循环肿瘤细胞的生物和分子特征是精准医疗的创新策略吗？

摘  要

循环肿瘤细胞（CTC）是一种从原发肿瘤和转移肿瘤散播到血流中的罕见细胞群体。CTC被认为是癌症转移的前兆。作为液体活检的关键组成部分，CTC是理解转移形成的唯一工具和研究瘤内异质性的有价值的信息来源。由于CTC在大量的血细胞中非常罕见，所以为了检测CTC投入的力量也较大。多种癌症的研究已经多次证明治疗前和治疗中CTC计数的增加显著与不良结局有关。在精准医疗的时代，对CTC的研究早已逾越了检测和计数阶段。罕见细胞分析平台的快速发展可以在批量和单一细胞正面描述CTC的特征。CTC的遗传鉴别也有可能加深对实时肿瘤状态的了解，从而在临床环境中支持对治疗反应进行监测和评估，并能促进新型治疗目标的发展。

1. 前言

多年来，癌症一直是发达国家人口死亡的最常见的原因。尽管在过去的一些年中男性和女性的癌症总死亡率稳步下降，但是据美国癌症协会对美国人群的统计，估计在最近5年中新发病例和常见癌症的死亡人数还会呈上升趋势——这些常见癌症包括白血病、胰腺癌、肾癌和甲状腺癌。癌症发展到晚期，转移意味着癌症的致死性结局，是90%的癌症相关死亡事件的主要原因。因此，为了更加有效地对抗癌症，理解转移形成的机制非常关键。众所周知，癌症是遗传和/或后生变化累积的结果。因此，基于患者的遗传特征，很有可能需要对患者实施精准医疗。在多年的努力之后，人们逐渐认识到检测多种基因变化，对癌症患者进行精准再分层并选择相应的有效治疗方案能够实现潜在的临床受益。

循环肿瘤细胞（CTC）是一种从原发肿瘤和转移肿瘤散播到血流中的罕见细胞群体。CTC被认为是原发肿瘤位点和转移位点的纽带，因此理解转移的机制是研究的理想模式。治疗前的CTC基准计数已经被证明是多种实体瘤如乳腺癌、结直肠癌和肺癌的独立预后标志物。作为一种预后标志物，CTC在临床决策的制定和疾病进展的监测方面体现其应有的价值。不仅如此，基因组学可以让我们了解关于癌症的更多且更复杂的信息。越来越多的证据表明CTC能够引导临床干预，改善治疗结局。患有相同疾病的患者可能会存在相似的症状，甚至体液中癌症相关生物标志物的水平变化也相同。但是，我们目前了解到这些相同点不能表示就应该采用相同的疗法或预测相同的治疗反应：理解遗传病因能更加准确地引导有效的疗法。理解个体的遗传变异特征是进行最佳护理的关键。一些最近发表的研究表明化疗耐药性出现的驱动力是选择了最终导致疾病进展的耐药性亚克隆。因此，准确的肿瘤基因组分析逐步成为临床实践的常规项目，通过分子诊断，它对癌症治疗决策的制定变得越来越有价值。诊断不仅依靠数据采集，还要依靠系统地进行多元数据解析。同时，肿瘤的异质性越来越引起人们的注意。人们普遍接受的一个观点是癌症的发展存在一个潜在的肿瘤演进过程，在这个过程中，导致治疗耐药性的治疗方法带来选择性压力。多种驱动性突变和癌症演进是肿瘤异质性的鲜明特征。

尽管现代医学已经获得了长足的进步，但目前大部分患者所采用的仍是基于总体疾病状态评估的不精准的治疗。但是现在循证医学和转化医学的概念已经联合，形成了精准医疗的概念。许多国家的政府已经开始斥巨资开展精准医疗项目并将其作为战略目标。精准医疗是采用具有信息系统性的生物标志物，基于患者的生活环境、生活方式和遗传因素选择对患者最有效的治疗方法。精准医疗能够潜在地对医学实践造成深刻的变革。在癌症研究中，能够依靠准确地采集肿瘤原发位点的信息。寻找可靠的和可再现的生物标志物仍是精准医疗的最大挑战，目前大部分的候选生物标志物需要进一步确认。尽管实现全球无偏倚癌症基因组特征描述之前还有很长的路要走，但是测序分析已经广泛用于揭示肿瘤的异质性。肿瘤异质性的含义是相同肿瘤的肿瘤内部和肿瘤之间存在多样性，这是实施精准医疗的障碍。但是，在临床实践中，在许多领域都可以实现一定水平的精准医疗——采用稳定的分子方法将患者分入更具靶向性的治疗方法的亚组。本文中我们将讨论精准医疗与肿瘤学之间的关系。

多年以来，侵入性手术如组织活检已经作为癌症诊断的金标准方法。但是，由于肿瘤部位的不可访问性，尤其是转移性病变位点（例如前列腺癌的骨转移），活检通常难以执行。此外，作为一种侵入性的技术，组织活检为重复采样提供的空间非常小，因此难以评估肿瘤的负担。与传统组织活检相比，CTC作为一种液体活检，能提供适合癌症监测的无创采样方法。CTC可以用于监测癌症的遗传变异，尤其适用于终末期活检过于陈旧，不可进行或新活检不能执行的情况。

对CTC的研究主要被2个因素阻碍，即（1）在大量的血细胞中极其罕见的细胞；（2）CTC表型异质性，使得难以发现独特的标志物或CTC检测的特点。本文中我们强调了CTC在癌症转移和肿瘤异质性研究中的作用以及CTC特征的临床潜力。

