为了体外诊断目的以免疫检测方法检测蛋白的溯源性至共同标准
近日，美国临床化学杂志刊登了Dr Miller的社论。他兴奋地宣布：一致性的时代已经到来。这个消息确实令人振奋。因为长期以来，促甲状腺素（TSH）的检测结果，在各个公司的产品间的比较，可比性很差，公司间对患者样品检测TSH的差异可以达到CV 30%以上。如何改变这个检测项目的一致性一直是大家在努力的目标。Dr Thienpont与她的合作者，勇敢地承担了IFCC提出的甲状腺功能检测标准化工作组（WG-STFT）的任务。她们努力了多年，在近几年连续发表的研究文章，展现了她们不断地为实现各个公司TSH产品对患者样品的检测结果逐渐趋向一致。
下面，我将自己的学习体写成文章。期望大家阅读后，可以更深入地了解他们实现一致性的努力。
早于2009年Dr Thienpont从溯源性的定义开始，为临床实验室解剖溯源性的真实含义，然后提出了IFCC的甲状腺检测标准化工作组的建议，以天然患者样品作为实现一致性的“参考物质”，作为实验去努力的做法，在理论上有了很大的突破。
一、对计量学的基础定义的理解：她认为，为体外诊断目的进行生物液体内蛋白的检测含义上，临床实验室有很多混淆。
1.“检测”即测量。定义为“实验上得到一个或多个量值的过程”（VIM 2.1）。这是一个含义很大的定义。这是实验的过程。与以往认识完全不同的是，过去将测量视为一个方法，现在是为了得到某个量值的整个过程为测量。
2.“被测量”特别重要，它是你实际上“预期”去检测的量值（VIM 2.3）。定义为：受到测量的量。与过去相比，被测量范围扩大了，量不能专指特定量，而是广义的量。定义中的注1指出：对被测量的说明要求了解量的种类，以及含有该量的现象、物体或物质状态的描述，包括有关成分及所涉及的化学实体。这个“量”是指拟测量的量，即打算或准备要测量的量。新的计量学指出，“测量包括测量系统和实施测量的条件，它可能会改变研究中的现象、物体或物质，使被测量的量可能不同于定义的被测量。在这种情况下，需要进行必要的修正。”
3.“量”可用一个数和一个参照对象表示大小的现象、物体或物质的属性。它的注解：
（1）量可指一般概念的量或特定量。
（2）参照对象可以是一个测量单位、测量程序、标准物质或其组合。
性质具有一个大小，可以数字和一个参考表达（VIM 1.1）。
4.测量标准的定义中，指出了具有确定的量值，是实现（realization）给定量定义的参照对象。在计量词语中特别强调了检测标准的具体化（embodiment或realization），含义非常深刻，也即要使测量标准具体化到可以实现。检测标准是某个给定量的定义的实现。（VIM 5.1）。
5. 对于TSH和LH技术之类的分析物，由于均有WHO先前发布了认可的标准物质，并且颁布了WHO规定的检测单位IU。因此，计量学基础定义明确了可以使用。并在示例中列出。当该参照是一个物质，来自WHO，报告了某检测结果，例如，为“在某给定血浆样品内促黄体素的任意指定的物质浓度量（WHO国际标准80/552）：5.0国际单位（IU/L）”（VIM 1.19，示例10）。
二、促甲状腺素的标准化的现状
1. 是不是世界上没有任何一个认可的TSH标准物质？不是。世界卫生组织很早就从人尸体的脑垂体中提取了人促甲状腺素（TSH），于1983年制成标准物质供全球使用。因此，各个公司购买这个WHO IRP 80/558的TSH标准物质，作为公司检测TSH产品的一级标准，通过溯源性传递的过程，使他们的产品具有校准品。可是，正如Dr Thienpont的实验结果，说明，存在于患者新鲜血清样品内的TSH，与从脑垂体纯化的TSH在免疫检测上有着显著的差异。
2. 促甲状腺素在人样品中的复杂多态性。
Dr Thienpont引用了Bergendah等的综述中，对黄体化激素（LH）的多态性进行的详细分析。血液中TSH的情况，与LH极其类似。
