新筛儿干血斑溶酶体酸性α-葡糖苷酶活性测定筛查庞贝病 (Pompe病)

在2001年，有证据表明使用荧光基质的酶功能试验可应用于干血斑（dried blood spot，DBS）标本以确定黏多糖贮积病I型（贺勒氏症，Hurler综合征）和法布瑞氏症（Fabry病），为新生儿溶酶体贮积症（lysosomal storage disorders，LSDs）DBS筛查提供方法。此后报道了许多新生儿LSDs DBS筛查的方法，每种方法都有不同的被测量谱和方法学。2005年首次开始使用荧光法进行PD新生儿疾病筛查（newborn screening，NBS）。

在2004年，发表了串联质谱（MS/MS）法实现了多达5种LSDs的多组分筛查（PD、克拉伯病、戈谢病、Fabry病和尼曼匹克病A/B型）。在当时，公共卫生实验室已经广泛应用串联质谱法检测生物标志物并扩展到NBS领域以确定氨基酸血症、有机酸血症和脂肪酸氧化障碍。与使用串联质谱法检测血液中已经存在的化合物酰基肉碱和氨基酸不同，用于筛查LSDs的串联质谱法和荧光法是检测酶的产物，这些酶产物来自于从DBS标本提取的溶酶体酶发生的体外反应。需在试验谱中给每种酶加入合成基质。当前已提出许多方法以简化用于多组分LSDs筛查的串联质谱法，如引入联机样品清理、联合酶反应，从而减少进行串联质谱筛查所需的DBS样品和个体反应条件。

      1、概述

1.1 范围

Pompe病（PD）也称为糖原贮积病Ⅱ型，本文讲述了通过以群体为基础的新生儿干血斑（DBS）来筛查Pompe病（PD），并重点详述使用酶活性测定检出PD。其目的是为将PD新生儿DBS筛查整合到已有的新生儿筛查（NBS）计划提供信息。

本文包括PD的生物学和临床特征的背景资料，PD是一种溶酶体贮积症（LSD）。本文描述了不同的PD酶活性测定方法，讨论了实验操作中检验前、检验中和检验后的事件。同时，本文还包括了对短期随访和长期随访（LTFU）过程的讨论，包括案例跟踪，以及需要诊断性试验确证PD诊断。它含有除了PD以外的其他LSD疾病的关于DBS酶活性试验的部分讨论，包括戈谢病、Fabry病、克拉伯病和尼曼匹克病A/B型。

本文的目标使用者是新生儿筛查实验室人员、公共卫生项目人员、随访项目和卫生保健的专业人员，以及参与NBS检测监督和NBS仪器、试剂及相关产品的制造商的人员。

1.2 背景

近年来，在LSD尤其是PD的实验室检测和临床治疗方面取得了重要进步。这种疾病的治疗也受益于重组酸性α-葡糖苷酶的发展，重组酸性α-葡糖苷酶可作为GAA基因突变引起的GAA缺乏的PD个体的替代疗法。临床研究证实重组α-葡糖苷酶用于治疗有PD的婴儿和表现为进展性肌无力的老年人群有有益效果。有报道对16名临床诊断的患者进行治疗并在出生后6个月内进行酶替代疗法（enzyme replacement therapy，ERT）。根据自然史这个患者组有可能在2岁前出现心力衰竭或肺功能不全。然而经过3年的治疗之后，ERT降低了87%的换气或死亡的风险，与未治疗的历史对照组相比总体病死率降低了95%。此外，心肌病随时间得到改善，大部分患者学习和维持了大量的运动能力。ERT的成功引入激励了PD风险个体早期检查的实验室技术的发展。在显著临床症状发作前的检查需求引起了使用NBS进行早期识别的考虑。

台湾着手进行了第一次大规模的PD新生儿DBS筛查计划。从2005年开始，有证据证明荧光分析可用于识别有PD发展风险的新生儿。据报道有高风险的婴儿型PD（infantile-onset Pompe disease，IOPD）的新生儿在出生后一个月内可得到诊断。以前这些新生儿直到出生后3-6个月有心或肺功能衰竭时才能识别出来。根据台湾这项计划的记录，截止2015年12月，所有通过NBS确定的有IOPD并在诊断后立即接受重组ERT的新生儿不需要呼吸机支持，并在诊断后可存活3-5年。5个新生儿有心肌病，治疗后心肌状态显示正常。每个受影响的新生儿都显示出正常的生长发育和适龄的运动发育。

密苏里州是美国第一个用非盲研究对所有新生儿检测PD的州。根据密苏里州和华盛顿州的初步研究，美国PD的发病率大约为1/5000-1/28000活婴。虽然对于 PD NBS的重点在于检出IOPD（如，在1岁前有临床症状的儿童），但据估计，有晚发型PD（late-onset Pompe disease，LOPD）患者是儿童时期有IOPD患者的3-4倍。有LOPD患者比有IOPD患者在早期识别和临床治疗中受益更大。

      2、PD的生物学和临床特征

PD是一种由于溶酶体酶GAA活性降低引起溶酶体内糖原贮积而导致的进行性肌无力。贮积在溶酶体内的糖原破坏肌细胞膜导致肌功能降低。已经确定GAA基因突变是溶酶体GAA缺乏的根本原因。GAA基因定位于染色体17q25.3，长度为18kb，包含20个编码蛋白的外显子。

PD在临床上是一个连续的过程，从婴儿时期的严重型IOPD，到成年时才有临床表现的轻微型。过度型存在于这两种之间。与有IOPD的幼儿有心脏肥大和呼吸功能不全不同，有些有LOPD的个体表现为缓慢进展的近端肢无力，可能到50或60岁才出现症状。在这两种极端情况之间的儿童或成年人，其肌肉受累最终可能导致肺功能降低而死于呼吸衰竭。

PD是一种常染色体隐性遗传病，可由无症状的父母遗传，他们携带有GAA突变基因杂合体。GAA基因的特定突变会影响临床症状的严重程度并确定疾病发作的年龄。临床症状发作时间的主要决定因素是致病性突变c.32-13T＞G的存在，在北欧人群中这种突变在已经识别出的突变中占了约50%。这种突变结合其它致病性突变，预示可能为LOPD。当然，修饰基因和环境因素无疑会影响临床症状发作时间和严重程度，导致基于基因型预测PD表型变得困难。

2.1 筛查和诊断

一般根据症状临床怀疑PD时，其确诊依赖于在培养的皮肤成纤维细胞或肌肉活检细胞中检测GAA活性。由于粒细胞内麦芽糖酶的存在这种组织选择是必需的。麦芽糖酶在酸性pH范围内具有活性，在相同的pH范围内溶酶体酶的活性最大化。然而最近阿卡波糖被视是优先的麦芽糖酶抑制剂，当试验缓冲液中有低浓度的阿卡波糖存在时能够准确定量溶酶体GAA。这一发现使得在DBS和分离的粒细胞中准确定量GAA成为可能。在DBS中进行的这一试验可识别出有IOPD和LOPD的个体。但是仅仅根据酶活性无法区分这两种临床类型。

根据NBS确定有PD风险的所有儿童都需要进行确证的诊断性试验。如今确证试验中很少需要肌肉活检标本和/或从皮肤活检标本中培养的皮肤成纤维细胞，而是从新鲜采集的DBS或分离的粒细胞中进行重复酶试验。