2. CRC：癌症生物学的窗口

2.1  CTC：癌症转移的前兆？

最近几年，对CTC的研究已经加深了人们对转移阶梯反应（图1）的理解；多种类型的癌症研究已经对转移阶梯反应进行了大量描述。恶性肿瘤的发展时间可能为数年或数十年。源于胰腺癌的数据表明非转移性创始细胞的形成可能需要十年。癌症细胞发展出转移能力可能还会再需要5年。有意思的是，据估计增长优势仅为0.4%的一个单一的肿瘤细胞足以使其在5至25年的时间跨度内发展成为一个完整成熟的肿瘤。局部恶性肿瘤的一般标准疗法仍然是手术切除。大部分案例中，癌症患者进行早期诊断和病变切除可以获得较高的治愈率。与之相反，疾病发生转移的患者的结局较差。转移病变的形成是原发肿瘤位点的肿瘤细胞发生散播的结果。如图1所示，肿瘤细胞可以通过单个CTC或细胞簇迁徙，细胞簇通常被称为循环微栓子或CTC簇。源于原发瘤体的CTC的散播可以在疾病的早期阶段发生，甚至在原发肿瘤或癌症变得具有临床显著性之前。在第一步中，肿瘤细胞侵入血管系统并在血管中循环（图1），一些肿瘤细胞在远端位点的毛细血管中定植。肿瘤细胞簇由于太大而不能通过纤细的血管，最终会变形并重新组织。肿瘤细胞在新位点会渗出到目标器官的实体上（图1）。体外小鼠模型的数据提供了渗出细胞存活的证据，如果细胞停留在血管中氧气和营养供应最佳的位置，则肿瘤细胞就可能存活。总之，转移病变形成的每个单一步骤的效率都很低：血液中的CTC数量大大多于成功形成转移病变的CTC数量。定植效率低的一个原因是CTC在血液循环中的存在条件非常严苛。小鼠实验的数据显示以簇的形式迁徙的CTC自身防护性更好，在远端目标位点增殖的可能性也大于以单一细胞形式迁徙的CTC。和肿瘤细胞一同迁徙的基质细胞可能是造成这种情况的原因，散播的癌细胞能将其自身的微环境携带到目标远端位点。另一个促进CTC存活的因素是与CTC细胞表面结合的血小板。除了这些因素以外，还有许多其他转移病变形成的必要因素发挥作用。这些作用包括免疫防御的避让和抑制。促进肿瘤存活和增殖的支持性肿瘤微环境，以及CTC的羽干样特点。后者通常与“上皮间质转化（EMT）”有关，上皮间质转化是一种能让肿瘤转移的生物学过程。EMT包括如归因于间充质细胞VIMENTIN、TWIST和SNAIL基因的上调和像细胞角蛋白这样的上皮标志物的下调。发生EMT的细胞先输出羽干样特征，包括运动性增加和更容易形成转移克隆。由于转移阶梯反应期间多种变化的复杂性，因此需要多种富集和检测技术应对不同的CTC亚型来表明CTC的异质性。

图1：瘤内异质性、CTC/CTM和癌症转移过程示意图。

大型测序研究鉴别的瘤内遗传异质性。在给定的瘤体内，具有多种遗传多样性的癌细胞（用不同的颜色表示；胞核和细胞质的颜色类型相同）。癌细胞具有侵袭性并侵入循环系统时，转移阶梯反应就开始了。它们以单一CTC或CTM的形式向远端器官迁徙。在迁徙期间，CTC可能失去上皮标志物并获得间叶细胞的特征，使其细胞活性更强（细胞的胞核和细胞质用不同颜色类型表示）。在到达特定器官时，CTC从循环中渗出，侵入周围组织，并最终发展为转移病变。此外，肿瘤的异质性还表现为原发和转移肿瘤的不同（在“形成的转移”模型中细胞的胞核和细胞质采用不同颜色表示），并在临床实践中最终导致原发肿瘤和转移肿瘤对疗法的反应不同。取决于不同癌症的转移定植的器官特异性，一些最容易受到影响的器官包括肺部、骨骼、肝脏和脑部。

2.2  CTC：研究肿瘤异质性的方法

长期以来人们认识到癌症组织并不都是实体。癌症是一种对治疗具有不同临床反应的复杂疾病，即使对同一种肿瘤采用同一种疗法。瘤内异质性能部分解释这种现象。一般来说，肿瘤的异质性和癌细胞的构成有关，癌细胞有可能隐匿遗传变异，如图1所示，这些变异可能存在于瘤内不同的区域。肿瘤基因组异质性形成的一个原因是癌细胞基因组的不稳定性。一些不同的机能失常如DNA复制下调、核苷酸修复机制丧失、染色体分离缺陷和染色体端粒侵蚀就可以导致基因组不稳定性。Gerlinger等人进行的研究明确表明肾细胞癌的不同区域显示出一些唯一的基因组变异。所有肿瘤区域共有的体细胞突变仅为31%—37%。从临床的观点看，这些独特的肿瘤区域可能是疗法耐受性的潜在原因。癌症细胞的耐受性克隆可以隐藏在瘤块中，治疗开始前这种耐受性克隆就可能存在。治疗期间，这些具有耐受性的细胞将不会被锁定，并最终变得强大起来导致持续的耐药性。对于任何一种癌症类型，都已经鉴别出一些临床相关突变。这些远端分子变化表明应该根据个体的分子特征管理癌症。仅有很少的一部分遗传变异已经被确认具有预测和预后价值并被作为目标。对于靶向疗法而言，鉴别这些生物标志物是对患者进行分层并执行个体化治疗的关键。在转移的乳腺癌（MBC）中，显著比例的MBC患者中检测出CTC和相应原发肿瘤间HER2表达的分子不一致性，这需要进一步的基于HER2状态的前瞻性研究，为这些组的患者确定适当的疗法。

