关于直接对血流感染进行分子检测的临床观点的前瞻性多中心评估

—————— 摘  要 ——————

背 景：快速的诊断和合理的抗菌疗法对降低血流感染（BSI）患者的发病率和死亡率具有重要价值。目前，血液培养这一检测血液内细菌的金标方法，至少需要24—48小时才能得出结果，如果在采样期间患者正在接受抗生素治疗，那么该方法的灵敏度将会非常有限。此次前瞻性多中心研究的目的是对直接基于全血的一般商购16S/18S rDNA PCR，SepsiTest™ （PCR-ST）的应用进行临床评估。

方 法：此次研究包括来自166名疑似患有败血症患者的236份样品。将取得的PCR-ST结果与血液培养（目前检测BSI的金标方法）结果进行比较。由于血液培养会得出假阴性结果，所以我们利用基于临床诊断的评估、其他诊断试验和实验室参数执行额外分析来解析血流感染的可能性。

结 果：对结果的临床解析在22/43个阳性血液培养结果（51.2%）和21/47个阳性PCR-ST结果内（44.7%）排除检测到的污染生物体。排除这些生物体后，PCR-ST的总体灵敏度和特异性分别为66.7%和94.4%。在36份相关临床样品中，2种技术同时检测出的BSI样品为11份；单独使用PCR-ST方法检测出15份BSI样品；单独使用血液培养方法仅检测出10份BSI样品。因此，此次研究中与单独使用血液培养方法相比SepsiTest™额外检测出71%的BSI样品。

结 论：通过分子方法可以检测出更具有临床相关性的BSI，这样一来可能会影响患者的治疗。改进的SepsiTest™试验适于日常使用，对败血症患者菌血症的诊断具有额外价值。

关键词：SepsiTest™、PCR、血流感染、败血症、菌血症、分子、16S

—————— 背  景 ——————

血流感染是一种严重的临床症状，具有很高的发病率和死亡率。败血症、严重败血症和败血症休克与较高的死亡率有关，根据疾病的严重程度，死亡率介于20%—60%之间。败血症被定义为有记录的或假设的感染之外的全身性炎症反应综合症（SIRS）。严重败血症是一种与器官功能障碍、灌注不足或血压过低有关的败血症。败血性休克是一种在采取了适当复苏疗法后仍会发生血压过低和灌注异常的疾病。菌血症，是指血流内存在细菌，导致SIRS或败血症的疾病，通常发病率和死亡率都很高。BSI的早期诊断和尽早采取适当的抗菌治疗能显著降低发病率和死亡率。在败血症患者出现血压过低的1小时内采取适当治疗能达到80%的存活率，在此之后每延迟一小时，平均存活率下降7.6%，直到延迟使用抗生素的第6小时。传统的抗生素疗法对大约85%—90%的血流感染而言是正确的处置方法。一旦获得微生物学结果，就要立即对不当的抗生素疗法进行调整。

目前，自动化血液培养系统是诊断BSI的标准技术，但是血液培养存在一些劣势。第一，最低检测时间和致病微生物的鉴别时间为24—48小时；第二，危重患者的诊断灵敏度大约为70%，较难检测的微生物的检测灵敏度更低；第三，先前用过抗生素能显著降低血液培养的灵敏度，有时可以将灵敏度降低100%。