确证试验需要基因测序以识别可能导致交叉反应性免疫物质（CRIM）阴性试验的严重突变。血CRIM检测可确定阻止GAA蛋白翻译的基因型的CRIM水平。应在对PD诊断有丰富经验和经认可的实验室内进行GAA缺乏的酶确证试验和GAA基因测序。对所有心脏肥大的GAA患者应在ERT之前用特定的检测或GAA基因分子遗传分析确定CRIM水平。其它有助于临床状态评价的实验室检测包括：

  评价苏木精染色的血涂片和淋巴细胞伊红染色的糖原

  血清肌酸激酶（CK）、血清氨基转移酶

  尿葡萄糖四糖（G1c4）

附加评价对于从LOPD个体中区分出婴儿型个体是必需的。这些评价包括胸部X线和心电图（EKG）以评价心肌病，血气以评价肺部状态。

2.2 患病率

PD的患病率有人群差异。荷兰IOPD的患病率约为1/138000，LOPD的患病率约为1/57000。总体患病率约为1/40000。有研究表明欧洲人群IOPD患病率至少为1/100000，LOPD约为IOPD的2倍。IOPD患病率最高的是非裔美国人，约为1/14000，因为在这一人群中翻译终止突变p.Arg854Ter更加普遍。亚洲人群的患病率约为1/40000-1/50000。

近期NBS人群研究证实或提高了基于临床研究评估的患病率（所有表型）。澳大利亚NBS初步研究估计PD患病率为1/8700。美国NBS初步研究估计华盛顿州的发病率为1/28000，密苏里州为1/5000。台湾一项正在进行的NBS计划已经确定受影响儿童为1/16919。澳大利亚和华盛顿的NBS研究在盲样中进行，其诊断只基于DNA数据，而台湾和密苏里州的研究是前瞻性的，诊断更加准确。然而，真正的晚发型PD的发病率可能被低估了，因为大部分个体没有表现出临床症状。2015年美国发布了以各洲和国家人群为基础的PD筛查的总结，包括患病率和筛查性能。

在亚洲人群中，假缺乏等位基因的存在（p.G576S）是酶活性低的原因，但不会导致临床症状。这个等位基因是亚洲人群NBS计划中假阳性率升高的原因。

2.3 治疗

在世界范围内已实现重组GAA的ERT治疗。IOPD婴幼儿一经确诊应立刻进行ERT治疗。但在ERT治疗开始之前应确定CRIM水平，从而使CRIM阴性的婴幼儿经受免疫耐受诱导以防形成抗体，形成的抗体会使重组GAA失去活性并干扰ERT的临床反应。ERT应在医生的监督下执行，并且监督医生应对照顾PD患者有丰富经验且熟悉如何应对ERT产生免疫反应时的过敏反应。ERT应在医院内执行，因为其潜在的不良反应和对传统的持续的支持性护理的需求，包括频繁的呼吸功能评估、物理治疗、语言治疗和职能治疗。

对确诊有LOPD的患者，可在出现临床症状或出现肌无力的早期病征时才启动ERT疗法，这可能出现在诊断后的几十年之后。但在童年时代的早些时候，应注意发育状态和神经肌肉状态并监控需要维持的生化标志物。出现临床症状后，应注意肺功能状态。出生后前3年，患者应每月定期接受PD专业医生的检查，随后若无临床损害的证据可每6个月到每年检查一次。

LOPD个体的ERT启动是以临床判断为基础的。据推测PD早期治疗将有更好的临床结局并延缓紊乱的自然发展。

所有确诊为PD的患者应添加到数据库或进行针对PD筛查、诊断和随访登记。

      3、用酸性α-葡糖苷酶活性试验检出PD概述

所有的GAA功能检测测量的是人工基质的转化产物，这种转化产物通过荧光光谱法或串联质谱法（MS/MS）可检测出来。所有试验的活性单位是每一孵育小时单位体积样品产生的产物的摩尔量，一般表示为μmol/L/h。测量的活性水平取决于基质结构和孵育条件，最重要的是pH、时间和温度。样品量取决于洗脱的DBS孔的大小和孔中指定的血量，试验中用的是洗脱的量。

3.1 96微孔板荧光分析

这一程序从以前的荧光法修改而来，其使用描述为PD新生儿DBS筛查程序。进行以下试验：

  GAA活性，在pH为3.8且有阿卡波糖存在时测量

  总酸性α-葡糖苷酶（tGAA）活性：在pH为3.8且无阿卡波糖存

在时测量

  中性α-葡糖苷酶（NAG）活性：在pH为7.0且无阿卡波糖存在时

测量

tGAA活性反映了同工酶GAA和麦芽糖酶的联合活性。tGAA活性用于计算可被阿卡波糖抑制的活性的百分比，计算公式为抑制%=（tGAA-GAA）/tGAA。NAG活性通过计算比值=NAG/GAA来控制DBS的量（纠正样品稳定性和白细胞计数）。其它酶可用于替代NAG，但Fabry病所缺乏的α-半乳糖苷酶（GLA）不可以，其有效性较低，可能是由于低GLA样品较多。由于基质背景荧光和血红蛋白荧光猝灭变异，应使用一个空白对照。从一个3.2mm的孔中洗脱的洗脱液经自动移液系统分配到6个板上。

PD新生儿DBS筛查可使用两级检测策略来降低假阳性率，尤其是在GAA假缺乏等位基因p.G576S有高发生率的人群中。首先，从一个DBS打孔中进行GAA和NAG活性的双重检测从而计算NAG/GAA活性比值。缺乏GAA活性但有足够的量（表现为NAG/GAA比值显著升高）的DBS可进行确证试验（筛查阳性的结果）。GAA活性部分缺乏但有足够的量（表现为NAG/GAA比值轻微升高[不确定的结果]）的DBS需再次打孔并进行第二级的三重检测（GAA、tGAA和NAG活性）。抑制百分比高可视为筛查阳性，随后应进行确证试验。

3.2 数字微流控荧光分析

数字微流控荧光（digital microfluidics fluorometry，DMF）分析已被用于新生儿酶活性降低或缺乏的筛查。DMF方法是以一种仪器为基础，使用专利技术来评估从DBS中提取的样品的酶活性。酶活性结果显著降低说明需要进行新生儿临床评价和确证的诊断性试验。

DMF技术是以电润湿效应为基础的。在液体-固体界面施加一个电压以有效降低界面张力，导致以一恒定角度发生变化。这一技术可用于操纵液滴至一排独立可控的表面电极。每个样品液滴在样品盒中经过运输、融合、分离或分配。所有液体都电动操作不需要任何泵、阀或通道。

通过常规的NBS处理过程从DBS标本中打下3.2mm 孔的样品进入微孔板。每个滴定板都有样品（N=40）和对照（N=2）。在室温下从DBS打孔中提取30分钟，将3.5μL的等分样品转移进DMF箱中。每个DMF箱中配置4个校准质控品、低水平和中水平的DBS质控品。DMF平台软件协调所有样品处理过程并使样品液滴在适合的试剂条件下孵育一个小时。然后将样品液滴输送到DMF箱中的特定位置，在这一位置进行荧光测量，荧光测量的物质是活性酶对人工基质裂解生成的游离4-甲基伞形酮化合物。软件将荧光数据转换成每个样品产生的酶活性数据，并对活性低于预定的截断点的进行标记。