尽管CTC对其组织源头显示出相似的遗传特征，为了在循环中存活，CTC具备了能成为转移关键事件的特定遗传变化，导致其遗传特征不同于原发肿瘤但和转移组织类似（图1）。CTC也能反映瘤内异质性，并生成重要的临床信息。在结直肠癌患者中，相同的患者的CTC之间能检测出EGFR、KRAS和PIK3CA的多元遗传变化。在另一项关于肺癌的研究中，患有不同癌症亚型的患者的CTC显示出不同的拷贝数组变化模式，这对于利用CTC测定患者间的异质性和个体化医疗的患者分层都具有潜在价值。在后续章节中，我们将研究癌症中CTC的重要性，观察癌症进展和治疗期间在不同时间和地点出现的CTC群体。我们利用最新的单细胞分析工具，采用不同的分子目标（DNA、RNA、蛋白质和甲基化）和组学平台进行研究。

3. CTC的物理和生物学特征

CTC的物理和生物学特征与CTC的分离和鉴别方法紧密相关。因此，在我们引入CTC检测方法之前，应该首先强调CTC的特点。

据估计在1mL血液包含的数以百万计的WBC、上百亿的红细胞和其他成分中，可能仅仅存在1个CTC。作为液体活检的重要组成部分（其他成分包括循环肿瘤DNA、循环微小RNA、外来体）。它们于1869年被Ashworth首先发现。根据Ashworth的叙述，和局部癌症细胞相似的细胞出现在血液中，这能够解释癌症转移病变的形成。

由于采血是一种简单且几乎无创的过程，从血液中获得的CTC是癌症研究的理想标志物。近年来，已经成功实现了CTC的检测和分离。许多研究将CTC技术作为表明癌症进展的潜在生物标志物。在发表的研究报告中，每7.5mL外周血≥5CTC是最常用的癌症转移阈值，1个CTC是非转移早期疾病研究的临界值。除了使用CTC对患者进行分层时的极低临界值之外，细胞异质性也使CTC鉴别技术面临诸多挑战，因此需要高灵敏度和高特异性试验。

由于CTC是以单个细胞或偶尔以簇的形式在血流中循环，它们的存在不依靠支持性组织。CTC是非常脆弱的细胞，一些研究发现CTC正在逐渐凋亡。CTC脆弱的本质需要温和的分离技术来保存细胞的完整性。这导致CellSearch系统——CTC选择和计算金标方法的发展，该方法将血液采集到特殊的保存试管——CellSave中，避免损伤到CTC。

CTC的直径介于10到20μm之间，与其他血细胞相比体积较大。由于体积较大，CTC可以从血液学细胞中分离出现来（图2A）。已经证明不同癌症类型的CTC大小不同。根据CTC的大小选择分离技术如过滤和梯度离心能很好地分离较大的CTC。

细胞变型性是一种能作为标志物的重要性质，能够区分良性和恶性细胞。与其他血细胞如红细胞和白细胞相比，CTC的可变形性较差（图2A），因此可以利用基于可变形性的细胞分离技术。

图2：CTC检测/分离的技术方法。

（A）基于CTC物理特性的方法演示。和正常血液学细胞如白细胞（蓝色）和红细胞（红色小椭圆）相比，CTC（红色不规则形状）的体积较大，可变形性结构较差，在电场中显示出固有的介电性能。

（B）基于CTC生物学特性的方法演示。使用抗上皮标志物（如抗EpCAM抗体）、间叶细胞标志物（如抗波形蛋白抗体）和干细胞样标志物（如抗-CD44）可以阳性富集CTC或使用白细胞损耗抗-CD45抗体阴性检测CTC。

CTC存在一些与其来源相似的生物学特性，如细胞表面生物标志物。上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种上皮组织癌症中典型表达且不会在血液学细胞中表达的跨膜糖蛋白。因此，利用抗EpCAM抗体，可以选择性地从外周血液中捕获上皮细胞癌CTC（图2B）。许多技术利用这一目标作为CTC检测的基本原理。此外，更加深入的研究显示，细胞在血液中迁徙的过程中，CTC可能会发生CMT过程。这些CTC可能缺乏上皮标志物并获得EMT相关标志物。这种CTC的动态过程可能受到治疗压力选择的驱动并源于疗法耐受性。另一个CTC亚组是干细胞样细胞。通过对肿瘤特征的深入研究，癌症干细胞（CSC）已经被认为有助于CSC模式中不同癌症类型的癌症评估和表型、功能性多样性评估。CSC还被认为有可能介导癌症转移和疗法耐受性的出现。但是难以从实体瘤组织中直接获得干细胞。因此，该CTC子群体是一种令人感兴趣的研究癌症“多能性”的CTC。

除了一些癌症类型共有的常见标志物之外，每种特殊癌症类型还有一些组织特异性抗原，其中一些已经被研究了很多年。例如，BRAF的突变状态已经是部分黑素瘤的既定诊断目标。在分离的CTC中实现的对该基因的测序显示出黑素瘤的异质性。HER2过表达在15%至30%的侵袭性乳腺癌中发挥着重要作用。最近几年，它还被用作检测CTC的标志物。已经表明HER2呈阳性的CTC的存在和出现频率与患者较差的结局有关。

