（由固定延迟造成）可能导致背景染色的增加[9]。出于上述原因，在手术切除组织后，应尽快固定，理想的情况是在切除后几分钟内固定。如果标本运输的延迟不可避免，则应在固定前将标本冻存，但冻存标本不能作为即时标本的替代品。一旦组织被切下，血液停止流动，就会发生显著的生化改变。最初的变化发生在几分钟内，包括三磷酸腺苷和细胞膜上钠、钾、钙梯度的破坏。

避免固定延迟的措施包括分析标本运送过程中的缺陷、加大对员工的培训、强调缩短运送时间和及时固定的重要性。标本处理方案应包括：

（1）在实验室应用和实验室人员执行前须遵循标本处理程序；

（2）通过所有的处理和分析步骤鉴定标本，表明原始标本的储存条件，如储存温度和储存时间；

（3）在某些情况下，已发表的文献可能足以证明检测的具体要求，然而临床实验室应保证已发表文献中的信息可用于检测；

（4）对组织和IHC试剂保质期稳定性的确定进行实时验证研究。

外科医生处理标本的方法是不将肿瘤标本放入手术套件中，否则会损害手术切除的边缘。外科医生将组织标本给助手，由病理工作人员及时评估组织标本，并选择有代表性的标本进行显微镜和组织病理学诊断。如果外科医生需要在术中进行病理咨询，咨询的情况一般是确定诊断（良性或恶性肿瘤、分类指导手术）、疾病的传播、手术切除的边缘以及是否存在淋巴结的转移。外科医生或助手应立即联系病理实验室。手术室和病理室最好在术前进行沟通，以保证用于诊断的组织处于最佳状态。外科医生的助手将标本放置在干净、干燥的容器内以便及时地运送实验室，组织可暂时地浸没在生理盐水、Ringer溶液或其他溶液中。一些“生理”盐水并不是生理性的，正常生理盐水的PH值是5.5（范围为4.5到7.0），并可能导致细胞形态的改变。所有的标本容器和载玻片上都应贴上标签，对于所有检测的标本而言，应正确识别获取标本的患者、标本类型和标本采集时间。处理标本时须遵循生物危害预防措施[10]。

病理学家切片后立即染色并观察切片。病理实验室的目标是在接收组织的20分钟内进行诊断，随后将冷冻组织去冻、固定并加工。病理实验室的工作人员处理冷冻切片，保留具有诊断代表性的切片用于常规组织病理学诊断，如果残留组织不能与常规固定和/或加工的组织一起使用，那么残留组织可以以冷冻形式保存，并用冷冻组织试剂进行免疫细胞化学染色。

实验室应考虑是否保留一些组织标本进行辅助检测，活检标本通常作为细胞病理学标本进行处理。如果建立了该类标本的检测程序，便可用免疫组织化学染色进行检测，用核酸检测法进行基因扩增或重排可以是非破坏性的（如荧光原位杂交）或是破坏性的（如核酸印迹原位杂交）。

细胞学标本获取的条件多种多样，可以由临床医生或直接由病理学家获取。通常在术中获取细胞学标本，但是现在越来越多地通过内窥镜和/或放射性引导装置获取细胞学标本，一般而言，细胞学标本的处理和组织标本的处理方法一样，细胞学标本的独特性在于使用替代性的固定剂，如醇类和丙酮类，以及通过涂片或细胞离心法制备标本。应用血浆/凝血酶或琼脂糖处理标本，包括固定和组织处理在内的检验前变异会影响IHC检测，当检验前变异发生改变时必须进行重新验证和/或确证研究。

3.3 标本固定

3.3.1 固定的参数与时间

标本的固定显著影响免疫组织化学分析的结果，固定前须了解固定的标准条件（即固定的组织类型及固定的时间）。甲醛是一种小分子物质并能快速地渗透组织，然而用甲醛固定组织是一个即时反应，因为甲醛和亚甲基二醇在溶液中呈动态平衡。甲醇在溶液中实际上是以亚甲基二醇的形式存在，无法直接固定组织，只有甲醛才能引起蛋白质的交联并固定组织。溶液中的甲醛被消耗，亚甲基二醇脱水生成甲醛，建立化学平衡，当产生新的甲醛时，又与组织蛋白反应，进一步固定组织。即时反应的时效性要求福尔马林固定剂须作用足够长的时间，10%的中性缓冲福尔马林（Neutral Buffered Formalin，NBF）是手术病理中最常见的固定剂，还广泛用于IVDs中的许多IHC分析。磷酸缓冲液是目前标准的缓冲液，可以选用其他缓冲液替代磷酸缓冲液，但会被认为是检验前（分析前）的影响因素之一。用于固定和加工的组织厚度应小于等于2mm[11]，组织的直径略比加工盒小，允许组织在其中自由移动，乳腺、前列腺和脑组织标本的直径通常为几厘米，但厚度还是2mm。