DMF可稳定地整合进DBS样品处理系统并在NBS实验室内运行。从打孔到获得检测结果大约需要4小时，每台仪器每天可进行两个批次的检测。在一个液体通道从相同的DBS洗脱液中可检测5种不同溶酶体酶的活性，从而在一次DBS打孔中筛查多种疾病，并可以比较彼此间的酶活性以评价样品完整性和疾病风险。每个DMF箱可以检测40份样品，每个DMF平台上一次只能运行一个DMF箱。高通量筛查需要多个DMF平台。

3.3 流动注射分析-串联质谱分析

20世纪90年代末将串联质谱技术引入NBS，当时NBS遵循一项试验一种疾病的模式。由于串联质谱可以同时测量多种被测量，使NBS增加了从一个DBS打孔中检测的代谢障碍的数量。在流动注射分析应用中，将样品注射进流动相中，通过电喷射离子化，用三重四极杆质谱分析（见CLSI文件NBS04）。使用液相色谱（LC）泵传递流动相，但不需要色谱分离。由于流动注射分析-串联质谱分析（FIA-MS/MS）法的高通量、特异性和多重性能特点，其在常规NBS中已经得到广泛运用。

通过测量酶促产物可用这一方法筛查溶酶体酶缺陷。FIA-MS/MS检验前通过液液萃取（LLE）或固相萃取（SPE）移除盐和清洁剂。因此，LSD试验比当前使用的常规NBS MS/MS筛查试验更复杂。

用于单个LSD新生儿DBS筛查的MS/MS检测的发展先于直接的多组分检测的发展，DBS筛查的疾病包括PD、克拉伯病、尼曼匹克病A/B型、戈谢病和法布瑞氏症。最初的方法中，一个5mm的DBS孔在80μL缓冲液中水化。对于GAA反应，10μLDBS提取液与15μL包含酸性柠檬酸磷酸盐缓冲液（Ph4.0）、GAA基质、内标、干扰酶抑制剂阿卡波糖和去污剂的混合物混合。其它4个酶的反应体系的建立方式与此相同。这5个反应分别在5个独立的孔中同时孵育过夜，这5个孔分别具有每种酶特异的最佳缓冲液条件、基质、内标、去污剂和抑制剂（有需要的话）。然后将这5个孵育所得的反应产物混合到一个孔中，用LLE和SPE处理去除盐、去污剂和多余的基质。再用FIA-MS/MS分析这个混合的样品以测量这5个反应同时产生的酶产物和内标。单独筛查PD时，一个2mm DBS孔直接与25μL如前所述的检测混合液混合孵育然后用FIA-MS/MS分析。

过去几年对FIA-MS/MS检测的完善和改进做出了很多努力，当前的检测已经可以筛查MPS I。这种检测在单次检测混合液中将一个3mmDBS孔与所有的基质和内标共同孵育。孵育后经LLE处理，然后用FIA-MS/MS分析。这一最新的筛查方法可用于检测以下LSDs中的任何一个，单个或联合疾病：PD、克拉伯病、尼曼匹克病A/B型、戈谢病、法布瑞氏症和MPS I。所有的内标对于相应的酶生成产物在化学性质上是相同的但为氘化同位素。这种方法中，所有酶产物通过一个化学性质相同的内标进行定量，这个内标经历与产物相同的过程（如被酶分解、与基质结合、在质谱的电喷射离子化中抑制）。有一些实验室已经发展出他们自己的MS/MS检测以筛查PD和5种其它LSDs（克拉伯病、尼曼匹克病A/B型、戈谢病、法布瑞氏症和MPS I），可以检测单个疾病也可以多个疾病同时检测。

3.4 液相色谱-串联质谱

3.4.1 引入液相色谱到串联质谱

在DBS中完成以质谱（mass spectrometry，MS）为基础的LSDs分析通常使用FIA-MS/MS。然而近几年出现的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测成为另一可行的选择。由于其灵敏性和选择性，目前LC-MS/MS可用于某些诊断性检测和作为NBS的第二级检测。这一方法相比于FIA-MS/MS更具优势，包括降低劳动力密集的样品处理工作、提高了灵敏度、减轻了交叉被测量的离子抑制。而缺点在于样品两次注入间的时间延长了：LC-MS/MS为2.5分钟而FIA-MS/MS为1.5分钟。但对于拥有在HPLC仪器维护和操作有经验的员工和资金支持的实验室而言，更喜欢使用LC-MS/MS 。

LC是一种从液相样品组分中分离出混合物的分析技术。分离是由于不同组分与固定相LC柱的反应不同。每种组分与固定相间的特殊反应用一个术语“保留时间”来表示，其对特定的LC条件是独特的（如流动相、梯度、固定相）。推荐使用选择反应监控（SRM）的数据获取模式。色谱产物以高斯型的峰表示，为信号强度随时间的变化，而在LC-MS/MS中，信号则为SRM跃迁的强度。LC-MS/MS的优势在于灵敏度改善、样品工作量减少或简化以及特异度维度增加（保留时间）。缺点包括物质损耗（如柱、流动相的溶剂）、与FIA-MS/MS相比批次间时间更长（包括下一批样品前的柱平衡时间）和需要有经验的人员来操作和维护仪器（见CLSI文件NBS04）。

使用LC-MS/MS进行LSD分析的最大优点在于在MS/MS分析前不需要进行样品清理。当前的FIA-MS/MS程序需要LLE以清除极性样品组分，其中有一些程序使用SPE清除过多的基质，这两种方式都会对MS/MS分析造成明显的信号抑制和干扰。已经有证据证明在不使用经典的LLE和SPE步骤下使用LC-MS/MS测量GAA和DBS中的其它溶酶体酶的活性。使用这一方法分析了5000多个DBS证明有足够的日间和日内精密度（分别为1.3%-6.7%和5.4%-15.7%）。这个研究证明使用LC-MS/MS进行LSD分析对于NBS实验室是一个可能的应用。另一个研究使用更现代的仪器，使用超高效液相色谱（UHPLC）而非HPLC进行色谱，使用4个柱子和多个阀交错注入样品显著降低了样品-样品间的时间。

这一研究之后发布了一个新生儿DBS的大数据集（N=8600），证明了使用该方法可高通量筛查GAA和其它4种溶酶体酶活性。相同的研究小组使用该方法筛查了34736新生儿DBS的PD、戈谢病、法布瑞氏症和尼曼匹克病A/B型。对15个样品通过突变分析证实了筛查结果，包括4个确诊的PD。使用LC-MS/MS进行LSD分析时使用多组分孵育缓冲液进行修改且分析时不再使用在线清理柱。使用含有3种基质和内标的多组分孵育缓冲液进行一个DBS孵育，与参考方法进行对比，这需要事先提取和分离并在分析前将样品混合注入单独的孵育孔。去除这一过程便不再需要多个孔板和缓冲液，极大地简化了样品孵育步骤。同时使用这一方法不再需要废弃样品在线清理；整个样品直接注入柱子中。

这一方法扩展到UHPLC和多组分孵育缓冲液以检测DBS的GAA和其它8种溶酶体酶缺陷。由于UHPLC-MS/MS的灵敏度增加，一般的孵育时间（在37℃下轻微晃动时约20小时）可缩短至4个小时。需要进行进一步研究以确定孵育时间缩短是否会影响灵敏度。