如前所述，在循环中不仅检测出单细胞形式的CTC，还检测出CTM形式的CTC。对CTM的研究是一个正在发展的领域，有前景的数据显示CTM在癌症的转移扩散中发挥着巨大作用。最近，一种针对性分离CTM的设备已经研发成功，称之为Cluster-Chip（簇芯片）。CTM的形成尚未被完全了解：例如，CTM是直接从肿瘤上分离还是单个CTC从肿瘤上分离后在血流中聚集在一起形成了CTM。有证据显示CTM不仅包含肿瘤细胞，还包含WBC和血小板。以前人们认为CTM因为太大而不能穿过毛细血管。但是，最近的一项研究表明利用微流体设备进行的试验显示肿瘤细胞簇能变形并穿过5至10μm的毛细血管，这说明CTC簇在癌症向远端散播并形成转移病变方面发挥着巨大的作用。

4. CTC检测和分离的技术方法

由于血液中循环CTC的频率极低，CTC的富集是CTC分析的首要和最关键步骤。最主要的挑战是从巨量血细胞背景中精准分离CTC，不能有任何的假阳性或假阴性检测并在无损伤的情况下分离CTC，这样才能在分子层面进行后续分析。随着技术的快速发展以及跨学科合作的不断进步，越来越多的CTC检测平台已经出现。总的来说CTC分离技术可以分为2类（图2），（1）基于CTC物理特性（大小、可变形性、电荷）；（2）基于CTC的生物学特性（膜蛋白表型）。基于CTC物理特性的试验显示在执行分离时，区分具有不同生化特性的CTC子群体的偏倚较低，但是由于存在和CTC物理特性相似的血液成分的污染，所以该方法的灵敏度较低。基于CTC表型特性的方法通常灵敏度很高，但是由于针对阳性和/或阴性选择的特定抗原的抗体，该方法可能会错过一些CTC的子群体。

基于CTC大小的过滤方法依靠的是大部分CTC比正常白细胞大这一事实。过滤器的孔径为6—8μm；因此，大部分的白细胞会穿过过滤孔，但体积较大的CTC会留在过滤膜上。该方法的优势是简单且不需要繁杂并且可能对CTC完整性造成损害的预处理步骤。基于CTC大小的过滤系统使用方便，但是仍存在局限性如CTC大小的范围等问题。该方法可能会损失体积较小的CTC。为了克服这一缺点，正在开发同时采用基于CTC大小和可变形性的技术平台。

采用表面蛋白分离CTC的方法利用CTC膜表达的特殊抗原如EpCAM将其从其他血液成分中区分出来。特定的血细胞标志物也可用于CTC的阴性选择去除产生污染的血细胞，例如CD45（淋巴细胞常见抗原）。应用最广泛的CTC检测平台之一是CellSearch，该平台主要基于CTC的EpCAM表达，目前该平台是唯一经过美国食品药品监督管理局批准用于CTC计算且经过临床确认的平台。CellSearch系统采用与铁磁流体纳米粒子结合的EpCAM抗体标记CTC。在磁场中分离后，分离的细胞采用细胞角蛋白（CK）8/18/19，4，6 diamidino-2-phenylindole和pan-leukocyte标准CD45进行免疫荧光染色。一些癌症类型已经确认了CellSearch。利用每7.5mL血液5个CTC的临界值，通过CTC计数可以将癌症患者进一步区分为不同的无进展生存（PFS）率和总存活（OS）率的组。最近，CellSearch系统的应用得到进一步发展，其可以作为第一富集步骤，随后可以联合不仅能计数而且能进行后续批量或单个CTC分析的技术。除了基于EpCAM的阳性CTC检测方法外，还有一些富集CTC的阴性方法。这些方法利用有核血细胞如CD45的表面标志物来标定血细胞并采用免疫磁性粒子将其清除。

具有更高灵敏度的微流体平台能采用进一步的CTC分离方法分离罕见的CTC。2007年，Nagrath等人的报告称第一代EpCAM阳性CTC微流体捕获设备已经出现。随后，得到强化的第二代和第三代微芯片平台接连出现，这两代设备分别采用herringbone-chip（HB-Chip）和CTC-iChip，处理性能、处理速度和应用性都得到了改善。在一个小型前列腺癌患者群体中采用HB-chip的结果显示15名患者中的14人呈CTC阳性。这些患者的亚组中还检出了CTC簇。HB-chip经过进一步调整后，利用抗间叶细胞和抗上皮标志物的鸡尾酒抗体可以从乳腺癌患者中检出CTC（Yu等人的研究）。为了克服特异抗原分离的局限性，2013年同时利用阳性选择和阴性清除模式的CTC-iChip得以出现。该设备能检测广泛的癌症类型中的CTC，超越了已知的表位。而且，分离未固定的细胞提高了核酸的质量，实现了强大的后续CTC分析。但是，该微流体芯片在CTC检测方面的应用还需要更大的患者群体进一步确认。