实验室应将标本放置在至少10体积的固定剂中以充分固定，相对于过度固定而言，固定不足对后续步骤的影响更大。组织标本的大小影响固定时间，一般固定时间为16到32小时，实验室人员可灵活控制固定时间。如果在32小时内不能处理组织，应从福尔马林中取出组织并放置在70%的乙醇中。常规石蜡包埋组织是另一种固定形式，如果初始固定剂和组织加工器上的固定剂不同，则有必要了解并比较其中差异的潜在影响。评估组织的总固定时间时，须考虑固定的初始时间和在组织加工器上的额外时间，监测固定的条件可以使由固定造成的假阳性或假阴性结果降到最低。

3.3.2固定剂的种类

固定剂的选择影响预处理的需求、所需抗体滴度、染色背景和强度，一些固定剂可能与部分抗体/抗原不相容，此外，固定不足或过度固定均会干扰免疫反应性。对照组组织样品的固定与处理方法和患者标本一样。对于所有类型的固定剂而言，IHC的总检测系统必须根据固定剂类型、固定剂作用的时间及处理方法进行验证。表2显示的是各种类型固定剂的比较。

福尔马林是组织病理学中应用最广泛的固定剂，市售福尔马林溶液的浓度为37%到40%，使用时将其和水或缓冲液以1:9的比例稀释成10%的尔马林溶液（甲醛4%），常规固定在10%NBF中进行。10%的NBF被认为是固定剂的行业标准，是制造商开发和验证IHC分析的常用固定剂。目前最常用的缓冲液是磷酸盐缓冲液，商品化的磷酸盐缓冲液可能导致组织学差异，这种差异最常见于淋巴组织。通过研究RNA稳定性和IHC分析的未发表数据，发现使用磷酸盐缓冲液效果更佳，但目前尚未研究磷酸盐缓冲液制备差异造成的影响。尽管福尔马林能快速地渗透组织，但实际上固定得非常慢，用福尔马林固定要求标本与固定剂的比例为1:10，且固定时间应超过8小时，完全固定需要24到48个小时。使用长期保存的福尔马林会影响免疫组织化学染色的结果，可以将标本在福尔马林中浸泡一段时间后转移至70%的乙醇中。应标准化总固定时间并记录。近期有研究表明，只要组织固定充分（约16到32个小时，固定时间取决于标本大小），则不必考虑标本固定的精确时间。

锌福尔马林可以作为NBF的替代固定剂[12]。一项研究表明锌福尔马林是血液标本固定剂B-5的首选替代固定剂，因其避免了含汞基固定剂造成的环境问题，且固定时间短，商品化的锌福尔马林充分固定时间为4到6个小时。当用荧光显微镜观察组织时发现锌福尔马林会猝灭原发性荧光。锌福尔马林不能代替中性缓冲福尔马林，如果固定剂发生变化必须重新验证。

70%或95%的乙醇（EtOH）可固定组织，乙醇可以使组织收缩和硬化。目前尚不清楚乙醇固定组织的质量，NBF或锌福尔马林固定不充分的组织可用乙醇继续固定，在这种情况下，组织的外部由福尔马林固定，中心部分由乙醇固定，导致组织切片的染色呈渐变状。乙醇是动物病理学中广泛应用的固定剂，由于乙醇不是交联固定剂，因此不需要抗原修复。低温冷冻切片在室温下用冷丙酮或90%EtOH或10%的丙酮混合物便可充分固定。不可用乙醇和丙酮代替中性缓冲福尔马林，这些固定剂的生物分子不交联，常用于细胞学中。将乙醇或丙酮作为固定剂的IHC分析应单独验证以保证分析性能。

应用Bouin's、B-5、戊二醛和多聚甲醛类的固定剂可能得到不同的结果，且仅限于部分系统。其他混合固定剂也能得到令人满意的结果，如甲醇/聚乙二醇（PEG）和甲醛/戊二醛。目前有多种替代福尔马林的商品化固定剂，但是都未被广泛应用，选择与福尔马林相似的替代固定剂时应仔细查阅相关文献及供应商资料验证特定项目，否则不能将替代固定剂纳入到总检测系统性能规范的验证中[13]。与福尔马林固定的组织材料不同，用Bouin's、B-5、戊二醛和多聚甲醛固定的材料需要其他染色程序，如果实验室选用上述其中一种固定剂，应验证其染色程序。