无需培养的分子技术直接对血液进行检测能潜在克服这些劣势。直接对血液执行的靶向微生物DNA聚合酶链反应（PCR）是一种处理时间仅需几小时的快速检测技术。PCR检测细菌或真菌DNA不依靠复制生物体，能直接检测完整的死亡细菌或活菌。诊断血流感染应用的PCR试验的主要技术缺点是全血内相对较大数量的蛋白质和人类DNA会抑制PCR扩增，因此目前采用的全血样品体积被限制在大约200μL。白细胞和蛋白内的人体DNA如免疫球蛋白G、红细胞内的亚铁红素、白细胞内的乳铁蛋白都会通过结合DNA聚合酶或结合核酸干扰扩增过程。但是，已经开发出DNA分离和微生物DNA选择性纯化法可以避免这一问题。采用这些方法后，理论上可以采用更大体积的血液，减少采样错误并提高灵敏度。SepsiTest™不是该领域唯一的技术，一些利用PCR或飞行质谱法进行病原体鉴别的试验如SeptiFast，基于血液培养的MALDI-TOF以及PCR ESI/MS（IRIDICA）也已经被开发出来。SeptiFast是一种直接检测全血的多重PCR。与血液培养相比，灵敏度根据检测的微生物的不同介于12%—67%之间，特异性在81%-98%之间，排除污染物的SeptiFast试验的临床灵敏度在62%—70%之间。最近一项随机试验证明采用新试验之后，从采样到提供病原体鉴别信息的时间大幅减少，PCR试验的平均时长为15.9小时，而血液培养则为38.1小时。该技术的缺点是检测的细菌和真菌病原体的数量有限，总计25种，并且多重PCR的灵敏度较低。下一个技术MALDI-TOF结合了商购Sepsityper试剂盒，可以对阳性血液培养进行鉴别，可靠检测革兰氏菌阳性微生物的检测率为76%，革兰氏菌阴性微生物的检测率为90%。当然该方法的主要缺点是需要血液培养，培养过程大约为1—2天，与直接检测血液的试验相比得出结果的时间较长。IRIDICA技术是一种较新的技术，它将直接检测全血的PCR与电喷射离子化质谱（PCR ESI/MS）相结合。与血液培养相比该技术的灵敏度和特异性分别为83%和78%—94%，该试验的灵敏度和特异性与临床感染标准相比为91%和87%。该技术貌似是一种有前景的技术，但目前发表的论文数量有限。

我们在本文中进行一项前瞻性多中心研究探讨“SepsiTest™”试验，该试验使用1mL从ICU疑似临床败血症患者身上采集的全血样品。在分离微生物DNA之前，该试验能选择性地降解人体DNA。该试验能在4小时内提供阳性或阴性结果，但需要额外的测序鉴别微生物，如果实验室可以进行测序，则该试验仅需增加额外2—3小时的时间。通过将PCR结果与血液培养、C反应蛋白、其他微生物研究和患者数据进行比较来评估该方法的临床相关性和日常应用性。研究显示BSI的分子检测能让败血症患者潜在受益，但是该技术仍需一些改进。

—————— 方  法 ——————

该研究对疑似败血症患者进行多中心试验。从每个患者身上采集用于血液培养的血液和用于SepsiTest™ PCR试验的EDTA血液样品。在下列三个参与的中心执行该研究：德国威腾/黑尔德克的科隆大学科隆默海姆医学中心；德国杜塞尔多夫海因里希海涅大学医院和荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心。每个中心的机构伦理委员均会批准了本研究。采血行动与日常患者护理合并，无需另行前述书面知情同意书。采集了供PCR-ST使用的血样；回顾性地执行DNA提取、PCR和测序。因为此次研究为观测性研究，PCR-ST的结果未与临床医师分享。患者的治疗基于培养、临床症状和体征。

患者选择

三个中心总计包括166名患者。每个中心的采集期为5个月（时间跨度为2010年11月至2012年9月）。参与研究的合格标准为患者年龄大于或等于18周岁、因SIRS或疑似败血症进入ICU。如果治疗医生怀疑患者患有临床SIRS或败血症，则采集该患者的血样进行培养和PCR-ST。

样品和数据采集

根据医院的标准无菌程序，在同一次血管穿刺时采集用于培养和PCR-ST的血样。为了进行血液培养，在有氧和厌氧培养瓶内分别注入10mL血液，根据参与中心的不同情况采用BACTEC™ FX（Beckton Dickinson）或BacT/ALERT®（bioMérieux）的培养方法。血液培养的最长时间为5天。额外采集4mLEDTA血液用于PCR-ST。每个实验室采用传统方法鉴别阳性血液培养中的生物体。所有实验室都是根据国家质量标准认证的临床微生物学实验室。

根据疑似感染原因采集其他样品（例如痰液、伤口棉签、脓液或尿液）。记录采样当天的C反应蛋白和白细胞计数。登记初步和二次诊断、过去48小时的抗生素使用情况和住院患者死亡率。