在所有基于EpCAM的CTC检测方法中，GILUPI CellCollector是唯一的可以避免在小量血液样品中寻找CTC这一局限性的技术：该技术利用具有抗EpCAM抗体功能的不锈钢丝插入肘部静脉血流中——支持在体内进行CTC的分离和计数。钢丝在血流中停留30分钟，相对于采集大约1.5L的血量，提高了分离CTC的机会。作为唯一的体外分离设备，获得了在患者中进行临床应用的CE认证。从2012年首次出现开始，CellCollector获得了CTC领域越来越多的关注。在一项肺癌研究中，Gorge等人的报告显示CellCollector的CTC检测灵敏度高于CellSearch。他们的研究还发现除了CTC计算功能外，CellCollector有通过后续dPCR分析进一步评估分离的批量细胞的目标基因的突变状态的可能。和其他新试验一样，CellCollector需要在大型临床试验中进行确认，在不远的将来我们就能看到现行研究的报告。最近出现了新版本的CellCollector——Catch And Release Detector，我们的研究证明了该试验。该试验同样为体内CTC富集，随后进行细胞分离步骤的设计，该试验捕获的CTC可以被释放并被后续单一CTC分析采集。尽管该试验尚未得到临床使用的认证，但是我们的体外研究得到的数据表明不仅细胞可以得到高效释放，而且可以回收具有高质量DNA的细胞，能够进行微阵列比较基因组杂交（array-CGH）和下一代测序（NGS）。

RT-qPCR是一种用于研究RNA表达且具有高灵敏度和高特异性的常规技术。AdnaTest系统结合具有qPCR分析的免疫磁性粒子EpCAM阳性细胞富集循环CTC进行检测和特征描述。以特殊癌症转录为目标的试验现在已经可以用于几种癌症，这些癌症包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。为了证明结合qPCR能否提高CTC检测的灵敏度，有些已经执行了一些MBC研究并将之与AdnaTest和CellSearch相比较。比较的结果显示并不一致。Muller等人执行了一项包括254名MBC患者的研究，证明在预测临床结局方面，CellSearch系统的性能优于AdnaTest。另一项比较MBC的研究显示AdnaTest和Cells在CTC鉴别方面取得的结果类似，CTC阳性样品的检测率比较一致，达到了80%。在一项比较CellSearch、AdnaTest和灵敏多重RT-qPCR进行CK19HR乳腺珠蛋白检测的试验中，Van der Auwera等人的小组发现多重RT-qPCR是检测CTC最灵敏的技术。

为了区分凋亡的CTC和存活的CTC，几年前Alix-Panabie`res的小组开发了一种功能性细胞培养实验——上皮免疫斑点（EPISPOT）试验。该试验基于活细胞在短期培养的环境中能分泌和释放蛋白质的原理。这些蛋白可以被预先包被在膜上的抗体捕获。因此，EPISPOT试验能基于免疫斑点计数对存活的CTC进行检测和定量。该试验的优势在于检测并不以特定的CTC亚型作为目标蛋白，能够基于研究目标自由选择CTC类型。该试验已经在一些癌症类型中得到了确认，包括乳腺癌和前列腺癌。此外，这种多参数技术是目前唯一一种能检测存活单个CTC分泌的蛋白图谱的技术，但是该技术目前还不能实现对检测到的CTC进行进一步分离和分析。最近，Kushke等人将EPISPOT试验和CellCollector和CellSearch系统相结合，得到的报告显示与使用单一技术相比，联合几种技术获得高风险前列腺癌CTC累积阳性率较高。他们的研究揭示联合采用不同的技术能使CTC检测获益并提高不足的阳性率。

除了专门用于CTC检测的平台之外，新出现的技术能够实现后续的CTC排序分类。其中一项著名的新技术是DEPArray系统，该系统能基于双向电泳（DEP）处理单个细胞。和CTC富集方法如CellSearch结合，DEPArray能有效地对单个CTC进行分类，并将其转移到后续分析用的试管中。

5. CTC的特征

现有的研究已经将CTC从简单的计数扩展到更加强大的分子分析。CTC的特征描述经历了几个阶段：从基础细胞表型的免疫化学特征到高分辨率基因组分析；从CTC的大批量分析到单个细胞的分子特征描述。采用最新的和最强大的CTC富集和计算方法，现在已经可以对罕见细胞进行准确的特征描述。最常用的方法在杂交、array-CGH和NGS分析中采用PCR和荧光方法。有意思的是，实体瘤中的一些得到了良好描述的遗传不稳定性及转移事件证明了不同癌症类型的CTC也不同。例如，前列腺癌中成功鉴别出TMPRSS2-ERG基因融合、AR变体的获得或PTEN的丧失。其他例子包括MBC中HER2的过表达，肺癌中EGFR突变和黑素瘤的BRAF突变。这些CTC特征研究分别提供了癌症的实时生物学信息，指导了病例的临床管理，还有助于加深对癌症转移和演进的理解。

5.1  CTC表型特征的分析和鉴别

CTC表现出多种形式的表型异质性。文献中记述的表型包括上皮、间叶细胞、干细胞样细胞和CSC。每种表型都有不同的标志物，对治疗决策的制定之意义也不同。此处我们将更加详细地叙述不同的表型。

5.1.1 上皮表型

CTC的一般定义是，它们是一种具有完整胞核、细胞角蛋白（如细胞角蛋白8/18）和/或其他上皮标志物如EpCAM表达呈阳性，白细胞标志物CD45表达呈阴性的细胞。上皮表型可以被认为是CTC的经典特征。大部分分离CTC的技术都是基于这种表型。