应用微波可大大减少组织处理和染色的时间，在用微波固定时须注意安全，经批准的实验室微波炉才可用于实验室检测。将组织在室温下浸入常规固定剂（如福尔马林、乙醇-聚乙二醇（EtOH-PEG）、甲醇-聚乙二醇（MetOH-PEG））一段时间，使整个组织固定完全、染色充分，随后将其暴露在微波中。组织标本厚度不超过5mm，微波处理时间不超过5min。应测定不同时间和功率水平上的微波炉温度，一般而言，微波炉内的温度不应超过60℃，温度控制对于获得一致的免疫细胞化学染色结果是至关重要的。

3.4 固定后处理

3.4.1 脱钙

无论用的是酸还是螯合剂（EDTA或EGTA），脱钙可能会降低后续免疫细胞化学测定的可靠性。甲酸优于盐酸且易于使用，是最常用的脱钙剂。抗原热修复程序不能恢复抗原的可检测性，当无法检测抗原时，可以检测可能保留下来的中间纤维，如角蛋白。实验室应确定组织脱钙的最短时间，并对脱钙组织的免疫组织化学染色结果进行解释。脱钙剂对IHC分析的影响目前尚不清楚，报告脱钙组织的免疫组织化学结果时应报告采用的染色方法和脱钙方法。

3.4.2 脱水和清洗

组织处理过程包括三个阶段：脱水、清洗和石蜡包埋。脱水所用的试剂是浓度递增的乙醇，清洗用的是二甲苯，最终由石蜡浸没组织块进行包埋。目前有多种可用于组织处理的仪器和方案，通常应用热和真空处理组织，但这并不是通用的方法。组织处理标准化操作的缺乏导致组织处理存在差异，须由IHC或其他分析进行进一步评估，然而目前尚不存在解决这一问题的科学依据和数据。必须根据处理组织的体积及时更改试剂，试剂残留会稀释组织处理器上后续所用的试剂，导致组织处理不完全。

脱水是除去组织和细胞内水分的过程，清洗是除去组织内脱水试剂的过程。在石蜡包埋前组织必须充分脱水和清洗，组织若含水，石蜡就不能充分渗透组织；组织若脱水不充分则造成清洗不当，最终使得组织呈柔软的“糊状”。脱水剂可以是多种形式的醇类，丙酮也可用作脱水剂，但会造成组织过度收缩，且具有可燃性和挥发性，不建议使用。标准的脱水过程是用浓度增加的脱水剂进行组织脱水，如70%乙醇→85%乙醇→两次95%乙醇→无水乙醇，每次脱水15min，最多不超过3小时，脱水时间取决于组织的类型和大小。临床实验室应验证组织处理方案是否能产生预期的结果，尤其当采用的方案是非标准方案时。浸泡在脱水剂和石蜡中的时间不足会导致染色效果不佳。目前存在一种新的组织处理方法是用微波照射缩短组织处理的时间，但还未广泛应用于临床实验室。已证明可以使用超声波辅助加工组织，但商品化的仪器还不可使用超声波。

清洗所用的试剂是苯衍生物溶剂，清除组织内的醇类，由于二甲苯会使组织硬化并增加背景染色，因此组织不能长时间浸泡在清洗剂中。通常将组织依次浸泡在两种清洗试剂中，每种浸泡15-60min，浸泡时间取决于组织类型、大小，脱水程度。关于二甲苯处理和注意事项的内容参见CLSI文件GP15。目前存在越来越多的清洗替代剂，但是其对IHC分析的影响尚未进行系统性的审查。病理学家应进行一项比较性研究以确定二甲苯替代剂的标本适用性。

3.4.3 石蜡包埋

由于组织抗原过度加热会失活，因此最好使用较低熔点的石蜡（如55-58℃），并尽可能缩短组织在热的石蜡中浸泡的时间，通常将组织在石蜡中浸泡两到三次，每次15-90分钟，包埋时间因组织而异，每日监测并记录包埋石蜡的温度。包埋时放置在模具中的组织是平的，并与对角线而非模具边缘平行，组织的放置方向取决于处理组织的类型。

3.5 切片

用可重复使用的钢片或一次性刀片进行石蜡切片，当进行石蜡切片的步骤为：

（1）刀角（从刀的中心线到刀面）设置为30°，如果切片困难，及时调整刀角。角度大于30°可能会刮伤切片，角度小于30°会压缩切片；

（2）检查切片机的工作条件，每天用溶剂彻底清洁切片机，去除多余的残留石蜡。根据制造商的建议对切片机进行预防性维护和清洁，不使用时用罩子罩起来；

（3）将切片厚度设置为6μm或更小，最佳组织切片厚度取决于处理组织类型；

（4）切片时松开驱动轮推进组织以接近刀刃，根据石蜡的类型使用快速冷冻剂将包埋的组织调整到所需温度；

（5）粗切组织获得所需的切割平面，并清除刀片上的碎片；

（6）用冷却剂和冷冻剂将组织块调整到所需温度；

（7）均匀、平稳地转动驱动轮，得到一条切片带。用镊子轻轻捏住切片带，放置在预先备好的使石蜡带漂浮的水上，将其水浴。水浴的温度通常比所用石蜡的温度低5-10℃，水浴温度过高会影响最终染色结果；