这些例子证明对于LSDs的质谱分析，LC有助于减轻冗长的费力的样品处理程序（如LLE和SPE），缩短孵育时间，改善灵敏度和在不牺牲通量的前提下消除交叉被测量的离子抑制/干扰。尽管具有这些优势，LC的应用需要有技能的人才以及购买和支持仪器使用的资金。

3.4.2 超高效液相色谱-串联质谱法筛查PD和其它溶酶体贮积病

伊利诺斯州立法要求为6种LSDs NBS建立MS/MS检测，包括PD，研究于2011年开始启动。这个多组分检测是以已发布的方法为基础的，但使用一种含去污剂的缓冲液以适应疏水和亲水的基质。孵育3个小时后用前述的方式通过UHPLC分离孵育后的产物。然而为了降低成本、复杂性和仪器维护，使用一个带阀的柱子以在样品注入前去除低分子量物质及样品注入后去除去污剂、磷脂质和没有发生反应的基质。样品-样品间的时间为2.5分钟，每天每台仪器可完成500多次样品注入。

3.5 质量控制的一般考虑

质量控制（QC）是所有NBS质量保证计划的重要组分。QC体系包括检验前、检验中和检验后过程，可能每个批次、每天、每周、每月、每季度、每半年、每年或根据实验室标准操作规程规定的标准进行。某些QC内容是一些NBS方法和平台普遍共有的，如冰箱和冰柜的每日温度监控、评价用于检测的DBS标本的质量，而其它的一些QC是具有方法特异性的。这一部分主要讨论NBS检测PD和其它LSDs的分析中QC的一般考虑因素。

3.5.1 内部和外部质控品

用于PD和其它LSD的DBS质控品可通过商业来源或公开可用的途径获得。这些物质模拟真实的标本，其GAA和其它LSD酶活性的在预期值内或低于预期值。通常商品化来源的质控品视为“内部”质控品，上面有与相应的试剂盒相关的批次号和截止日期。公开可用的质控品视为“外部”质控品，可在不同批次的试剂盒中使用。NBS实验室也可以自制DBS质控品（“外部”）。

每个检测板上至少需要有2个内部质控品，两个不同的已知活性水平各一个。一个质控的酶活性应低于截断点（阳性质控），另一个质控的酶活性应高于截断点（阴性质控）。实验室应考虑质控参数和那一批次中总体的常规患者样品性能建立结果可接受标准。实验室应遵循所有的监管和认可要求。

某些规定要求每日检测外部质控品。它们可包含在任一样品板或平台内。除了提供质控指标的信息外，外部质控品还能提供一个分析参考点，这有助于快速检测两试剂批次间是否有显著变化。应实时跟踪和监控内部和外部质控品以识别性能上存在的任何趋势或变化。

3.5.2 人群数据监控

人群的均值和中位值数据是重要的QC参数，应持续对其进行监控。若软件有这一功能，则应计算每种酶活性每日的人群均值和中位数并与其累计值及标准差（SD）进行比较。应实时追踪和监控这些数据以检测试剂批次间可能存在的趋势和变化及其理由。这些数据对于实时的截断点管理是非常有价值的尤其是当软件可按年龄、妊娠和健康水平进行分类时，因为某些LSD酶活性可能受这些因素的影响。

3.5.3 定量酶反应值对分类结果的影响

不同酶功能试验给出的不同的值可能用不同的单位表示。但是来自干血斑-参考物质（dried blood spot reference material，DBS-RM）的结果比对表明不论试验的偏倚如何，分类结果是可比的（在每个实验室建立的GAA活性预期范围内或比该预期范围低）。迄今PD新生儿DBS筛查结果的临床有效性证实了这一观察。

3.5.4 能力验证

能力验证（PT）也称为室间质量评价，是实验室通过检测盲样周期性（每季度或每半年）声明其性能的方式，由外部机构提供盲样中被测量的浓度或活性。每个实验室都应参加由外部科学小组组织的PT计划（参考CLSI文件NBS04）。若无外部PT计划可参加，则应与一个或多个执行相同试验的实验室进行一种特殊的PT交流或开发一个实验室内部程序以对性能质量进行常规的盲检。也应进行已知样品的实验室间交流，因为某些LSD基因型很罕见，可能难以获得（参考CLSI文件NBS04）。实验室必需保存所有PT活动的相关文件。PT样品的处理和分析方式应与常规的患者样品相同或尽可能相同，且不论出于什么理由都不能交给参与实验室以外的机构。

这里有一个完整的PT计划，该计划针对PD筛查，每季度进行一次，使用源于脐带血的DBS-RM来模拟阴性的新生儿DBS和源于在去白细胞血液中加入转化的淋巴细胞的DBS来模拟阳性的新生儿DBS。

实验室可将前述的PT样品作为盲样来评价员工的培训和验证能力，保存的PT样品也可用于其它实时QA和实验室内的方法确认。

3.5.5 确证的阳性标本库

获得和保存临床确证的阳性LSD患者的DBS标本对于实时QC有很大的价值。如CLSI文件NBS01所述，适宜的冷冻保存条件对于QC标本是非常必要的，实验室应确认保存的标本的稳定性。保存的标本可用于试剂批次内或批次间的周期性QC检查。它们对于仪器预防性维护和修理后的方法确认过程也有很重要的作用。经过生化和/或基因确认的在正常范围内的阴性质控也应包含在库内。从PD成年患者采集的血液标本的结果可能有低偏倚，原因在于成年人与新生儿样品间白细胞计数和血细胞比容存在差异，如果在设定截断值时没有考虑这种差异的话，可能导致潜在的假阴性结果。

3.5.6 试剂批次改变质控

试剂批次间的变异可影响检测的性能和/或参考区间。因此，新试剂批次在使用前应进行评价。批次间的平行测定可在不同的样品间进行，包括：

  外部质控品

  以前的PT样品

  阳性和临界标本

  以前确证的假阳性样品

  正常的样品

有可能的话，在更换批次前应比较人群均值和中位数并密切监控前2000到3000个常规样品以识别批次更换后任何可能存在的显著变化。使用截断点中位数百分比或均值百分比可减少验证新试剂批次性能所需检测的数量。

3.5.7 仪器匹配

应分别独立和联合确认NBS实验室内每个系统的性能以确定是否所有的仪器产生的结果相似和是否可以使用相似的参考区间。每年至少应进行两次仪器间的平行测定以评价结果间的百分差值及结果是否在实验室设定的仪器匹配标准内。平行测定可使用低或中等范围的质控品或来自阳性标本库的样品。

3.5.8 标本和样品质量

CLSI文件NBS01描述了标本采集、运输和处理的详细内容。质量不佳的标本会导致筛查延迟，如果没有及时再采集一份标本的话可能无法对该有风险的新生儿进行随访。对受影响新生儿诊断延迟可造成更高的发病率和死亡率。标本应在采集后24小时内使用可提供追踪信息的快递服务邮寄或发送到筛查实验室。实验室应具备监控和检查从标本采集到接收的时间的政策和程序。

有时质量不错的个体样品或DBS标本可能得到不准确的结果，这种情况归因于许多原因。使用MS/MS法时在内标质控物上出现强度标签可能显示为错误的结果。对于多种LSDs的多组分检测法，同时在所有酶上出现标签可能显示为失败的检测或样品质量不佳。应进行额外的检测，与其它NBS检测的结果对比以帮助确定是否需要进行重复NBS标本测定。

