血小板在血栓与止血方面的功能的检测
邓新立，中国人民解放军总医院南楼检验科主任。现任中国老年医学学会检验医学分会总干事，全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会常委，中国合格评定国家认可委员会医学专委会委员、医学实验室主任评审员。
血小板是一种无核的血细胞，主要来源于骨髓中的巨核细胞。其主要功能是参与血栓与止血。其在外周血的正常的生存周期约为五至七天，在其生存期内，体积逐渐变小，最终由中性粒细胞或巨噬细胞转移至脾脏裂解后排出体外[1]。当然，关于血小板的功能，有很多新的发现和观点，但现在临床实验室大多检测的是血小板在血栓与止血方面的功能，本文将围绕这方面进行阐述。
一、血小板在血栓与止血方面的功能
血小板广泛参与人体血栓与止血的各个过程，其功能主要体现在四个方面：粘附、聚集、释放和促凝。
血小板粘附功能的受体包括：GPⅠb-Ⅸ、GPⅡb-Ⅲa、GPⅠa-Ⅱa等。参与血小板粘附功能的粘附蛋白主要有：VWF、纤维连接蛋白、胶原等。GPⅠb-Ⅸ、GPⅡb-Ⅲa主要与VWF或纤维连接蛋白结合，而GPⅠa-Ⅱa的配基为胶原。GPⅠb是血小板的主要粘附受体，如果没有它的参与，血小板均不能粘附于内皮下组织；它也是血小板上VWF的主要受体，在流动条件下也是纤维连接蛋白的主要受体。VWF和纤维连接蛋白是主要的粘附蛋白，只有这两种粘附蛋白能在流场中支持粘附作用；低剪切率时，纤维连接蛋白能替代VWF足够支持粘附作用，故VWF在粘附作用中的主要意义是支持高剪切率时的血小板粘附[2]。
血小板聚集主要表现为两种形式：一种是以VWF作为连接蛋白，通过VWF与血小板上GPⅠb-Ⅸ、GPⅡb-Ⅲa的结合，两个或多个血小板聚集在一起；另一种是以纤维蛋白（原）作为连接蛋白，通过纤维蛋白（原）与血小板上GPⅡb-Ⅲa的结合，两个或多个血小板聚集在一起。
血小板在凝血的各个阶段均发挥重要作用。血小板暴露磷脂酰丝氨酸和因子Ⅴ，进而提供促凝表面，使X酶和凝血酶原酶复合物在血小板表面有效组装，大大加速了凝血酶生成。通过GPⅥ与胶原结合而活化的血小板，以及在凝块形成期与纤维蛋白原结合的血小板，确保正常止血。
血小板可释放多种活性物质参与血栓与止血过程。其α颗粒可释放纤维蛋白原、血小板第4因子、组织蛋白酶A、组织蛋白酶D、酸性水解酶；其致密颗粒可释放5－羟色胺、ADP、ATP、钙离子、肾上腺素、抗血纤维蛋白酶、焦磷酸等。
二、血小板功能检测的样本管理
血小板功能分析在临床的使用还存在很多问题，但比较突出的，通过实验室、标本采集和运送部门的质量管理可以解决的就是样本问题。
1. 采血时机
（1）建议患者空腹或饭后两小时以上进行采血，前一餐尽量不
进高脂食物，避免脂血；患者至少在采血前2小时停止摄入咖啡因，至少在采血前30分钟禁止吸烟；同时，建议患者采血前避免剧烈运动[3-5]。
（2）观察药物疗效在用药期间即可采血，停药后血小板功能恢
复与用药量相关，一般停药后10天左右血小板功能可大致恢复正常[6]。
2. 抗凝剂、采血管
（1）抗凝剂的使用因方法而异，如采用枸橼酸钠作为抗凝剂，
浓度为109mmol/L或129mmol/L（通常为109mmol/L的二水柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O）；抗凝剂与静脉血液的体积比为1:9[3-4,6-9]，HCT过高或过低者应对抽血量进行调整，建议参考凝血常规调整公式：抗凝剂的用量（ml）=0.185×全血量×（1-HCT）；
（2）含有浓度为3.2%或3.8%的枸橼酸钠抗凝剂的塑料真空采血
管，推荐使用厚壁双层硅化内壁（无死腔）真空采血管；
（3）使用采血管时应避免直接提拉采血管帽，以免漏气导致抽
血不顺利[10-11]。
3. 采集方法
（1）使用19-21G的针头抽血，推荐使用蝴蝶针，止血带在针
插入血管后应立即松开；
（2）采血过程中尽量减少对血小板的活化，不得拍打采血部
位、尽量不使用扎带、血小板功能检测血样最好选择收集第二管血，如患者本次采血只行此项检测则建议弃去第一管血，不建议采用血管通路采血以免外源肝素影响；
（3）采血后，立即轻轻颠倒混匀采血管10次[4]。
4. 检测前保存条件
（1）采血样本后，血液样本应保存在密闭的真空采血管中，放