（8）用镊子轻轻拉伸水浴中的切片带，快速轻轻地挑破有褶皱的切片；

（9）将一干净、室温下的载玻片以45°浸入水浴盒中，并轻轻放在石蜡切片带下，小心地将切片捞起，注意不要有气泡，气泡会影响之后的免疫组化染色结果。水浴盒表面不应有漂浮着的石蜡或其他异物，若有，则用无绒纸巾去除；

（10）在脱蜡前彻底干燥切片，在50-60℃的干燥箱中至少干燥60分钟。或者在室温下放置24小时。

冷冻切片首先须制备冷冻组织，目前存在多种方法制备冷冻的组织块（如用液氮、干冰、低温恒温器中的冷异戊烷等）。建议用快速冷冻法进行冷冻，慢速冷冻（如用低温恒温器）会使组织内形成冰晶并在随后的染色中形成伪像，还会造成部分抗原丢失。冷冻的速度与氢氯氟烃制冷剂相关，难以控制。组织块可以用市售模具或自制的2-3cm铝箔模具制备。为避免液氮溢出或飞溅，操作时应穿上保护性工作服，戴上保护性装备（如护目镜和厚手套）。用液氮制备冷冻组织切片时，须在适当大小烧瓶放置少量切片以供日常使用，使用后安全丢弃，不可放回储存容器中。

冷冻组织块的制备步骤为：

（1）在模具中放置一层市售的具有免疫惰性的包埋介质，即OCT，用长的镊子或钳子将模具放入冷冻介质中。包埋介质须在15-20s内冷冻，操作时使用塑料钳子和绝缘手套。放置另一层包埋介质，确保组织凝固缓慢，放置多层包埋介质使得切割时有足够的空隙，将固体介质固定在底部，顶部为液体从而实现分层。用其他包埋介质保护组织暴露的边缘，以避免组织在长期保存中冷冻；

（2）用细镊子捏取边缘组织，吸干组织中多余的水分。将组织放置在液体包埋介质的中心（组织放置的方向取决于组织类型），用包埋介质覆盖，并将组织缓慢地浸入冷冻介质快速冷冻；

（3）立刻将组织块放入冷冻室、低温恒温器或干冰中。正确冷冻的组织可以永久保存。用户须验证新鲜或储存组织的免疫反应性是否令人满意；

（4）将组织制备成约5mm3大小的组织块。冷冻组织的切片大小为4-6μm，切片后立即在冷丙酮中固定5-10min，并放置在冷藏室的载玻片盒中，若不立即使用，可放入冷冻室中保存。切片厚度设置为4-6μm，并调整低温恒温器的温度（-10°--20°，取决于组织类型）。

细胞标本，无论采自刮取材料、涂片、体腔液，还是通过针管吸取，都是用于免疫细胞化学评价很好的材料。由于酶的预处理及“抗原修复”技术在处理过程中会造成标本“洗脱”，建议用干净的载玻片预处理容易洗脱的组织。从体腔液中获取的细胞块通常固定在福尔马林中，而大多数细胞学标本固定在乙醇中。病理学家必须牢记不同固定剂所致的免疫细胞化学染色模式的差异。从体腔液中获取的细胞块的染色方法与甲醛固定石蜡包埋组织相同。细胞学标本的染色方法应与IHC的不同，例如，对于手术病理标本而言，细胞标本的染色时间更短。建议每个实验室单独验证细胞学标本，并用患者标本进行细胞学标本检测的质量控制。在拿去盖玻片后，通常用PAP染色法进行免疫细胞化学染色。

在组织处理过程中可能遇到的问题包括：

（1）部分固定（固定时间＜24小时），使免疫反应呈异质性，部分区域丧失反应性；

（2）凝固剂和交联固定剂之间的不均匀固定，导致整个组织出现可检测的异质性；

（3）过度固定（固定时间＞72小时），使得免疫反应性部分或完全缺失；

（4）固定不足（固定时间＜6小时），使得免疫反应性部分或完全缺失；

（5）在固定或处理过程中温度过高，产生“煮熟”样外观；

（6）未监测试剂导致组织处理不当

（7）机械原因造成组织处理器故障，可能需要二甲苯或固定剂进行“二次加工”，并重新处理，实验室应预想到这种情况下组织形态学和抗原性的变化。