3.5.9 脐带血稀释

有较高GAA活性的脐带血样品可用不含可测量的GAA活性的全血稀释成不同的浓度，如去白细胞的成人血。DBS可从这种稀释的脐带血中制备而来，并用作相对GAA活性的校准品。校准范围取决于原始脐带血的GAA活性。

3.6 使用干血斑参考物质进行分析质量控制

由于DBS标本基质的独特属性，应使用DBS-RM连续监控、评价和检查定量NBS检测方法。DBS-RM对于发展和确认实验室NBS检测方法也很重要。在检测发展和常规QC中，除了校准参数外DBS-RM还提供了一个检测性能的二级评价。

确诊为PD的新生儿的剩余DBS对于实验室而言是非常有价值的参考物质，应尽可能保存在最佳保存条件下,在实验室内或实验室间进行特殊评价时少量使用。3.6.1描述了DBS-RM的代替品，从足够大的样品池中制备以为长时间的实验室内和实验室间评价提供足够的样品。这种物质可由NBS实验室自己制备，或由外部机构制备PT样品。

从PD成年人样品中制备的DBS也是很有价值的参考物质，这比新生儿DBS更容易获得。然而，当PD患者经受ERT时，应在下一次ERT前采集外周血液样品。应确保这些样品的GAA活性缺乏，其它相关的溶酶体酶活性在预期范围之内。

3.6.1 制备DBS参考物质（DBS-RM）用于质量保证

在分析中QC使用DBS-RM来评价GAA活性检测性能时区分3种类型样品：

  GAA活性在新生儿预期范围内的样品

  GAA和其它溶酶体活性低于新生儿预期范围的样品

  GAA活性低于新生儿预期范围而其它溶酶体酶活性在新生儿预期

范围内的样品

这些样品每个都需要准备相应的替代品。为了为长期QC和实验室间评价提供足够的样品需要有提供大量同源DBS的方法。这种方法已经开发出来，有足够血液处理设备的NBS实验室可以使用。

3.6.1.1 用含酸性葡糖苷酶活性水平的DBS质控品模拟新生儿预期范围

表示新生儿预期范围的DBS-RM最好用脐带血制备，因为成年人外周血的GAA活性通常低于新生儿。将脐带血混合并用基础池基质稀释以得到不同GAA活性水平的样品。GAA活性处于预期范围较低处的（截断点附近）DBS-RM对评价检测性能尤其有价值。

3.6.1.2 基于混合基质和溶酶体酶活性水平极低的DBS

基于混合基质可由成年人去白细胞血制备而来。将血细胞比容调整到50%。在这种基于混合基质中制备的DBS可作为阳性质控品，GAA活性很低或基本没有。这些方法不专门针对PD，也可模拟其它LSDs新生儿的标本，其条件如生物素酶缺陷、GALT缺陷和严重的联合免疫缺陷。

3.6.1.3 用含酸性葡糖苷酶活性水平的DBS质控品模拟PD进行能力验证和试验确认

GAA活性缺乏但其它溶酶体酶水平正常的DBS-RM可由转化的细胞系如源于PD患者的艾巴氏病毒转化的B细胞制备而来。这种物质的使用仅限于在试验确认和能力验证中模拟PD标本。

3.6.2 来自共识评价的分类一致性

用于分析中QC的DBS-RM应在多家实验室中评价以建立关于分类的共识。在多家实验室中常规评价公开可用的DBS-RM。根据要求，NBS生产的DBS物质也需要评价。

3.6.3 保存

DBS应保存在含有干燥剂和湿度指标的低气体渗透袋中。保存在相同容器中的DBS应使用秤量纸或透明纸分离开以降低可能出现的交叉污染。虽然在本文件发布时正式的稳定性研究仍在进行中，但已经显示在4-20℃含干燥剂的环境中保存的DBS-RM中GAA活性可在至少24个月内保持稳定。

3.7 质量控制要素

QC是质量保证（QA）的一部分，包括了检测的前、中和后的所有活动以确保检测结果准确。QA体系需要为每个质量性能指标定义标准。

3.7.1 检验前QC

NBS的检验前QC包括DBS标本采集、运输、处理和在NBS实验室中进行的标本评价。这些内容在CLSI文件NBS01有完整的描述。

3.7.2 检验中QC

检验中QC也叫实验室内部QC，是在实验室内进行一系列程序以持续评估实验室内完成的工作和评价检测以确定其对于结果发布是否具有足够的可靠性。分析中QC的主要目标是保证临床准确度和精密度。

3.6描述了制备DBS-RM用于分析中QC，这一部分主要描述应用参考物质和其它组分进行分析中QC。

3.7.2.1 一般考虑

NBS实验室普遍熟悉GAA活性测定的分析中QC程序。实验室在每天和每个批次检测时应将正常的（筛查阴性）和GAA缺陷（筛查阳性）的质控物包括在内。正常的质控物应包括具有在预期范围内不同GAA活性水平的DBS。这种质控物应落在筛查阴性的范围内。同样地，PD样质控物应落在筛查阳性的范围内，GAA活性值低于截断点。GAA活性定量的分析中QC计划不适用于PD样质控物，即使具有检测不到的或非常低活性水平的GAA。

作为检验中和检验前QC的一部分，实验室应对初始筛查时显示GAA活性水平低于截断点的标本进行再一次检测。通常在隔天对DBS标本的新孔进行重复测定。这不仅可确认GAA活性结果而且也可以识别对应的标本。

应对NBS实验室检测出的GAA活性低于截断点的标本进行检查并确定结果有效。应回答以下问题：

  同一微孔板中的其它样品的酶是否在正常范围内？

  若GAA是多组分酶中的一种，样品中的其它酶是否在正常范围

内？

  微孔板中的质控结果是否典型、可接受？

从DBS标本卡中选择一个新的孔进行酶活性的重复检测。若重复检测的结果与初始的结果不一致，则应调查导致结果不一致的原因。

3.7.2.2 监控校准曲线

若校准曲线是GAA活性检测结果的一部分，实验室应监控曲线参数的一致性。每个实验室应使用监控体系监控整个方法分析中QC校准曲线的一致性。

大部分实验室使用仪器配置的软件来生成校准曲线。这些软件提供的参数如斜率和相关系数，监控这些参数可保证检测值不会落在可接受范围之外。没有校准曲线时，可使用系列稀释的脐带血来检测分析范围内的线性。

3.7.2.3 监控DBS质控参考物质

DBS-RM的制备在3.6.1中描述。DBS-RM可通过公开可用的途径获取也可由筛查实验室自制。当NBS计划选择自己生产DBS物质用于QC时，可通过与参考方法的比对分析评价这些物质。从这些比对获得的临床分类应与NBS实验室之前指定的分类一致。

除了分类评价，在新生儿预期范围内具有不同GAA活性的DBS-RM可用于监控GAA检测的一致性。通过检查仪器反应值和/或从校准曲线内推的GAA活性值可监控精密度。计算置信限的标准方法和诸如Levey-Jennings图的图形显示适用于监控一致性。将结果画在质控图上可显示上或下SD范围（如±1SD、±2SD、±3SD）。质控值出现明显的趋势时应立即调查原因并采取纠正措施。对累积结果进行统计分析可识别更多微小的趋势变化。