使用SepsiTest™进行DNA分离

新鲜的EDTA血液被分为1mL的2等份并根据SepsiTest™生产商手册进行处理。简而言之，先在血液样品内添加离液序列高的缓冲液有选择地裂解血液细胞。接着添加MolDNase降解释放的核酸。离心浓缩后，使用BugLysis和2-巯基乙醇裂解潜在存在的细菌和酵母菌的细胞壁。蛋白酶K和最后的离液序列高的缓冲液进行额外的细胞裂解和蛋白质变性。通过“结合-清洗-洗提”程序分离病原体DNA，最终洗提量为100μl。这些步骤执行期间使用的所有材料均为无菌和无核酸材料，避免实验室和处理过程中的污染。SepsiTest™试剂盒附带无菌和无核酸的缓冲液和试管。使用无菌移液头。使用消毒的层流舱执行样品处理，每次使用后用紫外线处理。

PCR和扩增子检测

根据生产商手册执行PCR-ST程序操作。试剂盒包括一般PCR的主混合物、内部质控品、阴性和阳性质控品。分别使用经过检测的内部抑制剂检测每份存样（~50μl EDTA血液）的5μl洗出液。使用Piko Thermal Cycler（FInnzymes）执行所有的PCR-ST。使用电泳在2%的琼脂凝胶上检测扩增子。如果使用1份空白阴性质控品检测至少一份存样为阳性，则样品为阳性。

测 序

使用QIAquick PCR扩增试剂盒（Qiagen）纯化阳性扩增子并提交GATC Biotech（德国）使用试剂盒提供的引物进行测序。获得的结果使用SepsiTest™ BLAST进行鉴别，如果SepsiTest™ BLAST不可鉴别则使用NCBI BLAST进行鉴别。如果根据生产商手册在“属”一级的序列同源性≥97%，在“种”一级的序列同源性≥99%，则可以鉴别出生物体。如果样品在琼脂凝胶上存在弱带且测序结果质量不足，则重复PCR、扩增子检测和测序。如果测序结果仍然质量不足，则样品视为阴性。

定 义

阳性样品分为4类：真阳性、很可能为阳性、可能为阳性和疑似菌血症。血液培养和PCR-ST检出的完全相同的细菌视为真阳性菌血症。对于不一致的结果，则根据如下定义做出可能为菌血症的解读：如果同一患者的其他标本培养了该病原体且与临床诊断一致，则视为很可能的菌血症；如果其他培养未确认病原体，但与临床诊断一致，则视为可能的菌血症。如果其他微生物结果未确认该微生物且不是败血症的可能原因，则视为疑似菌血症。在这种情况下我们定义该微生物为污染物。

采样48小时内、阳性血液培养或阳性PCR-ST前后采集的其他标本的结果即尿液培养、伤口棉棒等被考虑在内。

多种微生物结果，即相同样品生成多于一种微生物，在检出的微生物之一符合真阳性菌血症、很可能或可能的菌血症标准时，视为真阳性菌血症、很可能或可能的菌血症。

统计分析

根据样品和患者水平计算使用血液培养作为金标的PCR-ST的灵敏度和特异性。基于成对样品即和PCR-ST样品一致的血液培养计算进行统计。随后，研究PCR-ST在诊断BSI方面的潜在附加值，PCR-ST灵敏度和特异性的计算包括结果的临床解析。基于上述定义，阳性样品分为真BSI、很可能、可能和疑似的BSI。真BSI、很可能和可能的BSI视为阳性，疑似BSI视为阴性，该标准用于调整的灵敏度和特异性的计算。

—————— 结  果 ——————

此次研究包括166名患者的236份血样。患者的平均年龄为65岁（26—92岁）。包括63名女性（38%）。所有样品中，血液培养判定43/236份血样为阳性（18.2%），PCR-ST判定47/236份血样为阳性（19.9%）。样品匹配72%的病例。排除污染物后，91%的样品为匹配样品。

与血液培养相比，SepsiTest™试验的灵敏度和特异性分别为25.6%和82.9%，阴性和阳性预测值为84.7%和23.4%（样品水平，表1）。分析166个患者时，灵敏度和特异性分别为28.9%和79.7%，阴性和阳性预测值为81.0%和27.5%（患者水平）。