置在室温环境（20-25℃）；
（2）传递过程应在室温（20-25℃）下保证采血管直立，严禁
摇晃或震动，不建议采用气动管道物流传输系统运送标本；
（3）采血后，建议2小时内完成检测，不超过4小时[4,9,12-13]。
5. 检测前标本处理
（1）血液样本在离心前需在室温环境（20-25℃）放置至少15
分钟；
（2）富血小板血浆的提取：在室温下，用低速离心机在160g的
相对离心力下离心10分钟得到富血小板血浆（PRP），用移液器小心取出所需要体积的富血小板血浆（PRP），不要触及白膜层及红细胞；
（3）贫血小板血浆的提取：在2000g的相对离心力下继续离心
10分钟得到贫血小板血浆（PPP），用移液器小心取出所需要体积的贫血小板血浆（PPP），不要触及白膜层及红细胞；
（4）建议使用水平转子离心机，离心机应自然停止，避免制动
停止，建议离心后将标本放置一至两分钟待血小板与血浆界面稳定后再行检测；
（5）如采用光学法检测，肉眼可见的溶血、脂血及黄疸的富
血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP）标本应弃除[3-4,6-8,14]。
6. 检测适宜的血小板浓度范围：富血小板血浆（PRP）血小板浓
度应大于150×109/L，如血小板浓度较高不建议用贫血小板血浆（PPP）调整，调整后将改变血样标本自身性质[3-4,8,15]。
7. 离心后标本保存条件：离心后的血浆标本应在室温环境（20-
25℃）放置，并尽快进行检验，建议2小时内完成检测，不超过4小时[4,12-13]。
三、常用的血小板功能分析仪器
1. 光学比浊法血小板聚集仪
它是经典的血小板聚集测定方法，是金标准。其测定原理是：离心后取富血小板血浆，加入诱聚剂前后检测透光率的改变反映血小板聚集功能；透光度最大时得到血小板最大聚集率。其特点是：价格便宜，可检测多途径血小板抑制情况（AA/ADP/胶原/肾上腺素）；是大型临床研究采用最多的血小板功能检查方法，累积的证据最多。其不足表现为：需专业人员、用血量大、检测时间长、重复性不高、临界值尚未标准化，不同研究存在差异。
2. VerifyNow
其测定原理：全血血样吸入检测池内进行光电比色检测，通过比较血样与诱聚剂致血小板聚集前后光通量的改变测量血小板聚集率。其特点是：全自动化床旁检测设备，简单、快速。其不足表现为：价格较贵，红细胞的存在对检测结果有干扰，也有用血量大、抽血条件严格等缺点。
3. 全血连续计数检测法血小板功能分析仪
其测定原理为：仪器对全血中血小板原始数量检测后，加入诱聚剂诱导血小板聚集，继续在不同时间对血小板数量进行连续计数检测，通过对比原始血小板数量与加入诱聚剂后血小板数量的变化及血小板数量下降的速度，评价血小板功能水平。重复性好、可以标准化、使用全血，但需要更多的临床资料支持。
4. 血栓弹力图仪
其测定原理为：根据血样凝固的强度、速度对血液凝固总体过程测量。其存在主要问题是：较难区别血液中各具体因子在血样整体凝固过程的独立贡献。结果误差较大；检测用血量大，且同时需要枸橼酸抗凝血和肝素抗凝血；操作耗时长，检测时间＞30分钟/T。
5. PFA-200
它是一种模拟体内初期止血的测定仪，又名“外出血时间”，结果以血小板闭塞网眼停止血液流动的“闭合时间”表示。故可以检测与血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关的疾病，血栓性疾病、GPⅡb/Ⅲa拮抗剂等抗血小板药物监测、血小板贮存、血管性血友病及DDAVP治疗、肝肾功能疾病等。与出血时间试验相比，在诊断vWD中的敏感性＞90%。
四、血小板功能分析的临床应用体会
1. 检测的准确性
血小板功能检查很难要求其准确度，因为测定的是细胞而非单一物质，而且涉及复杂的反应过程。所以建立本实验室的参考范围就非常重要，不然实验室就无法准确判断血小板功能的变化。另外，实验室也要注意积累临床经验，掌握各种疾病状态下，血小板功能的变化规律。
2. 检测的重复性
既然血小板功能分析的准确度很难要求，那就要特别重视血小板功能分析的重复性。我们要尽量选择操作简单、自动化程度高的仪器，要注重操作的熟练度，另外尽量寻找稳定的指标来分析血小板功能。
3. 结合其它检验指标系统分析血小板
