ELISA定性试验室内质控及数据的实验室间比对管理
在本文中，详细研究了使用控制图连续评价各个实验室的检测过程并提供外部监测数据的方法。数据基于D.E.Rebeski等人的文章《图形方法监测ELISA法检测锥虫抗体的操作性能》（Veterinary Parasitology，2001，96，11-50），文章给出了在不同国家的15家诊断实验室中使用四种间接ELISA法性能的详细案例。研究表明使用图形方法评价每种ELISA性能的实际用途。
用于评价ELISA有关预期的上限和下限的性能指标的标准化的室内质量控制（IQC）样本数据由试剂盒生产商的研究确定（暂定值）。基于原始（光密度）和标准化吸光度值（计算为对照阳性的百分比），通过绘制值的位置和偏差的图形估计与期望数据范围值的分散。
此外，通过绘制IQC中变异系数＜10％的分布图来估计试验的不精密度。计算不同质控品的结合率来估计关于评估IQC样品在测试中是否检测出阳性或阴性正确度的检测能力。吸光度值离散图形分析结合试验的不精密度和能力标准对ELISA操作性能进行评价被认为是满意的，并为每板的可接受和拒绝提供有用的决策标准。对间接ELISA法建立标准化和易懂的IQC数据图法为国家实验室报告疾病发生提供了更强的信心。而且，利用数据汇总图并参照描述的性能标准检查所有实验室间的相对性能。也可以利用改良的Youden图分析检查IQC数据，并证明间接ELISA法可成功应用于诊断实验室，用于监测锥虫病控制计划。
已经建立了四种间接ELISA法，也对其稳健性和诊断性能进行了评价。另外，已经开发了标准化的易懂的用于监控ELISA的操作性能是否处于指定的限度内的控制系统，并将其应用于热带地区的诊断实验室。
研究目的是通过使用图表方法获得用于检测锥虫病抗体的四种ELISA方法的质量控制数据。对于在实验室开发阶段确定的暂定控制数据范围，这种方法确保了持续控制和监测ELISA法的操作性能。数据是从标准的IQC样品中获得的，并使用休哈特样图处理。这些方法提供了即时的可视化的监控，并有助于控制每个板之间和每天的操作性能。在不同国家的15个实验室之间比较了试验的整体操作性能。使用汇总数据图和改良的Youden图对结果进行图形分析。
1 方法
1.1 实验室
监测不同国家15家实验室的ELISA法的操作性能。
1.2 ELISA试剂
评价了四种间接锥虫病抗体（I-TAB）ELISA系统。简而言之，他们利用天然的（AGn）或洗涤剂/热处理（AGd）抗原制剂：两种基于刚果锥虫抗原的间接ELISA（I-TAB ELISA（T.c.AGn）和I-TAB ELISA（T.c.AGd）），以及两种基于活动锥虫抗原的间接ELISA（I-TAB ELISA（T.v.AGn）和I-TAB ELISA（T.v.AGd））。
1.3 ELISA步骤
ELISA操作是按照标准化的操作方案。检测程序包括四种IQC样品，每种样品重复检测4次，ELISA方法的操作性能指标为：明确的强抗体阳性（C++），中度抗体阳性（C+），抗体阴性血清样品（C-）和血清稀释缓冲液作为缀合物控制品（Cc）。
1.4 暂定的原始和标准化的吸光度的控制上限和控制下限
作为实验室检测标准化程序的一部分，初步的IQC控制上限（UCL）和控制下限（LCL）已经建立。在15家实验室中检测每个IQC（n=24）（6板，每板重复4次）。对于每板，根据ELISA数据交换软件程序（EDI），每个IQC重复的光密度（OD）值表示为C ++ OD 4次重复的中位数的百分比。对于每个IQC，初步测定原始吸光度信号的UCL和LCL为总OD平均值±3倍90份一式四份OD平均值的标准差（S）。同样，每个IQC百分比阳性（PP）值暂定的UCL-LCL范围为总平均PP值±3倍90份一式四份的PP平均值的标准差。
1.5 ELISA图表法
使用Microsoft Office绘制休哈特样ELISA控制数据图和进行数据处理。表1显示了在操作水平上使用的ELISA IQC数据图表法。然后这些图用于实验室间的探索性分析。图形可以检查相对于实验室建立的期望性能而言，在当地情况下，与真实操作性能的一致性，以便控制和监测板间、日间和趋势性能。
1.6 详细的和汇总的每日数据图
对于每个实验室，绘制每天的C ++ OD值的分布产成休哈特样控制详细（D）图和汇总的每日数据（SD）图。类似的图表用于绘制每个板中的IQC的PP值，将原始OD值表示为相对强阳性控制中间OD值（中位数OD值）均值的PP。休哈特样控制图分别以板的数目为x轴，实际的吸光度值或PP值分别为y轴。此外，UCL和LCL范围表示为总OD平均值和PP值±3S。单个板的每天IQC结果（OD平均值和PP值±2S）和同一场所下总体平均值±2S绘制在图中。一些OD或PP值被标记出来以说明对于S是极端值。