综述介绍了血浆内促黄体素（luteinizing黄体化激素，LH）的检测良好地遵循了计量原则，但是，忽视了非均相糖蛋白（glycoprotein）起着广泛的转译后的多态性。在血浆内，LH存在一系列的分子同种型，有修饰的糖基化（glycosilation）、甲硅烷基化（silylation）和硫酸化（sulphation）模式的形式。存在于血浆的第一个LH序列，与WHO物质的LH十分不同，WHO物质含有的是高度纯化的人脑垂体的LH。另外，LH分子非均相随内分泌状态而异，在健康的、疾病状态和各个个体间也均不同。这个病理生理的异质性的原因是，多态变异体由β-亚单位基因的点突变所致；在痴呆男性和卵巢缺失的绝经后女性，发现典型的“特级”甲硅烷基化（较多酸性）同种型；在多囊卵巢综合征等的患者中有较多的碱性同种型等。由于上述表现普遍发生在其他类似蛋白。总结指出，为体外诊断目的检测生物体液内的激素蛋白，是“混合物分析”。因为这样，严格的计量原则不可应用，报告的数量如上述促黄体素的5.0 IU/L会没有意义。而且，直接使用WHO的国际参考制品（IRP）作为所有公司持续使用的一级校准品，无法使公司产品对患者样品的检测结果实现溯源性。
三、进行TSH标准化实现一致性的前提
1. 认识患者样品的复杂性。
临床实验室需要对新鲜患者的样品，得到可靠结果。但是，由于进行TSH检测血清样品内TSH的复杂多态性，被IFCC工作组认定TSH对血清样品的检测分析是对TSH的混合物分析。为此，所有检测结果的可靠性，必须自始至终以患者样品作为一致性的实验对象和依据。
2. 使用真实患者样品传递检测结果可靠性。
现有的WHO的国际参考制品（IRP）确实是国际上仅有的参考物质。目前各个公司只能以此校准公司的检测系统。但临床实践充分说明，这样的标准物质没有带来一致性的结果。从溯源性链来说，却又少不了这个唯一存在的标准物质。为了实现各个公司产品间对患者样品检测结果的一致性，最佳做法是，在公司第一次对检测系统的校准品定值中，只能采用WHO的IRP 80/558，作为实现检测系统对患者样品检测结果的溯源性依据。但是，在整个实现一致性的实验过程中，必须永远以真实患者样品作为检测结果传递的依赖。因此，如何确定每次这样的检测结果可靠性传递的血清样品检测结果可靠性，这是关键所在。
3. 以免疫检测程序应识别在TSH的不变肽序列上的表位，定义准替代成分混合物。
由于各个参与一致性研究的THS产品公司，对TSH检测使用的抗体位点有差异。这是造成各个公司检测结果不一致的重要原因。因此，必须确认，参与一致性研究的各个公司TSH产品中免疫反应位点是否在TSH不变肽链序列上，将是该公司产品是否继续被列入一致性研究的重要鉴别。不符合这个要求的产品将被淘汰。这样，尽管各个患者样品内的TSH多态性很复杂，但是，只要公司的检测抗体可以捕获TSH蛋白的不变肽链上的序列抗原决定簇的，那么实现不同公司检测结果的可比性就成为可能。这样的决定簇位点也就相当于真正的“参考物质”了。
4. 必须认真选择进行一致性实验的患者样品。
临床实验室每天进行检测的样品，来自各种患者。各种疾病和接受药物治疗等，均会严重影响甲状腺功能的检测。为了使每次比对使用的样品，尽可能减少各种原因对TSH检测结果的影响。必须非常重视样品的选择。Dr Thienpont还专门写了文章“好样品才能得到好的检测结果和结论”。
简言之，造成患者甲状腺功能亢进或衰退的生理和病理原因不简单，在对甲状腺功能不正常患者的治疗也有些复杂。为了使甲状腺功能正常、亢进、和衰退的样品，都可以实现一致性；因此，这些样品都应该进行实验。但是，实验必须分步实施。实验使用最多的是正常甲状腺功能的样品，实验开始评估结果一致性应从正常功能入手；而且逐步开始进行功能不正常样品实验时，还必须从已经实现一致性的正常样品那里，将一致性可靠性传递给各个公司的检测系统，然后再去检测概念不正常的患者样品。所以，IFCC的TSH一致性工作组，收集的功能正常样品，每个供体必须提供至少400ml以上的血浆。接着，再收集甲状腺功能亢进和衰退的患者样品，可以少一些，但困难非常大。不论怎样，IFCC工作组还是克服了困难。
在收集样品中，IFCC工作组尽力排除来自各种因基因突变导致甲状腺功能不正常的患者样品。对接受基因重组的TSH生物制品进行治疗的患者样品，也不予考虑。还有一些不可考虑的收集样品的患者要求。总之，收集符合实验要求的样品，是开展实验工作得到可靠结果的第一前提。
5. 整个实验分阶段实施。
大致上，IFCC工作组的实验分为4个阶段。下面图示列出了3个阶段。这项被称为“一致性的递升方案（A “Step-Up” approach for harmonization）”工作的第一阶段为“熟悉阶段”，该阶段将按照设计方案，对一致性的候选被测量进行实验。