血液培养和PCR-ST检出的主要微生物为葡萄球菌（表2）。血液培养检出的43份阳性血样中的30份（69.8%）中发现了凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）。2份血液培养的样品发现了金黄色葡萄球菌。对PCR-ST而言，不可能总能进行“种级”鉴别。PCR-ST的47份阳性样品中的13份（27.7%）内鉴别出了CoNS，发现了6个金黄色葡萄球菌的案例（12.8%）。额外9份样品（19.1%）检出了未进一步鉴别的葡萄球菌，由于测序片段质量不足，这9份样品不能区分凝固酶阴性葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。总计，血液培养检出了32份包含葡萄球菌的样品（74.4%），PCR-ST检出了28份包含葡萄球菌的样品（59.6%）。2份血液培养的样品发现了革兰氏阴性杆菌（4.7%）。PCR-ST发现了6份革兰氏阴性杆菌样品（12.8%）。每种技术均发现了一份假丝酵母样品，但是却是不同的样品。

仅有1份血液培养样品发现了多种微生物，即样品包含一种以上微生物（2.3%），但是PCR-ST的结果中出现多种微生物的样品很普遍（12份样品，25.5%）（表3）。值得注意的是12份多种微生物PCR-ST结果中的9份是在一个中心内发现的（75%）。

缩略语：PCR-ST，使用SepsiTest™试验的聚合酶链反应；

         BC，血液培养

a 一份血液培养的样品包含CoNS，PCR-ST则为包含CoNS+棒状杆菌

b 一份血液培养样品包含粪肠球菌，PCR-ST则为肠球菌+链球菌

c 多微生物样品检出的微生物见表3，在236份分析的样品中，采用1种 

或同时采用2种方法检出79份阳性样品。结果按菌血症的可能性分类，分为真阳性菌血症、很可能的菌血症、可能的菌血症和疑似菌血症。

缩略语：PCR-ST，使用SepsiTest™试验的聚合酶链反应；

         BC，血液培养

a 额外2个多微生物PCR-ST结果见表2；使用PCR-ST方法，这些样品包

含2种微生物，1种微生物与BC法一致

1个多微生物样品，一个生成多于1种微生物结果的样品，当检出的微生物中的1个符合真阳性菌血症、很可能的菌血症和可能的菌血症的定义时，无论其他微生物代表何种意义，均视为真阳性菌血症、很可能的菌血症和可能的菌血症。

当临床上受到污染的血液培养定义为阳性时，将血液培养作为金标评估PCR-ST结果可能会导致较低的灵敏度。另外，由于使用抗生素疗法或存在难以培养的细菌，假阴性血液培养可能导致PCR-ST的特异性较低。将实验室结果与患者疾病相关微生物临床解析的结果相结合，整个236份样品中的43份阳性样品中的22份被视为有污染。有污染样品占血液培养阳性样品的51.2%，占所有血液培养样品的9.3%。对于PCR-ST，47份阳性结果中的21份被视为有污染（44.7%），占所有样品的8.9%。例如，血液培养和PCR-ST检出的出现下肢血栓性静脉炎临床迹象和金黄色葡萄球菌的败血症患者被视为真阳性菌血症。一名患者患有腹膜炎，血液培养结果呈阴性，但是使用PCR-ST检出了肠球菌，腹膜培养出现粪肠球菌，该患者被视为很有可能患有菌血症。另外，使用PCR-ST检出了棒状杆菌，但任何培养均呈阴性，这样的样品被视为污染物，该患者被视为疑似菌血症。在对所有阳性结果进行临床解析后（表4），基于样品水平调整过的灵敏度和特异性分别为66.7%和94.4%。阴性和阳性预测值分别为96.7%和53.8%。总计36份样品通过PCR-ST、血液培养或同时使用两种技术检测后被视为具有临床相关性。在这36份样品中，2种方法检出了11种微生物，PCR-ST检出了15种，血液培养仅检出了10种。