3.7.2.4 能力验证

当前已有PD新生儿DBS筛查的每季度PT。每个PT中含有5个样品，这些样品的GAA活性模仿健康新生儿的DBS和PD新生儿的DBS。这些检测5个标本的季度PT在样品数量和检测频率上都超过了PT认可计划的监管要求。报告的结果按照2个水平进行评价，“不要求随访”或“要求随访”。PD型DBS在错误分类为“不要求随访”（如临床假阴性结果）时应立即调查，包括分析相同批次的PD型DBS的新标本。

3.7.2.5 监控人群分布

应监控人群分布参数。在足够的观察单位中一段时间内的GAA活性值的中位数应保持稳定。均值有比中位数更大的变异但在有充足的观察单位时也应该是稳定的。最相关的监控百分比是与截断点相关的百分比，但需要大量观察单位以进行所有参数的精密度评价。所监控的参数出现趋势变化时立即进行调查。

3.7.2.6 样品交换

没有经批准的PT计划或与其它QA活动联合时，实验室可能有自己的验证准确度和结果可靠性的程序（通常至少一年两次）。这可通过在实验室间交换标本而实现。对于这种性能评价类型，需建立一组程序以判断实验室间结果的可比性及记录的数据是否满足性能评价标准。标本交换过程是自定义设计的，许多变异可能满足实验室和监管的要求。应记录所有的性能和纠正及预防措施并保存正确的记录。

3.7.3 检验后QC

报告筛查检测结果、推定为阳性结果的随访、诊断确认、治疗和管理是所有NBS系统中关键的检验后组分。每个组分有相关的QC活动以确保持续的质量管理。

已发表的报告中已经全面覆盖了NBS分析后阶段的整体QC。这份报告讨论了一些需要QC的PD特异的分析后活动。专业人员对短期随访建议采取的措施的信息和进行最终诊断的算法已经可以获得，且可用于发展分析后QC。

对假阴性筛查结果导致的延迟诊断的监督是分析后QC的关键内容。没有诊断为PD的婴儿在出现了明显的临床症状时可能引起医护人员的注意。当出现通过筛查没有确定为PD的患者生病或死亡时，要求服务被筛查人群的小儿社区向NBS负责人报告。报告延迟诊断案例提示应进行详细审查和缺口分析以确定潜在差错来源，并应采取纠正措施。

    4、实施酸性α-葡糖苷酶活性检测

本部分讨论了选择和实施实验室试验进行PD新生儿DBS筛查的一般考虑因素。提及了预算和管理要求，但是由于这些因素在不同的NBS计划中变化很大，因此具体的支出没有列表，适用法规也没有讨论。

4.1 工作流程和方法选择

4.1.1工作流程评价

一份详细的工作流程图对于仪器选择和分配实验室工作人员是一种重要的管理工具。对于确定自动化仪器的最佳使用位置和满足所需的通量是否很重要是非常有用的。一份工作流程图应包括：

  试验谱

  出生率

  进样量

  识别和有效治疗IOPD个体所需的时间

  波动的接收标本数，这表明检测数量是否每天都在变化（通常

在某一天接收到大量标本，通常在周一和/或周二）

  人数限制（如可以工作数小时的员工数，加班是否是允许的或

可接受的）

  经营预算和资本消耗

  试验开发和实施的时间线

  实验室的空间和设置

  基础设施功能（如电）

  法规要求，尤其是体外诊断（IVD）检测系统或实验室开发的试

验（LDTs）

4.1.2 检测平台选择

一般情况下检测量低时使用手工程序而检测量高时需要自动化程序处理。但每种程序都应优化其平台并基于所需的程序和可用的资源选择试验工作流程。最佳工作流程应包括手工和自动化两种方法。

程序相关的考虑因素包括：

  平均每日处理的标本数和高峰日处理的标本数

  实验室操作时间（操作时间越少，就需要越多的设备、仪器和

人员以提供指定的容量）

  预试验和常规筛查可用的实验室空间

  周转时间需求并整合进一般NBS工作流程

  实施可用的时间范围（如截止日期或目标日期）

  整体花费和成本效益

  健康和安全（手工移液操作导致的反复动作损伤）

手工操作程序实验室应考虑的因素：

  提高执行速度

  启动成本较低时可能的津贴

  人工追踪和可视化的优势，尤其是在开发过程中（如技术人员

和执行操作为1:1）

  注意降低人为差错

  反复动作损伤风险升高

自动化操作程序实验室应考虑的因素：

  实验室工作量和程序需求，尤其是使用384孔滴定板的方法

  在有限的操作时间内需要的人员和仪器监控要求

  评价仪器可靠性、程序要求、维护和验证

  检测DBS标本出现的潜在问题评价

4.2 实施检测以进行预试验研究、确认检测以过渡到常规筛查

本部分讨论了在NBS实验室中实施PD新生儿DBS筛查系统所需的主要步骤。目标是建立稳定的实验室检测且在预试验阶段确认后将其直接整合进常规NBS。

4.2.1 执行预试验阶段

为了确定运行有效性，通常在预试验阶段之后才执行一个新的NBS试验。为预试验阶段作准备时应建立一个符合监管要求的临时程序手册。在试验过程中获得经验时应对这个临时程序手册进行修订并应在预试验总结中定下终稿，之后在对其做出任何改变前都应经过管理人员的审查。一般情况下预试验阶段与常规人群筛查应无缝衔接。

检测残余的匿名新生儿DBS标本可用于确定筛查的截断点，确定检测方法的分析特异度和灵敏度，评估预试验阶段的潜在阳性筛查结果，但应尽可能快地得出结论以使真实的个体无法定位的风险最小化。预试验阶段还包括一个新生儿子集的识别试验，这通常需要知情同意，取决于研究设计和影响NBS项目的法规政策。

以前的NBS项目关于使用预试验研究模型实施其它遗传病的新筛查试验的经验很有价值。已经实施PD新生儿DBS筛查的 NBS项目的经验是尤其重要的资源。计划进行PD初步筛查的NBS项目所面临的基本问题有很多。第一个主要的问题就是获得预试验资金，这通常是非常重要的限制因素。NBS项目需要确定初步筛查范围，尤其是确定是否检测整个新生儿人群以及检测是否仅局限在某一个亚组。应确定将接受检测的新生儿生产设施。此外，应定义预试验研究时长。执行预检测前，NBS小组应保证可获得所有工具和基础设施以筛查PD新生儿并当样品没有去识别时随访推定为阳性的个体。

PD筛查预试验研究的主要目标是确定将PD新生儿DBS筛查整合进已有NBS检测面板的最佳方式。在预试验研究阶段中还应评估执行常规NBS筛查所需的成本和人力。在准备预试验研究时还应将教育父母和医护人员关于PD的信息和与医疗护理人员交流包含在内。

若预试验在可识别的标本中进行，应作以下安排：

  及时报告结果

  随访阳性筛查结果

  可进行确认试验

  交给PD诊断和治疗的专家

  可询问治疗措施

任何一个预试验研究都应遵循相关规定，包括那些保护受试人免受研究风险的规定。许多项目已使用不同的模型用于预试验研究。通常豁免研究可以用于试验开发和某些分析确认。然后该项目可成为同意试点的项目或开始进行全人群试验。预试验研究可作为正式调查或作为“豁免”调查研究进行。一个正式的调查研究一般需要组织审查委员会审核批准。若在预试验阶段检测可识别的标本，则一般需要知情同意。为了将预试验研究作为豁免调查执行，需要向检查委员会申请豁免，并指出这样申请的理由是该预试验研究被认为是项目开发和评价。豁免时，标本一般需要匿名，这可排除任何随访的可能性。