1.7 详细的每日不精密度图
对实验室内板内和板间IQC的变异性进行分析称为试验重复性。详细的每日精度（DDPre）图绘制变异系数（CV）百分比，这是基于S的IQC重复的相对分散的度量。CV％计算是用4个重复的PP值的S除以单个板相应的平均值得到。对于本研究，UCL设定为CV=10％，这是根据经验和标准化ELISA的评价中推荐而设定的。
1.8 详细的每日能力图
详细的每日能力（DDPro）图显示实验室内检测能力，计算每个板C + / C-的PP中位数作为结合抗体与非结合抗体的比例（B / B0）。为了计算，选择四个IQC重复的中位数而不是容易受4个重复结果分布影响的平均值作为真值。此外，相比C ++ / C-较高的比例，C+与C-相比较小的抗体活性差异被认为更适合指示检测能力的降低。用所有板在同一场所检测的结果计算总平均B / B0比值±2 S。暂定的UCL-LCL范围由C + / C-结合率总平均±3 S确定。
1.9 实验室间探索性分析
对于每个ELISA系统，IQC数据来自不同地区在当地条件下的实验室。数据上报给组织者，并将数据绘制在汇总数据图和改良的Youden图上以便ELISA性能的探索性分析。
1.10 汇总的实验室数据图
来自每个实验室的IQC原始的（OD）和标准化的（PP）吸光度值的总平均值代表了真实的数据范围，将其与暂定的UCL-LCL范围（总平均OD值和PP值±3 S）进行比较。
1.11 改良的Youden图分析
改良的Youden图分析可识别实验室间的系统误差和随机误差。简而言之，某个实验室从某份样本获得的结果绘制在图上并与类似样品的结果比较。根据图中绘制的点与真值的关系，可以决定有差异的结果是由于偏倚、不精密或两者导致。对于每个实验室，以C+的总平均PP值作为y轴，C-的总体平均PP值作为x轴绘图。C+和C-总体平均PP值±1 S形成一个矩形。实验室报告的IQC均超过均值±1 S定义的象限（右上象限或左下象限）指示系统误差。对于实验室随机误差，为两个IQC结果超过均值±1 S定义的左上象限或右下象限。落在均值±1S水平和垂直线围成的中间区域外的象限表示某个IQC样品具有随机误差。
1.12 汇总的实验室不精密度图
对于每个板和每个实验室的每个IQC，绘制CV值＜10％的频率分布图并在实验室间进行比较（重现性）。对于每个IQC，根据所有实验室中CV值＜10％的总平均频率±1S，箱子代表了真实的频率范围。
1.13 汇总的实验室能力图
对于每个实验室，结合率的总均值±2S绘制在图上用于证明实验室内检测能力的变异在暂定的UCL-LCL范围内（总均值±3 S）。另外，通过计算所有实验室单个板合并的B / B0率的总均值±1 S后通过规定的范围可评价实验室间检测能力变异。
2 结果分析
2.1 暂定的控制上限和下限的确定
对于每个ELISA系统，IQC吸光度和PP值的暂定UCL-LCL范围见表2。 对于I-TAB ELISA（T.v. AGn），C ++的初步OD限值与C +有重叠，表明阳性对照抗体的吸光度具有较高的变异性，但不会干扰辨别出C-。
注：对于每个实验室，表中显示了 IQC（Cc，C++，C+，C-）数据总的分布。n为检测的板数，总均值和超过厂家设定的上限和下限的值加粗。
2.2 实验室内ELISA性能的探索性分析
休哈特样数据图，用于地区1国家条件下监测ELISA，如图1a-d所示。IQC数据图分别显示C ++的吸光度值，每个IQC的PP值，CV％和B / B0值的分布。图1a-b中的每个图反映了所有板在不同场所中的平均值和变异。条长度显示了在每个板和每个场合的测量概率内四个重复检测值相对均值的绝对变异范围。
图1. ELISA T.c.AGd
（a）每天单个板和汇总板的图解。
（b）每天单个板和汇总板的图解。用PP值绘制详细图和地区1每个实验室的汇总每日数据图(（C++，C+，C-和Cc平均PP±2 S）。线条代表由参考实验室确定的暂时的UCL和LCL（总PP均值±3S）。圆圈中数据表示令人担忧的PP值范例。
（c）在地区1的每个实验室中用PP值的CV%绘制详细的每日不精密度图（DDPre）。横线代表CV=10%的暂定的UCL。这种图显示了板与板之间IQC均值的相对变异。在给出的例子中，ELISA法C++和C+的CV值<10%表明不精密度很好。如预期一样，更高的CV%值通常在C-和Cc中观察到，虽然CV值<10%也偶尔能观察到。
（d）在地区1每个实验室中绘制来源于每4个重复的中间PP值的C+/C-结合率详细每日能力图。记录每天总B/B0结合率±2S。横线代表由参考实验室确定的暂时的UCL和LCL（总均值±3S）。DDPre（Fig. 1d）是系统误差和随机误差对试验性能影响的案例。日期990118检测的板和日期990125检测的2块板显示结合率低于期望界限。