缩略语：PCR-ST，使用SepsiTest™试验的聚合酶链反应

a 同时使用血液培养和PCR-ST方法，3个样品呈阳性，但是检出的

微生物不同。由于这两种微生物均视为具有临床相关性，所以在调整灵敏度时，这些样品视为可能/很可能的出现血流感染。

在28名样品具有临床相关性的患者中，13名（47%）患有呼吸道或腹内败血症（表5）。28名患者中的22名（78.6%）在检测前48小时内接受了抗生素治疗。在不一致的结果即仅血液培养或PCR-ST结果为阳性的结果中，仅有8名先前采用抗生素疗法的患者出现了PCR-ST阳性结果，血液培养方法仅有6名患者出现了阳性结果。

该研究明确指出PCR-ST结果的临床解析非常重要，这同样适用于血液培养。PCR-ST在诊断BSI方面具有实际的附加价值；与血液培养仅检出21个（71%）菌血症案例相比，增加PCR-ST方法检出了额外15个菌血症案例，这一事实确认了PCR-ST的价值。这些结果可能会影响抗生素疗法的类型、剂量和时长。

—————— 讨  论 ——————

BSI的快速诊断对患者结局产生非常重要的影响。直接检测全血的PCR取代血液培养，理论上能减少诊断时间，尽早实施适当的抗生素疗法。在这项多中心研究中，我们评估了一般PCR试验在诊断疑似败血症患者方面的性能。灵敏度和特异性基于PCR-ST和血液培养的比较以及样品和患者水平。为了测定这些PCR-ST结果的试剂临床相关性，在使用其他诊断试验并根据患者病情对检出的微生物进行临床解析之后再次对所有阳性结果进行了分析。尽管相关微生物的总数很少，但是236份样品中出现了21份具有相关性的血液培养结果和26份具有相关性的PCR-ST结果，SepsiTest™的性能在临床环境中得到了验证。

与血液培养相比，PCR-ST的灵敏度在不进行临床解析的情况下为33%，特异性为83%（样品水平），但是与血液培养相比，SepsiTest™的灵敏度要高得多（87%）。我们评估了相同的试验和患者比较群体，发现相当一部分存在凝固酶阴性葡萄球菌的血液培养被视为存在污染（阳性血液培养的47%）。在日常应用中，结果的临床解析是血液培养和PCR-ST临床应用的关键。47份PCR-ST结果中的9份发现了葡萄球菌。由于测序片段的质量不足，不可能区分其为金黄色葡萄球菌还是凝固酶阴性葡萄球菌，这是该试验的一个短板，因为凝固酶阴性葡萄球菌是常见污染物而金黄色葡萄球菌是重要的临床相关病原体。基于临床诊断、实验室参数和其他对相同个体执行的微生物试验，超过40%的血液培养和PCR-ST样品被视为有污染。血液培养发现了大部分的凝固酶阴性葡萄球菌，PCR-ST发现了大部分的葡萄球菌和链球菌。最近一项涉及1334名血液培养为阳性的患者的研究也显示出大量被污染的样品。在该研究中，55.8%的血液培养样品被视为存在细菌污染，真阳性血流感染率为44.2%。在对结果进行临床解析后，调整的灵敏度和特异性分别为66.7%和94.4%。对于临床解析，我们对上述方法提出了一些假设。此次研究定义的疑似菌血症可能实际上为真阳性菌血症，可能的菌血症实际上则可能为污染。这是计算后调整的灵敏度和特异性的短板。但是日常实践中对血流内发现的微生物进行临床评估非常普遍，尤其是对于凝固酶阴性葡萄球菌和某些链球菌。临床解析对PCR-ST非常重要，解析错误会对计算产生限制。

在对直接检测全血的PCR进行评估的研究中，除了SepsiTest™，其他试验与血液培养结果相比灵敏度也较低。例如SeptiFast试验，Josefson和Grif基于样品水平得到的灵敏度为12%—67%和63%。排除污染后，临床灵敏度为62%—70%。在这些研究中，具有已选定微生物数量的多重PCR被用于检测菌血症。不包括在选定微生物内的细菌理论上不能被该PCR检出。但是，这仅仅部分解释了灵敏度低的问题，因为大部分PCR不能检出的微生物仅在使用血液培养时才能检出。

