美国FDA对NGS器械的监管简介
Dr. Zhang Cheng
NGS产品的监管涉及很多内容，本文主要涵盖以下几个主题：
1. IVD申请递交文件的主要审查点：
FDA在受理一项体外诊断器械（IVD device）的上市前申请后，首先会关注产品的预期用途和适应症（IU/IFU），因为这是上市前审查器械分类的推动力，是递交文件中最重要的内容之一。对于器械来说，需要说明测量的内容、临床的适应症、特定的目标人群，以及器械的使用地点如临检实验室、床旁监测或家庭内使用。同时也要说明其是作为处方使用还是非处方使用。举例来说，伴随诊断产品属于Ⅲ类，要求上市前申请（PMA），产品可为同类中首个（First-of-a-Kind）或者跟随产品（Follow-On），Follow-On 是指已有上市的同类产品用于检测相同的标志物及相同的用药指导。对于诊断或筛查产品，归为Ⅱ类或Ⅲ类取决于疾病类型，例如Illumina MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Assay（囊性纤维化临床测序分析试剂盒）属于Ⅱ类，而大多数癌症诊断和筛查产品，需要进行PMA申请，如Exact Sciences Cologuard Colorectal Cancer Screening Test（大肠癌筛查检测试剂盒）属于Ⅲ类。还有其他几种情况，如：1）癌症复发风险产品NanoString Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay（乳腺癌预后基因标志物检测试剂盒）属于Ⅱ类，该产品明确用于预测已经诊断并经过手术的乳腺癌患者的复发风险；2）疾病及治疗监测产品Asuragen QuantideX qPCR BCR-ABL IS Kit for monitoring of treatment with Tyrosine Kinase Inhibitors for Chronic Myeloid Leukemia（用于慢性粒细胞性白血病TKI治疗监测）属于未分类的新产品，申请de novo后被归为Ⅱ类；同样通过de novo申请后被归为Ⅱ类的产品还有：3）肿瘤分析产品Memorial Sloan Kettering MSK-IMPACT（可治癌症靶点的综合突变分析）；4）常染色体隐性携带者筛查产品23 and Me Personal Genome Service（PGS）Carrier Screening Test for Bloom Syndrome（Bloom综合征个人基因组服务（PGS）携带者筛查）以及5）健康风险评估产品23 and Me Personal Genome Service（PGS）Genetic Health Risk Test for Hereditary Thrombophilia（先天性血栓形成体质个人基因组服务（PGS）遗传健康风险测试）；此外，2013年获批的Illumina MiSeqDx平台为用于临床的NGS分析平台，属于Ⅱ类豁免510（k）。需要说明的一点是，对于健康风险评估产品，提出豁免限于已获得一次FDA上市许可的遗传健康风险评估系统，即FDA已审查过一次的遗传健康风险评估系统。
其次，递交文件中需要进行器械描述（Device Description），说明器械的原理以及器械的主要组成；另外，如今大多数的检测要在仪器上运行，检测平台包含软件的情况下，需要进行仪器和软件验证（Instrumentation and Software Validation）；由于样本处理及分析前准备（Specimen Handling and Pre-Analytical）会显著影响IVD检测的性能，因此需要说明如何收集、运输、储存及制备样本，如果使用留存样本进行验证，还应证实样本的稳定性；分析性能和临床性能（Analytical Performance and Clinical Performance）无疑是审查中的关注点，以下会有一个主题对此项内容进行详细的说明。标签（Labeling）是另一个审查点，包括包装标签、产品说明书、仪器使用者手册以及宣传材料。
最后，对于Ⅲ类上市前申请，质量体系要求文件（美国标准21 CFR 820、国际标准ISO13485）也是审查的重点。
2. 分析性能和临床性能：