4.2.1.1 建立实验室基础设施和临时程序

建立PD新生儿DBS筛查的实验室基础设施包括：

  设计实验室内的实际布置图

  购买和安装仪器

  招聘和培训合格的技术人员和技术专家

  开发GAA活性试验

  完成分析确认过程

建立实验室基础设施时应同时准备临时程序手册，从而确保在预试验研究开始前两者都已准备好

4.2.1.2 记录试验方法的分析有效性和临床有效性

方法确认包括2个环节：分析确认然后是临床确认。基本的GAA活性试验分析确认应整合进整个试验开发中，包括检测下限（LLoD）、定量下限（LLoQ）和试验内与试验间变异的评价。

CLSI文件EP17详细介绍了确定LLoD和LLoQ的方法。原则上确定LLoD和LLoQ需要2种基质匹配的参考物质：

  空白样品，不含被测量

  检测样品，含被测量

确定LLoD的第一步是在I类错误（在空白样品中检测到明显的被测量）规定标准下建立空白限（LoB）。通过对空白参考物质重复分析以确定LoB。在I类错误和II类错误（在已知含有被测量的检测样品中无法检测到被测量）规定标准下重复分析低浓度物质以评估LLoD。评估LLoQ需要定量结果可接受变异的其它规定。

对于GAA活性试验的实践评价，通过重复分析从基础池基质制备的DBS以评估LoB。评估LoB时，应在一定时间内（如一周）在多个批次中重复分析这些DBS。使用基于顺序的非参数法来评估LoB：I类错误率为5%时，LoB为外插的GAA活性水平的第95百分位。虽然至少要有60个值才可接受，但获得至少100个结果可扩大置信区间并可获得在确切整数百分位点处的观察值。

LLoD不能低于LoB但可以（且通常是）大于LoB。评价LLoD时，所分析的DBS标本的GAA活性水平应在LoB附近。这种标本可通过稀释脐带血进基础池基质而产生。分配的值与从稀释中计算出来的GAA活性成比例。LLoD是以I类错误（不含GAA活性的DBS得到的值高于LLoD）和II类错误（含GAA活性的DBS得到的值低于LoB）的规定标准为基础的。

若每种错误类型都设定为5%，则LLoD为这两个值中的较大者：

  含GAA的DBS至少有95%的可能性产生阳性结果时的最低浓度

  不含GAA活性的DBS有不超过5%的可能性产生阳性结果时的最高

浓度

确定LLoQ时使用相同的方法对低浓度样品进行重复分析，但需要试验不精密度和正确度可接受范围的其它标准。

确定试验内和试验间变异是一个不断进行的过程，从试验开发过渡到常规QC。应特别注意趋势或变化，尤其是当试剂批次改变时。一旦记录基本的分析确认，过渡到临床确认时应对NBS项目日常收集的大量新生儿标本进行前瞻性检测。这一阶段的目标是：

  建立GAA活性水平的正常人群分布

  指定一个临时截断点

  解决在高通量条件下可能遇到的问题

统计分析表明建立正常人群分布至少需要3000份标本。更大一点的样品量只能使置信区间得到微小的改进。虽然这一样品大小的确认过程不太可能识别出真正的PD个体来进行临床灵敏度评价，但应提供使用不同截断点时试验特异度的有用信息。试验的分析确认和临床确认应当是一个持续进行的过程。通过这个持续进行的确认，可确定最佳截断点以保证当临床假阳性结果最小化时始终可检测到PD，包括携带者和假缺陷基因型。在预试验研究期间随着人群数据累积需对截断点进行调整。

4.2.1.3开发试验和随访算法

根据预试验目标开发试验和随访算法。试验算法应描述确定最终分类结果所采取的步骤（如，筛查阴性、筛查阳性和不确定）。开发流程图或算法以确定该试验算法生成的结果是在范围内、范围外或不确定的。这一算法应考虑早产儿的GAA值可能较低以及非PD引起的出生体重较低的情况。对早产儿和出生体重较低的新生儿和胎龄较小的新生儿的考虑因素见CLSI文件NBS03。此外，随访算法应详细说明NBS项是如何解释从同一新生儿获取的多个（系列）标本的值。

4.2.1.4 与擅长LSDs的医生建立伙伴关系

在NBS试验实施过程中应在早期咨询擅长LSDs的医生。这些医生对NBS过程是非常重要的，根据需要评价新生儿、申请额外的诊断性评价、解释结果和启动治疗。

4.2.1.5 通知初级医疗提供者和父母

初级医疗提供者、生产机构和父母或监护人应可看到相关文件。这些材料应介绍PD新生儿DBS筛查并描述筛查目标。包括知情同意文件，其中含有自愿参与的声明、说明预试验研究的风险和益处的定义和保密协议。初级医疗提供者和/或生产机构的人员应通知父母，分发教育材料，收集知情同意书，若有需要的话。

4.2.1.6 建立结果报告机制

所有NBS项目都需要报告异常结果。一般筛查阳性的NBS试验结果应与符合干预紧急性的方式报告。为了确认IOPD的可能性，NBS实验室内所有筛查阳性的结果应立即确认，一经确认应立即交给熟悉PD诊断和治疗的医生。

在预试验阶段可得到不同的结果分类（筛查阳性、筛查阴性和不确定），建立一个程序将结果从实验室传递给随访小组。为了实现这一过程，应确定数据格式和试验结果措辞。随访小组和项目人员将确定这些结果如何与医生和初级医疗提供者交流（如电话、传真、电子通知、邮件）。这一小组也应开发一个程序用于持续随访，应为早产儿和在新生儿重症监护室或特殊护理中心其它患者提供特殊的程序。

4.2.1.7 确定临床诊断实验室进行确证试验

与临床专家协商后应寻找临床实验室进行确证试验。实验室应有分析新生儿标本的经验，包括相关的参考区间。

4.2.2 检测质量控制

实验室应执行质控程序以监控方法或所使用的系统的稳定性。质控品和校准品间接评估了患者检测结果的正确度和精密度。实验室应以与患者样品相同的方式检测QC样品，只有当满足指定的可接受性标准时才能接受质控结果。

程序手册应包含QC部分，这一部分描述用于监控和评价检测过程质量的程序以保证检测结果准确可靠。这些程序一般包括以下指示：

  遵循厂商的说明。

  有描述检测过程和检测结果报告过程的程序手册。

  执行和记录校准程序或检查校准品，至少每六个月一次。

  执行和记录质控程序，每天至少使用两个水平质控品。

  当出现问题或差错时，执行和记录所采取的矫正措施。

  根据适用法规，保存指定时间内所有QC活动的记录，一般至少

两年。

报告结果前，QC结果必须在程序手册定义的可接受范围内。程序手册还应包含对落在容许限外的QC数据应采取的合适的纠正措施。初始确认后当试剂或仪器发生改变或修正时需特别注意QC结果。