2.3 实验室间ELISA性能的探索性分析
在表1中列出报告15家实验室ELISA性能的数据图。将IQC数据中的原始和相对吸光度以及B / B0真正的离散情况与暂定的限值比较。对于实验室能力验证，以PP值表示的吸光度范围也与真实数据范围比较，后者通过改良的Youden图分析计算得到。分析每个IQC CV＜10％的频率分布，用于估计在不同实验室条件下预期的检测不精密度。
2.3.1 I-TAB ELISA（T.c.AGn）
在地区1内3家实验室和地区2内2家实验室中对I-TAB ELISA（T.c.AGn）进行评价。数据如表3和图2a-d所示。对于每四个IQC，在5个实验室中的2个实验室观察到期望的吸光度总均值（图2a）。计算PP总均值，5个实验室中的3个实验室证明了ELISA性能在建立的暂定限值范围内（图2b）。比较实验室间的检测不精密度（重现性），5个实验室中有4个实验室证明：C++和C+分别在总平均频率分布±1 S：82.38-101.86和61.05-107.46％范围内具有相似的CV＜10％的频率分布（图2c）。如预期，试验正确性方面的检测能力在所有实验室中均得到了证明（图2d）。在5个实验室中，有4个实验室表现出相似的实验室能力。
表3. I-TAB ELISA（T.c.AGn）的操作性能
注：对于每个实验室，表中显示了IQC（Cc，C++，C+，C-）数据的整体分布，n为检测的板数量，总均值超过厂家设定的上限和下限加粗。
图2 I-TAB ELISA（T.c.AGn）
（a）以OD总均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（b）以PP总平均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（c）汇总实验室不精确度图表示CV＜10％的频率分布。
（d）汇总的实验室能力图。
2.3.2 I-TAB ELISA（T.c.AGd）
在地区1内12个实验室和地区2内2个实验室中对I-TAB ELISA（T.c.AGd）进行评价。特定实验室中每个IQC的总吸光度均值和总PP均值数据如表4所示。对于每四个IQC，在14个实验室中的5个实验室观察到期望的吸光度值和PP值（图3a，b）。在12个实验室中观察到类似的期望试验不精密度，这通过C++和C+分别在总平均频率分布±1 S：73.77-105.60和76.87-100.52％范围内的CV＜10％的频率分布得到证明（图3c）。在12个实验室中获得了预期的检测不精密度（图3d）。
表4. I-TAB ELISA（T.c.AGd）的操作性能
注：对于每个实验室，表中显示了IQC（Cc，C++，C+，C-）整体的分布，n为检测板的数量，总均值以及超过厂家设定的上限和下限的值加粗。
图3 I-TAB ELISA（T.c.AGd）
（a）以OD总均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（b）以PP总平均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（c）汇总实验室精确度图表示CV＜10％的频率分布。
（d）汇总的实验室能力图。
2.3.3 I-TAB ELISA（T.v.AGn）
使用地区1内3个实验室和地区2内2个实验室的I-TAB ELISA（T.v. AGn）数据计算的总吸光度均值和总PP均值结果显示在表5中。5个实验室中，有2个实验室证明了每4个IQC期望的吸光度值（图4a）。对于PP值，4个实验室显示了ELISA性能在暂定的限值范围内（图4b）。5个实验室中的4个实验室具有期望的检测正确性和检测不精密度（图4c，d）。这些证明：C++和C+分别在总平均频率分布±1 S：74.59-97.81和78.55-94.78％范围内的CV＜10％的频率分布。
表5. I-TAB ELISA（T.v.AGn）的操作性能
注：对于每个实验室，表中显示了IQC（Cc，C++，C+，C-）整体的分布。n为检测板的数量，总均值以及超过厂家设定的上限和下限的值加粗。
图4 I-TAB ELISA（T.v.AGn）
（a）以OD总均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（b）以PP总平均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（c）汇总实验室精确度图表示CV＜10％的频率分布。