5.1.2  间叶细胞表型

多种癌症中重复观测到EMT过程。失去上皮标志物而获得EMT表型被认为与较差的预后和药物耐药性有关。在血液中循环的CTC可能会在迁徙中失去其上皮标志物。因此，通过检测CTC亚组来描述其特征并更好地理解癌症状态十分关键。一些CTC分离技术侧重于上皮标志物，可能会错失间叶细胞表型的CTC。因此，开发了一些EpCAM之外的富集技术，如阴性富集。阴性富集的原理是仅去除CD45呈阳性的血细胞并进行过滤。Yu等人描述了乳腺癌患者的CTC的EMT标志物的特征。他们利用RNA原位杂交试验并从纯上皮与全间叶细胞表型杂交鉴别了涵盖全谱系的CTC。除了常见表达的EMT标志物，一些研究在MBC患者中基于多种标志物如CD46或CD49f（基于CD49f的CTC选择改进了跨乳腺癌亚型的检测）检测EpCAM呈阴性的CTC；在结肠直肠癌患中检测丝束蛋白3呈阳性的CTC（丝束蛋白3是一种新型CTC标志物，该标志物经受了上皮—间叶细胞的转化并与结肠直肠癌的预后有关）。

5.1.3  杂交（上皮/间叶细胞）表型

除了EMT过程，一小部分CTC似乎从上皮表型转化为更加间叶细胞化表型。这种转化被认为是一种平滑的过程，使得CTC表达上皮和间叶细胞2种标志物。Lecharpentier等人从转移的非小细胞肺癌患者体内分离了同时表达波形蛋白（间叶细胞标志物）和细胞角蛋白的CTC。

5.1.4  循环干细胞

目前，一些表面标志物已经得到成功检测并用于此类细胞亚型的富集。干细胞标志物ALDH1通常被认为是间叶细胞表型的CTC共表达的标志物。一般来说具备功能细胞样表型的CTC可能更加耐药并可能具有转移的潜力。从MBC患者体内分离的CTC中，一大部分的CTC存在ALDH1表达阳性（69%），表明一些CTC不仅表达EMT标志物还会表达干细胞标志物。

在这种情况下，一种CTC能存在不同的表型，相同的患者也可能存在具有不同表型的CTC，这表明了不同情况的动态变化。但是我们目前尚不清楚的是哪种表型“更加危险”，或哪种表型更容易形成转移病变。每种表型的存在及其重要性都得到了普遍接受，我们需要工具来研究DNA、RNA上的单个细胞并在蛋白质组学的层面进一步理解这些细胞的生物学特性。在后续章节中，我们将侧重每种生物学目标单个细胞不同的分析方法。

5.2  RT-qPCR分析的CTC特征

作为一种潜在的肿瘤分析物质，平常可以采用近乎无创的方式轻易地从血液中获得CTC。除了CTC的计数之外，CTC包含的分子信息是一种有前景的方法，能加深对治疗反应和疾病进展的理解。RT-qPCR是一种普遍用于CTC分子特征描述的方法。Lianidou等人从事CTC分子分析工作多年，他们开发了一种多重PCR结合液态微粒微阵列的方法同时检测多个基因的表达水平。在2011年，他们的小组研究乳腺癌CST6，BRMS1和SOX17的启动子甲基化状态，并断定癌症抑制基因和转移抑制基因的甲基化是CTC出现的标志。最近在一个高风险前列腺癌患者群体中，他们对已经确认的以上皮标志物、干细胞标志物、EMT标志物、PSA、TMERSS2—ERG融合丝束蛋白3为目标的RT-qPCR试验进行了检验。他们利用CellSearch系统进行检验，报告了87%的CTC样品阳性率，表明至少上述目标中的一种出现了阳性表达。该试验似乎具有在正常造血细胞背景中区分CTC的潜力，因为健康个体中没有检出上述目标。其他研究也显示在CTC mRNA层面检测CK19可能是无病存活和化疗耐药性的独立预测因素。

5.3  批量/单一细胞层面的高分辨率CTC特征

精准医疗需要准确分析疾病基因组特征的能力。利用CTC作为鉴别基因组变异的工具能支持或补充传统的活组织检查。尤其是不可触及转移组织或重复活检采样不可实现的情况下。CTC用于疾病监测非常有用。CTC动态变化的综合分析能提供一致的、近乎无创的的疾病进展监测方法，性能优于在治疗开始时对原发组织进行一次分析。

过去，生物和遗传分析通常都基于来自细胞群体的大量物质。但是，目前测序技术已经取得了巨大的进步，因此目前可以实现单一细胞测序。该技术已经从基于单一PCR的分析前进到单细胞NGS和单细胞RNA测序。目标是描述单一细胞的基因组特征。

一个二倍体人体细胞包含7pg DNA。分子技术通常需要较大数量的基因组DNA。为了获取足够的材料在全基因组层面分析单个细胞，需要对基因组DNA进行扩增。在过去的25年中，一些全基因组扩增技术（Whole Genome Amplification WGA）已经出现，现在这些技术变得更加可靠。这些扩增方法基于PCR或多重置换扩增。每种WGA方法具有其自身的特点，如扩增偏倚、基因组覆盖、等位基因漏失和优先扩增。应该基于研究的问题和后续应用选择适当的WGA方法。