大部分研究以及我们的研究中灵敏度低的原因可能是血液培养的输入量与PCR有很大不同。一个血液培养瓶可以使用8—10mL血液。但是PCR只能适用50μl血液进行检测。这意味着一次血液培养使用的血量大约是一次PCR反应使用的血量的200倍。因此，PCR采样错误的概率更高，尤其是患者血液内细菌数量较低的情况下。PCR使用50μl洗出液和10μl DNA可以改善这种状况，尽管这种改进后血液培养瓶采用的血量仍是PCR的50多倍。如果PCR可以采用更高的输入量，则灵敏度将会提高。

特异性与血液培养更加一致，但是血液培养是否为可靠的金标存在争议。在我们的样品中，我们发现了许多葡萄球菌，并考虑50%以上的阳性培养（大部分为CoNS）与临床无关。另外，血液培养可能出现假阴性。如果获得更多的血液培养结果，血液培养的灵敏度会升高，1组（20mL）血液培养瓶的灵敏度大约为65%—73%，2组为80%—90%,3组为95%—99%。因此，一次血液培养不能排除BSI。存在PCR检出的微生物可能反映实际疾病的情况。此外，微生物可能只在血液中暂时存在，众所周知，牙科治疗或手术治疗后都会出现短暂的菌血症。重要的是，这些菌血症不会导致全身性炎症反应综合症，因此不会导致BSI。存在真阳性菌血症但没有临床相关性。当然，对一般PCR技术而言实验室样品出现污染也是显而易见的，因此整个PCR期间的样品无菌处理至关重要。很明显，无论对于PCR-ST或血液培养，需要在临床环境中对检出的微生物进行评估来判断结果是否具有临床相关性或污染。

理论上，血液培养的优势是一种有活性的细菌就足以产生阳性结果。一次可以检测大量的血液，可以进行抗菌药物敏感性检测使血液培养成为有价值的技术。另一方面，对难以培养或不能培养的微生物而言，PCR技术非常有效，在执行抗生素疗法后，PCR技术可以直接检测全血，无需培养时间。这对及时采取适当的抗生素疗法非常重要。

SepsiTest™是一种需要添加多种试剂和缓冲液的复杂方法，在获得洗提液之前还要进行数次离心步骤。通过该程序的自动化和溶解曲线分析替换凝胶电泳来检测阳性样品的方法可以缩短操作时间，减少实验室污染。该试验通过测序鉴别细菌，能提供阳性和阴性结果。可以在4小时内执行DNA提取和PCR-ST，生成阴性或阳性结果。阳性结果需要测序鉴别微生物。可以进行测序的实验室在使用该试验时会增加2-3小时的结果生成时间。在我们的研究中，测序工作进行了外包，因此增加了周转时间。但是在日常实践中，在6—7个小时内就可以完成鉴别。该试验可以在不进行测序的情况下使用，仅依靠阴性和阳性结果完成鉴别。但是，由于存在潜在污染的可能性，很有必要对结果进行临床解析，因此需要进行微生物的鉴别。根据该方法目前的情况看，复杂的操作程序且需要测序进行微生物鉴别使直接基于全血的快速PCR的理论优势大打折扣。

—————— 结 论 ——————

这项涉及166名败血症患者的研究表明直接对细菌进行分子检测在诊断血流感染时增加了血液培养的价值。与单独使用血液培养方法相比，增加SepsiTest™试验（PCR-ST）后额外检出了71%的BSI。不仅如此，在使用抗生素疗法后，PCR-ST方法检出的BSI也比血液培养法略多。总之，PCR-ST可能会影响抗生素疗法的管理并降低患者的发病率和死亡率。尽管直接检测血液的SepsiTest™试验是一种有前景的技术，但是还需要增加血液输入量来降低采样错误，还需要更快的程序来鉴别微生物，这两点非常重要。目前，一般的微生物PCR不适合进行血液培养，但是会增加BSI诊断的临床价值。总而言之，快速的分子全血试验增加了患者治疗的价值。

摘自《BMC infectious diseases》，版权归其所有，仅供内部参考

编译：张凯

审校：韩泯、方研