FDA会对分析性能，即检测测量分析物的能力进行审查，在多项国际标准中有对分析性能方法的描述，但是对于NGS检测而言，这些方法还需要进行相应调整。NGS检测常见的分析性能项目包括准确性（Accuracy），精密性（Precision）如重复性和重现性，分析前准备（Pre-analytical）如样本提取及样本质量等，灵敏度（Sensitivity）如空白限、检测限、DNA/RNA 投入量、组织投入量、肿瘤含量等，特异性（Specificity）如干扰物质和交叉反应，稳定性（Stability）如样本稳定性、试剂稳定性、储存效期、上机稳定性、运输稳定性等，另外，有效阈值/系统稳定性（Guard band studies/robustness studies）也是其中一项。由于NGS检测实际上是一个系统，因此需要对整个检测系统进行验证，即从样本收集、样本制备到测序流程中的各个步骤，以及结果报告的生成。
而产品的临床性能所关注的是检测结果与临床情况的相关程度，在多数递交的资料中，通过使用临床样本，观察产品与等效可比器械或其它对比器械检测结果的一致性来证实临床性能。而不需要直接与临床情况作比较。对于临床性能验证所使用的样本，主要考虑以下几点：首先样本能够代表目标适用人群，即明确样本入组或排除标准；其次，用于验证的样本应独立于培训或开发所用样本，即开发和验证所用的样本应为不同来源；最后，临床验证可以采用回顾性分析的方式，但是需要证实回顾样本的稳定性。
3. NGS检测面临的挑战及开发NGS所要考虑的因素：
由于NGS检测的特性使其面临着一些独特的挑战。首先，对于NGS，尚未建立完善的对比方法及参考物质，并且NGS一项检测往往用于多种基因的多种变异，也会涉及不同的变异类型包括单核苷酸变异（SNVs）、插入缺失（indels）、拷贝数变异（CNVs）、融合等。因此很难实现验证每个变异。其次，同一种分析物存在多种样本类型，如血液、FFPE、唾液等，每种样本制备及处理过程的差异可对检测结果产生很大影响。此外，由于技术及对生物标志物理解的快速进展，会导致临床实践与研究相交织。最后，大量数据的分析、储存以及分析 软件的标准化都是NGS亟待解决的问题。面对这些挑战，在NGS检测开发阶段要考虑到以下因素：第一，选择代表性的变异以覆盖不同的变异类型、变异大小以及基因组区域从而合理的证实器械的整体性能；第二，对于罕见变异，可使用人造样本补充患者样本。但是要求进行样本可替换性的研究。举例来说，由于评估器械分析性能的罕见突变临床样本不易获得 ，因此在部分分析验证研究中如空白限、检测限、精密度等，采用细胞系补充临床样本。这种情况下，需要评估临床和细胞系样本之间的器械性能是否相似。具体的方法是：建立常见突变临床样本的系列稀释水平，然后建立相同浓度（系列稀释）的常见突变细胞系，建议比较时涵盖多种突变类型，进而评估并比较临床样本和细胞系之间的器械性能；第三，在NGS工作流程中的关键步骤建立QC指标；第四，采用充分验证的正交方法进行准确性研究；第五，将软件作为系统的一部分进行验证；最后，要利用统一的标准及数据库。为了规范NGS监管，FDA在2016年7月8日发布了两项重要的草案指导文件，分别是《FDA对基于NGS的用于诊断生殖系疾病的体外诊断器械（IVD）的法规监管中标准的使用》以及《使用公共人类遗传变异数据库来支持基于NGS体外诊断器械的临床有效性》。
4. 近期批准的de novo申请
近期批准的de novo申请分为以下几类：
第一，基于NGS的肿瘤分析检测，该检测是一种定性的体外诊断测试，用于来自恶性实体肿瘤的组织样本的NGS分析以检测目标基因大panel中的体细胞突变，旨在辅助经有资质的临床专家诊断过的癌症患者的管理。实际上，“管理”这个词代表了广泛的适应症，FDA之所以使用这一概念，也体现了其监管的“灵活性”。对于这类产品，FDA也会进行特殊控制，例如要求适应症应指明检测适用于已经诊断的癌症患者。并且需要提供内部或外部信息的链接（例如决策准则或数据库）来支持整个panel或其部分检测结果的临床意义。另外，通过分析性能特征证实器械分析有效性时，可以特异性评估每个基因或突变，当临床及实际操作合理的情况下，也可以采用代表性方法，即基于同种类型的其他突变。举例来说，关于MSK-IMPACT检测的临床性能，其利用临床证据校准资源（OncoKB）来帮助解释已检测到突变的临床意义。OncoKB是一个涵盖生物、临床以及治疗信息的知识库，这些信息经过多种信息资源的校准，包括专业的指南和建议、治疗产品的标签、疾病专家和倡导组织的建议以及医学文献。公众可以通过网站获取OncoKB的信息。OncoKB会通过专家小组对新信息的审核进行定期更新。此外，MSK制定了分类标准来传达检测报告中单个突变可获得的临床证据等级。根据预先指定的分类标准，将突变分为两类进行报告，即具有显著临床意义的癌症突变组合以及具有潜在临床意义的癌症突变组合。