在单一细胞层面研究CTC需要非常先进的平台来应对2个主要的挑战：罕见细胞和低模板量（DNA/RNA/蛋白质）。一些研究显示原发肿瘤和转移肿瘤的CTC具有一些相同的特征。很明显，每个细胞都是独一无二的，每种CTC变化的分析也是动态可变的。2014年，Lohr等人的报告称一个综合平台能够对源于前列腺癌患者的CTC进行分离、鉴别和外显子测序。前列腺癌CTC的分析极为重要，因为这种癌症可能会转移到骨骼，这是活检不可触及的部位。他们的数据揭示可以利用单一核苷酸变体进行肿瘤演进过程研究、监测癌症进展并通过跟踪CTC执行基因型导向疗法，尤其是需要进行转移癌症采样时。

为了完全描述CTC的特征，许多研究结合不同的方法来将单一CTC作为分子分析的纯粹样品。一个例子是结合CellSearch（富集前步骤）和DEPArray（单细胞选择）技术。这种联合技术已经成功地应用于一些研究并显示出同一个患者的CTC存在分子异质性，远端转移组织的CTC遗传特性与原发肿瘤组织也不同。为了将CTC作为诊断工具使用，Polzer等人开发出一个对乳腺癌患者的CTC进行分子特征描述的工作流程。首先，他们利用CellSearch系统富集CTC，接着采用DEPArray系统区分单个CTC。之后使用Ampli1试剂盒扩增该细胞并采用array-CGH和测序进行分析。他们研究ERBB2（HER2）、PIK3CA点突变的拷贝数扩增以及原发肿瘤和CTC中的全基因组拷贝数变化（copy number alternations CNAs），结果显示大部分乳腺癌患者中，CTC同样具有ERBB2扩增。有意思的是，他们观测到CTC和原发瘤之间PIK3CA突变存在较高的不一致率——66%。但是作者并未执行原发瘤亚克隆分析排除先前存在的克隆。

CTC特征还可以用于监测治疗时疾病的进展。Dago等人分离了CTC，扩增了DNA并研究了去势耐受性前列腺癌患者的CTC的CNA。他们利用NGS方法分析单一细胞的全基因组拷贝数并研究了化疗和靶向疗法执行期间CNA的变化。在靶向疗法期间出现了一个新的克隆，表明MYC和androgen受体（AR）的扩增，说明对抗荷尔蒙疗法存在耐药性。另一个临床相关应用是对癌症相关基因进行大规模平行测序。Heitzer等人利用array-CGH研究了结肠直肠癌患者的CTC以及68个与结肠直肠癌相关基因。同时他们利用相同的癌症相关基因对原发肿瘤进行深度测序。通过这个方法，他们发现CTC中检测出的一些突变在亚克隆层面上原发肿瘤也可以检出。根据数据评估消耗的时间和成本，这种研究CTC的靶向方法对减少易管理部分的测序数据非常有用。

CTC另一个非常强大的用途是CTC衍生的外植体（CDX）。Hodgkinson等人证明小细胞肺癌患者的CTC在免疫力低下的小鼠身上可以致癌。该致癌性CDX在体内容易运动并能作为研究药物耐药性机制的可行方法。

一个理解潜在的肿瘤转移形成生物学的重要方法是癌症细胞的转录组分析。基于mRNA的方法可以更详细地了解不同细胞类型的功能和活动。对于研究肿瘤组织中的基因表达，微阵列研究易于执行，但进行来自临床样品的单个细胞的mRNA研究仍然是一项技术挑战。一个成功的方法是利用癌症相关基因的转录图谱。Powell等人利用87个基因研究乳腺癌细胞系和乳腺癌患者CTC。基于表达数据，他们将CTC分为2类：一类具有较强的表达细胞，另一种具有较弱的表达细胞。他们发现与转移有关的基因以及与EMT有关的基因（VIMENTIN、ZEB2）表达相对稳定，表明其为侵袭性表型。在该研究中，他们第一时间展示了将个体CTC基因表达作为单个细胞急性研究的可行性，而不是作为混合的CTC研究。在相似的研究中，Chen等人研究了转移的前列腺癌的CTC的EMT相关基因。基于84个EMT相关基因和参考基因的表达，他们能鉴别出在去势耐受性癌症中表达的EMT相关基因的亚组。有趣的是，他们提供了独特的的EMT基因标签，尽管CTC代表高度异质性细胞群体。

为了宏观地了解基因表达，微阵列或mRNA测序是理想的方法选择。但是和单一细胞DNA分析类似，单一细胞的mRNA需要首先进行全转录组扩增。一般来说，RNA被逆转录为cDNA，随后在进行测序或基因表达微阵列分析前进行文库制备。一项回顾性研究已经对单一细胞RNA测序进行了回顾。在Yu等人进行的研究中，他们对内生小鼠胰腺癌模型衍生的CTC进行了mRNA测序。作者鉴别发现CTC中Wnt2的富集，表明失巢凋亡的抑制、转移倾向加强、锚非依赖性球体的形成。他们断定WNT信号的非经典活动可能会促进胰腺癌的转移。在后续研究中，采用非监督分级群居分析了CTC的mRNA图谱，揭示不同于匹配原发肿瘤和癌症细胞系的3种远端表达模式。第一种与CTC相关的表达模式高度表达上皮标志物，成为“经典CTC表型”；第二种与CTC相关的表达模式过表达血小板标志物如CD41和CD61，表明该CTC被血小板覆盖。最后一种表达模式显示细胞增生标志物MKI67的富集。有意思的是，作者认为的经典CTC表型是上皮细胞钙粘蛋白的一般下调和EMT间叶细胞转录的上调。值得注意的是，上调的间叶细胞基因在CTC之间的表达具有多相性。经典CTC表型的一般主题是与基质相关的细胞外基质蛋白的表达，表明其在肿瘤微环境中发挥活跃的作用。