实验室可通过使用正式的统计分析来判断分析批次的可接受性，如Westgard规则和多规则QC。这些规则需要同一QC参考物质在每个批次的累计结果。这些规则可用于仪器反应值（原始数据）和/或GAA活性水平。然而，筛查阳性结果是以GAA活性非常低或缺乏为基础的，一般低于最低的校准品，这些外推值由于随机变异在检测下限的波动可能相当大。GAA活性检测正式定量统计评价的一个更适合的方法是将“比正常值高”和“比正常值低”的DBS-RM包括在内，“比正常值高”是指GAA活性在足月新生儿预期范围的中间，而“比正常值低”是指GAA活性明显较低但仍然在测量范围内。QC统计方法通常假定被测量结果和与测量相关的变异呈正态分布，即使数据经过转换，这种假设对于GAA活性测量也可能无效。

4.2.3 结果整理

结果整理是指收集患者信息和数据的过程，整理的结果是筛查报告的内容组成。由于筛查了大量标本，结果整理最好自动化完成以避免印刷和/或抄写错误。分析结果及检测标本的可识别的标签或条码应与包含婴儿人口学特征和标本采集信息的数据库相连接。

4.3 确定程序手册

预试验圆满完成时，应将检测方案转化为标准化的常规操作文件。以预试验期间收集的数据和信息为基础并符合适用法规，将用于预试验研究的临时程序手册制定成最终的形式。在管理认可前应完成临时程序手册中任何需要修订的地方。未来再做的所有改变需要额外的确认研究并记录，还需要实验室主任的管理审查和认可。

检测人员在工作台上应随时可拿到该程序手册。文件版本应统一，包括的项目如检测原则和临床重要性。所有新的和修订的程序都应更新并分发给执行常规工作的人员。实验室工作人员应在检查后在手册上签名和日期以表明他们已经检查并理解了新的修订过的手册。实验室应在系统中保存这个记录。电子程序手册有更多优点，鼓励使用。

    5、随访活动、交流和诊断试验

以下内容描述了PD诊断的确证试验和临床评价。这些内容强调了NBS小组、诊断实验室、临床PD专家、初级医疗提供者和家庭间交流的重要性。NBS小组应立即随访PD筛查阳性的患者。

与其它NBS试验类似，GAA活性试验筛查阳性结果并不能进行诊断。PD诊断还应包括其它相关的实验室研究，如分子遗传学分析。这些试验结果是对筛查阳性的新生儿进行整体临床评价的一部分。识别需要拯救生命的IOPD新生儿应立即采取这些步骤。

一些NBS实验室可能想进行PD随访所需的分子遗传学试验。这可促进对IOPD新生儿的识别。

5.1 随访阳性筛查结果

通过对分离的淋巴细胞进行诊断性试验以确认新生儿DBS有低GAA活性。当该诊断试验表明GAA缺陷时，应进行肌肉症状的临床评价。进行临床评价可从LOPD中区分出IOPD，应用胸部X线和EKG进行心功能评价，若胸部X线或EKG结果异常则做超声心动图。还应评价肺部状态并注意喂养困难。其它诊断性实验室评价应包括CK、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和G1c4。

应进行完整核苷酸测序和GAA基因缺失检测以确认有病理意义的核苷酸突变的存在。测序可作为转入临床评价前由筛查实验室执行的二层试验，或如有必要基于诊断性实验室GAA酶试验结果在临床评价之后进行。GAA测序数据的解释颇具挑战。GAA基因具有多态性和与临床症状相关的多种病理性突变，且修饰基因可能影响酶试验结果。从2014年9月起，大约记录了500个GAA突变，其中至少有400个据报道是病理性的。低酶活性的假缺陷等位基因不会使患者出现明显的临床症状。核苷酸测序和结果解释应由对GAA基因评价具有丰富经验的分子遗传学实验室进行。

若确认幼儿受IOPD影响，则应确定其CRIM水平。若幼儿的CRIM是阴性的，在启动ERT之前应执行免疫耐受方案以防诱导出失活抗体。基因型有助于预测出大部分CRIM阴性的IOPD。

确定为LOPD的新生儿，可在第一次出现肌无力的临床症状之后再进行ERT治疗。然后在之后几年里每3-6个月进行一次临床随访。若患者没有张力减退的临床证据，则每年进行一次额外的评价。每年进行一次的评价应包括肌肉张力、肺部状态、深部腱反射和肌肉酶测量（CK、AST和ALT）。

5.2 短期随访

由于具有IOPD风险，因此对PD筛查结果阳性的受试者应立即采取措施。应可获得NBS结果并出生后5天内报告。

5.2.1 临床评价

所有具有阳性筛查结果的新生儿都应尽快进行正式的临床评价，不超过出生后2周。应准备好针对确认为阳性筛查结果或有PD 高风险指标的可疑结果的即时评估，包括：

  PD家族史

  幼儿死亡家族史

  肌无力或心脏肥大的症状

  表明有PD的身体特征

5.2.2 诊断性检测

用于诊断或支持PD诊断的实验室检测见5.1，包括：

  血清酶CK、AST、ALT

  尿G1c4

  完整的核苷酸测序和GAA基因缺失检测

5.3 长期随访

PD新生儿DBS筛查，与对其它所有先天条件的筛查相似，目的是在症状发作前识别PD以提供早期干预，改善预后。LTFU是一个框架，用于评价通过NBS筛查确定的儿童的健康结局和身体情况。

PD NBS小组应追踪的LTFU的内容包括：

  治疗效果

  治疗并发症

  治疗结局

  潜在遗传缺陷导致的并发症

  持续性监督以对疑为LOPD的幼儿进行最终诊断

还应将以下测量包括在内：

  总体生存率

  生命质量

  成本效益

为了迅速地收集数据，协调的长期评价是非常关键的。与PD患者相关的登记网络已经存在。

持续收集前瞻性的LTFU数据对全面分析PD新生儿DBS筛查的PD患者及其家庭的临床、个人和社会经济结局的效果有重要意义。

此外，由于PD新生儿DBS筛查已经确定了没有典型的婴儿型PD的GAA活性很低的新生儿，因此该项目应与提供者合作以开发随访检测和临床评价方案。

    6、结论

当前还有一些PD和其它LSDs新生儿DBS筛查的不同方法正在使用。任一项目最好的方法取决于许多因素，包括：

  可用的资源（经济、人员和空间）

  试验执行速度有多快

  预期的对NBS项目检测面板的短期和长期变化

  当前NBS项目使用的筛查平台

每个NBS项目有不同的影响其试验选择的考虑因素。只增加PD至其检测面板的筛查项目可选择采用荧光法，这是一个简单的微量滴定板平台，使用一个滴定板阅读器或数字微流体平台来测量样品荧光。而对筛查多种LSDs的项目，由于其多组分容量要么使用MS/MS法要么使用以微液体为基础的试验会更好。

不论NBS项目预期的筛查要求是什么，本文件对当前使用的方法和试验选择时应考虑的因素进行了综述。一旦确定好平台或试验，本文件提供了关于试验实施和保证试验性能满足当地QA和QC监管和认可要求的综述。

与多种不同的试验方法相比，对筛查结果阳性的新生儿的短期随访出现了一致性算法，该算法来源于多个NBS小组的集体经验。关于当确定筛查阳性的新生儿是否有PD时应进行确认试验和应选择哪种诊断性检测以确定患者是否有典型IOPD已经达成了广泛共识。此外，对于确定有IOPD的新生儿，本文件提供了需要启动ERT步骤的共识综述。对于有潜在LOPD的婴儿需要进行长期医疗随访。随着以人群为基础的筛查经验的积累，对IOPD和LOPD进行持续的LTFU对于使PD新生儿DBS筛查发挥出最大作用是非常重要的。

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