如果实验结果具有足够的质量，成功了，那么再进入第二阶段“递升阶段”。如果不成功，将作出终止决定，为改进给出建议。在递升阶段，观察在TSH的病理生理浓度范围是否实现充分的一致。若是，则可进入第三阶段“一致性阶段”。如果在第二阶段没有成功，则必须终止实验，研究改进。在第三阶段得到了一致性的结果，说明IFCC工作组的实验方案成功，使方案的做法对甲状腺功能正常、亢进、和衰退的TSH结果，都实现了良好的可比性。说明患者TSH的检测结果，在各个公司的检测系统检测下，实现了一致性。
这次，美国临床化学杂志刊登的Dr Thienpont文章，叙述了IFCC工作组进行了递升方案的第四阶段“实现不同公司检测系统的TSH检测结果，具有相似的参考区间”。这项工作刚刚发表，引起了全世界检验同道的强烈反应。
6. 采用所有检测程序患者样品检测结果的修整均值，为传递结果可靠性的最重要手段。
经过实验结果的统计分析，Dr Thienpont的团队，采用了稳健原则成分因子分析，得到各个患者样品的所有检测程序的修整均值。这样，每个符合要求的TSH检测产品对每个样品的检测结果，经统计处理后得到的所有程序的修整均值，使各个公司以这样的样品以及它的修整均值，作为上一级“参考物质”去重新校准它们产品的检测结果。
我在学习这些内容中，逐步领会IFCC工作组的做法。他们首先对甲状腺功能正常的样品，进行各个公司检测系统产品的方法学比对。从宽松要求上，IFCC工作组的第一次比对，16个公司产品有13个的检测结果基本符合要求，才确定了可以进行一致性实验的可能性。但是，从严来说，公司间对甲状腺功能正常的样品比对结果，一定较离散。因此，必须要使用一个合适的统计分析方法，去求得每个患者比对样品的一个值，对所有公司都可以接受的。这个方法就是Dr Thinpont报道的稳健原则成分因子分析。它们也被称为“修整均值”。IFCC工作组从中选择了一组患者样品，作为各个参与一致性实验的公司，以这组样品的修整均值，重新校准它们的检测系统，再去检测患者样品。实验说明，采用这样的做法，逐步使公司间对患者样品的TSH检测结果趋向一致。这就是在2010年间IFCC工作组实现的成就。我认为，这样的校准和比对，不是仅仅一次实验就能完成的。IFCC工作组一定会要求各公司反复校准、比对、重新统计得到新的修整均值；再校准、比对、求修整均值。这样的做法，更加认识到Dr Thienpont提出的，被测量的确认是一个动态的过程；只要它在TSH的β-肽链上的不变区域，各个公司的检测抗体落在该区域去检测TSH的，被测量的值就会被多次的调整最后得到一个令大家满意的值！
对待甲状腺功能正常的样品是这样，对于甲状腺功能亢进和衰退的样品，也是这样逐步经过比对实现一致性的。我认为，在进行亢进样品比对前，首先由正常功能的那组样品，校准了各个公司的检测系统，然后，对正常样品和亢进样品进行检测。由于以往没有检测过亢进样品，这样的比对肯定与原先仅仅正常样品的比对不同。我想，IFCC工作组一定从中选出一批亢进样品，与那组正常样品一起，再次求出最适合它们比对的修整均值！再与上述正常功能的样品一样，要求公司重新校准、再比对、再求修整均值。如此不断重复，直至亢进的和正常的样品，都能在各公司的检测系统检测的TSH结果，具有很好的可比性下，IFCC工作组实现了正常的和亢进的样品在不同检测系统下的检测结果一致。以此类推，再对甲状腺功能衰退的样品进行检测比对、调整各个样品的修整均值、出现校准各个检测系统、在检测患者所有样品、再比对、再求新的修整均值、再校准、再检测……。如此，一直到全部被选择的患者样品，无论是功能正常的、亢进的、或衰退的，均可在各个公司的检测系统下得到一致性的结果。接着，方可建立可以互换的参考区间！
7. TSH检测结果最后必须以SI制形式报告。这是真正实现患者样品检测结果达到可比性的重要度量。由于患者样品内TSH多态性的复杂程度，可以想象同一个TSH名称下，不同大小、与各种糖形结构的组合等，每个TSH的分子都不一样，因此，表达这样混合物内TSH的量的多少，最科学的做法就是应该以mol/L表示。可是，目前还无法进行以WHO IRP标准计算获得的IU/L与mol/L结果的换算。因此，实现了一致性的各个公司，现在报告的IU/L的意义，与原先的单位在含义上已经完全不同了！正如前述，这样的检测结果IU/L，完全依赖真实样品的不断比对才得到的可靠结果，已经几乎脱离了原WHO IRP的标准传递的量值。这才是以后对于诸如TSH项目所需要的。