（d）汇总的实验室能力图
2.3.4 I-TAB ELISA（T.v.AGd）
在地区1内13个实验室和地区2内2个实验室对I-TAB ELISA（T.v.AGd）进行了评价。对于每四个IQC，在15个实验室中8家观察到期望的吸光度总均值，7家观察到期望的PP值（表6和图5a，b）。分析实验室间试验不精密度，14家实验室中13家证明了：C++和C+分别在总平均频率分布±1 S：66.30-106.21和56.74-103.96％范围内具有相似的CV＜10％的频率分布（图5c）。12家实验室中观察到期望的检测能力。11家实验室表现出相似的实验室能力（图5d）。
表6. I-TAB ELISA（T.v.AGd）的操作性能
注：对于每个实验室，表中显示了IQC（Cc，C++，C+，C-）整体的分布，n为检测板的数量，总均值以及超过厂家设定的上限和下限的值加粗。
图5 I-TAB ELISA（T.v.AGd）
（a）以OD总均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（b）以PP总平均值表示IQC值绘制的汇总实验室数据图。
（c）汇总实验室精确度图表示CV＜10％的频率分布。
（d）汇总的实验室能力图。
2.4 改良Youden图结果分析
确定了实验室使用间接抗体ELISA法检测锥虫病的随机误差和系统误差。对于I-TAB ELISA（T.c.AGn），I-TAB ELISA（T.c.AGd）和I-TAB ELISA（T.v. AGd），范围内的数据与另外实验室结果有重叠。y轴表示C +的PP值，x轴表示C-的PP值（图6a-d）。
图6 （a-d）改良的Youden图显示检测中的系统误差和随机误差
3 讨论
将标准化的IQC数据绘制成休哈特样数据控制图的方法可用于监控和评估ELISA方法的操作性能。图形方法的特点：
（1）持续保存所有数据的记录；
（2）对ELISA进行每天、每周的监控；
（3）快速识别不可接受结果；
（4）帮助识别特定试剂的问题；
（5）发现结果趋势，例如性能下降；
（6）注意到由于不同操作者带来的ELISA性能的偏差；
（7）满足良好实验室实践（GLP）的各种标准。
详细分析C++，C+，C-和Cc分割品可以比较生产商定义的数据，以便及时提醒操作者意料之外的OD和PP值。IQC结果中观察到的和预期的吸光度的差异可归因于操作者带来的误差和每个测量过程中固有的不可避免的随机错误。
例如，在国家7，获得了高于期望的IQC吸光度。对于C-，PP值维持高信号，后来发现抗-异种酶偶联物的稀释度用1/14,000代替了1/20,000。
对于不可避免的随机误差带来的变异，OD和PP值检测数据分布的解释需要额外的分析。C++和C+的PP值的CV＜10％的频率分布显示了试验的不精密度。C-和Cc的PP值的CV%绘制的频率分布图被认为对监测整体性能纵向的变化有用。然而，他们对于在单个场所下最终判断试验不精密度没有意义，因为他们的均值接近零。
分析C+/C-结合率，以便比较分析试验在实验室内和实验室间准确判断一个样品为阳性的敏感度。对于不精密度和检测能力标准，不管实验室上报的OD和PP值分布，结果显示此试验表现相当好，并在所有实验室均值±1S真实范围内。这意味着ELISA受个别发生在ELISA厂家控制范围之外的实验室的不确定性影响。
应该注意IQC性能指标与来源于当地牛质控血清的不同。因此，IQC结果，如结合率降低，不能自动控制有关灵敏度和特异度相关的试验能力。因此，建议重新检测试验血清样品，或甚至更好能够持续分析本地定义的能代表研究人群的抗体阳性和阴性参考血清。而且，强烈建议在本地常规检测这些参考血清以确保在收到新批号试剂后试验能力一致。
为了在实验室间分析IQC数据，改良的Youden图被证明有助于识别实验室能力。举个例子，与其他实验室相比，国家8的ELISA结果表现不一样，这种情况怀疑与系统误差相关，从C+和C-得出。这随后通过C++被本地收集的血清样品替代后得到了验证。
总之，为了评价实验室内和实验室间间接锥虫病ELISA法的操作性能制定了质量控制程序。从数据显示，单独使用IQC吸光度不能真实反映ELISA潜在的操作性能，因此其不应该用于判断每个板接受或拒绝的标准。最好检查变异系数和结合率的分布，可以容易地将它们记录在每个实验室的休哈特样数据图上。对于ELISA性能的实验室间评价以及对厂家定义暂时的UCL和LCL进行细化，应该将数据报告给参考实验室。数据图法通过监控抗原包被板在不同国家诊断性实验室中的检测性能为ELISA应用的可靠性提供了信心。
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