第二，用于临床的高通量基因测序分析仪，这类产品是一种分析仪器系统，旨在产生、测量信号并将信号分类，目的是分析临床样本中的核酸序列。仪器可能包括信号读取单元，试剂处理、专用的仪器控制以及其他硬件组成部分，原始数据储存装置，数据采集软件以及检测信号的处理软件。对于这类产品的特殊控制包括：1）必须说明适用的样本类型、核酸类型（例如种系DNA、肿瘤DNA）、序列变异类型（例如单核苷酸变异、插入、缺失）、声称的灵敏度相应的测序深度以及核酸提取方法，并针对以上说明的项目有相应的验证。需要注意的是，声称的样本类型及核酸类型的准确性数据可通过检测一组已知样本而产生，已知样本组合应至少涵盖两个来源的样本，并经充分验证的测序方法证实具有高度可信的序列。其中应至少有一个参考来源，其生成的序列在有关技术和分析方面独立于生厂商；2）标签必须引用已合法上市的与仪器系统配套使用的分析前和分析试剂并且包含或引用已合法上市的分析软件，与仪器系统配套使用的软件包含序列比对和变异分析功能；3）局限性必须说明仪器声称的准确度和精密度下无法检测的序列变异类型。
第三，遗传健康风险评估系统，该系统是一种定性体外分子诊断系统，用于检测提取自人类样本的基因组DNA变异，从而向用户提供其患病的遗传风险信息，告知其生活方式的选择和/或与医疗专业人员进行沟通。此评估系统作为非处方使用。此类器械不能确定个人患病的整体风险。FDA对这类产品在标签和性能研究方面会有非常具体的特殊控制。
5. 伴随诊断（Companion Diagnostics，CDx）临床研究简介
CDx整体上分为预测性CDx和选择性CDx，预测性检测用于预测治疗反应，识别最可能受益于特定治疗产品的患者或使用特定治疗产品可能导致严重不良反应风险增加的患者。需要通过CDx相互作用证实治疗具有临床和统计学意义。而选择性检测用于识别治疗患者，不用于预测治疗对结果的差异化影响，即疗效对于器械识别的标志物阴性组是未知的。需要在器械选择的患者组中证实疗效具有临床和统计学意义。
对于预测性CDx，在临床研究设计时，使用CDx进行检测，区分出标志物阳性患者和标志物阴性患者，同时入组阳性和阴性患者，进而分别将两组患者随机分配到药物组或对照组。对于选择性CDx采取相同的方案，但是只入组阳性患者进行随机分配。
如果采用回顾性研究，将已随机分配到药物组或对照组的样本采用CDx进行检测，从而区分标志物阳性患者和标志物阴性患者。回顾性研究的预期计划要点包括：1）药物临床试验是与CDx具有相同准则的充分设计并实施良好的试验；2）大部分受试者的样本可获得；3）大部分受试者的样本可获得；4）预先制定分析计划，以解决可能存在的不一致、数据缺失、偏差等问题；5）通过检测证实留存样本可接受的分析性能；6）临床数据对检测实施者设盲。由于药物临床试验入组的患者可能未采用CDx，而是使用非典型的临床试验测定（CTA）。因此，需要通过评估CDx和CTA之间的一致性，证实CDx在其适用患者人群中的的临床性能（通过疗效确定），即衔接性研究。具体的方法是使用CDx重测可获得的临床试验患者样本，如果可能，应包括部分CTA结果阴性的样本以及全部入组的CTA结果阳性的样本。
对于Follow-On CDx，不需要开展与药物临床试验同步的临床研究。举例来说， Foundation Medicine公司的产品F1CDx，实施了多项临床一致性研究来支持伴随诊断所声称的预期用途。在这些研究中，使用代表临床适用人群的样本，将F1CDx检测与已批准的CDx进行比较。产品所声称的内容是基于非劣效性的统计检验方法。
编者按：以上是Dr. Zhang Cheng关于美国FDA对于NGS器械进行监管的介绍，读者如果还有问题，可发送邮件至info@ivdchina.com进行咨询。