人体血栓与止血系统包括凝血系统、抗凝系统、纤溶系统、血小板、血管等。在正常情况下，各系统间维持动态平衡。血栓形成是系统作用，与多种因素有关。仅凭单一指标判断是否有血栓形成或者是血栓形成倾向，都是非常不可靠的。不同检测方法反映血小板功能的不同方面，注重方法和结果的综合利用。
4. 要注意动态观察
血小板寿命约仅十天，血小板功能检测所能预测或反映血小板功能状态的时间是有限的，血小板功能的动态监测往往更有价值。
血小板功能分析是临床上非常有价值的一类实验，但由于检验质量等一系列原因，其在临床未得到应有的广泛使用。实验室应提高检验质量，加强与临床的沟通，以促进血小板功能分析更好地运用于临床。
参考文献
1. Michael Holinstat. Normal platelet function[J]. Cancer Metastasis
Review. 2017,26(2):195-198.
2. 包承鑫。血小板与血栓形成[J]。微循环技术杂志，1993，3：168-
169.
3. Cattaneo M, Cerletti C, Harrison P, et al. Recommendations for
the standardization of light transmission aggregometry: a consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH[J]. Journal of Thrombosis & Haemostasis, 2013, 11(6):1183-1189.
4. Harrison P, Mackie I, Mumford A, et al. Guidelines for the
laboratory investigation of heritable disorders of platelet function[J]. British Journal of Haematology, 2011, 155(1):30-44.
5. 武宝爱，吴丽君.不同运动形式对人体血液流变性及血小板功能的影
响[J]. 成都体育学院学报，2012，4：81-85.
6. 丛玉隆，张岩，殷宗健，等. 不同剂量阿斯匹林抑制血小板聚集功能
时效探讨[J]. 中华医学检验杂志，1998，21 (5)：263-265.
7. Cattaneo M, Hayward C P, Moffat K A, et al. Results of a
worldwide survey on the assessment of platelet function by light transmission aggregometry: a report from the platelet physiology subcommittee of the SSC of the ISTH.[J]. J Thromb Haemost. 2009, 7(6):1029.
8. Hayward C P M, Moffat K A. Platelet Aggregation[J]. Platelets,
2013:559-580.
9. 丛玉隆，李祖兰. 血小板功能检测进展及临床应用.
10. 许秋芳，蔡丽萍. 抗凝管对血小板聚集率测定的影响[J]. 中国血液
流变学杂志，2006，16(2):290-291.
11. 丛玉隆，吴丽媛，殷宗建. 凝血试验真空管“死腔”所致APTT，
PF4偏差探讨[J]. 临床检验杂志，2002，20(5):263~264.
12. 陈兴明，李祖兰，刘香玲，等. 血标本室温放置时间对血小板聚集
的影响[J]. 现代检验医学杂志，2013，28(6):76-77.
13. 朱远，关杰，田月强，李莉，平牧野，任军伟，邓新立，丛玉隆。
标本放置时间对PL-11检测血小板功能的影响[J]. 解放军医学院学报，2015，36(6):611-613.
14. 李涛，屈晨雪，王建中，等. 光学比浊法血小板聚集试验的标准化
研究[J]. 中国实验诊断学，2010，14(12):2041-2043.
15. 李祖兰，杨亮程，任军伟，等. 富血小板血浆中血小板浓度对血小
板聚集的影响[J]. 标记免疫分析与临床，2012，19(2):94-96.