5.4  体外培养的功能化CTC特征

认为培植体内的CTC是严峻的挑战主要因为CTC在循环中非常罕见。CTC非常脆弱的特点和不为人知的恰当的CTC培养条件使得它们难以培养。此外，目前大部分的技术是在固定步骤之后鉴别CTC，不能进行后续培养。尽管存在这些挑战，但是一些关于CTC培养的研究已经陆续发表。有意思的是，尽管许多CTC源于上皮，但是可以在悬浮状态下进行培养而无需粘附到培养盘的底部。

2013年，Zhang等人利用乳腺癌患者脑部转移病变的样品第一次成功地进行了长期CTC培养。具有特定脑部转移标志物“HER2+/EGFR+/HPSE+/Notch1”的EpCAM阴性CTC系被研发和鉴别出来。利用异种移植小鼠模型，这些细胞被证明具有高度的侵袭性并能转移到远端器官位点。Yu等人利用微流体设备大量分离CTC。分离的CTC随后被置于条件经过调整的体内培养。他们能从6/36名患者中建立CTC系并培养这些CTC超过6个月。被培养的CTC在悬浮状态下增殖良好并形成了细胞球体。此外，在经过细胞分裂后，培养的CTC发生变化并形成了粘性单分子层。这些被培养的CTC不仅与原发CTC具有一致的细胞学特征还表达标准的CTC标志物如细胞角蛋白阳性和CD45阴性。建立的CTC细胞系被用于检测药物敏感性和一些具有一致结果的患者既往病史确认的数据。

另一个CTC体外培养的例子是将富集的CTC培养2天来执行EPISPOT试验，检测特殊的分泌的蛋白质的水平。最后，一个研究小组建立了一个微流体系统利用培养的来自患者的CTC评估患者的药物反应。该CTC聚集分析试验在一个系统中结合了细胞培养和药物筛查。

6. 日常临床诊断的CTC评估

目前，大部分临床研究将CTC计数作为转移癌症患者的预测性标志物。尽管众所周知CTC与癌症的转移有关，但是一些研究还是显示CTC可能会在没有转移证据的癌症早期出现在血液中。CTC的早期散播可能是癌症进展早期检测的可用事件。在临床实践中，理想的治疗应该及早进行，将癌症限制在局部位点，避免不必要的毒性。目前的诊断指标如肿瘤大小、病理学特征和转移状态被认为不足以适应个体化医疗时代的治疗。2010年，新的cM0（i+）分类被添加到新发布的癌症分期系统中，定义包括循环血液或骨髓中存在可检测的肿瘤细胞但不存在其他转移的患者。这强调了CTC的存在是转移形成的先决条件。

CTC的临床应用包括下列几个方面：第一，CTC可以用做实现更好癌症管理的预后标志物。多个癌症实体的研究利用CTC作为疾病管理标志物，提供了有前景的证据。特别是，许多CTC计数在基线水平的临床试验与PFS（progression-free survival无进展生存期）和OS（overall survival总生存期）有关。例如，利用CellSearch系统，CTC计数大于5个/7.5mL血液的乳腺癌、结肠直肠癌和肺癌患者的PFS和OS较短。

第二，治疗干预反应的评估，提供疗法选择的信息。在SWOG S0500 III期临床试验中，目标是利用CTC检测对患者进行分层实现个体化治疗，5个CTC作为临界值用于在一线化疗3周后将MBC患者进行随机化。CellSearch系统检测的CTC计数大于5个/7.5mL血液的女性被给予替代化疗，基于先前的研究CTC计数被认为与较短的PFS和OS有关。但是最后，这两组患者的PFS和OS没有差别，表明患者没有从治疗期间根据CTC计数进行的疗法调整中受益。

第三，CTC的研究不被限制在转移疾病：一些早期癌症试点研究在乳腺癌和前列腺癌患者中执行，目的是利用CTC计数作为指标进行癌症转移和复发的早期检测。

最后，CTC的临床价值不再限制于计数。越来越多的研究显示利用CTC进行后续分子分析加深对CTC异质性的理解是未来CTC研究的趋势。除了EpCAM外，大量的不同的标志物用于检测不同的CTC亚群体。这些标志物包括EMT相关标志物、CSC样标志物和癌症类型相关标志物，如乳腺癌的HER2和前列腺癌的AR-V7。一项研究显示不同类型的标志物的表达在癌症治疗、进展和康复期间不仅反映不同的细胞亚组，还显示CTC的动态变化，这表明间叶细胞CTC与疾病进展和疗法耐受性有关。

7. 结论

总之，大量的证据支持CTC可以作为精准医疗重要的生物标志物。新技术能让我们更详细地研究CTC的生物学特点。但是，尽管CTC研究取得了令人欣慰的进展，但是CTC离开原发位点并形成转移病变的方式和时间还需要进一步了解。CTC是否不断地均匀分布在循环血流中尚未可知，这是通过标定迁徙中的CTC进行治疗干预抑制转移的关键。在CTC的临床应用中，大部分的试验仍在利用CTC计数与预后之间的关系。新兴CTC特征描述领域为设计个性化治疗策略、提高已分层患者的治疗效果提供了新的机会。CTC能否成为实现精准医疗的途径还需要设计良好的多中心临床试验来确认；而且性能稳定、灵敏度高的CTC检测平台需要进一步确认。

摘自《Clinical Chemistry》，版权归其所有，仅供内部参考

编译：张凯

审校：韩泯