急性髓细胞白血病中MicroRNAs作为诊断、 预后标志物以及潜在治疗靶点的研究

摘要：急性髓细胞白血病（AML）是一种造血祖细胞的克隆性障碍，特征是在表型、基因型和临床特征方面具有多样性。控制疾病发展的遗传畸变就有微小核糖核酸（miRNAs）。miRNAs是一种小型非编码RNAs，对mRNAs的转录、转录后水平以及稳定性方面起着调节作用。现在已经证实，miRNA表达失调是AML的一个显著特征。功能研究已经表明，miRNAs在AML发病机理中起重要作用，miRNA的表达图谱与化疗反应和临床结果相关。此次综述中我们总结了miRNA在AML中不同的细胞遗传、分子和临床特征。此外，我们回顾了miRNA调控网络在AML发病机制中的作用，并讨论了细胞和循环miRNA作为诊断和预后的生物标志物的潜在用途和治疗目标。

关键词：microRNAs；急性髓细胞白血病；生物标志物；治疗靶点

1.简 介

急性髓细胞白血病（AML）是一种具有侵袭性的血液恶性肿瘤，其特征是骨髓原始细胞的异常增殖和分化。AML是成人患者中最常见的急性白血病，可能会出现“复发”或继发事件。尤其是继发性AML可从之前的造血功能紊乱（如骨髓增生异常综合征（MDS）或慢性骨髓增生性肿瘤（MPN），或之前的治疗（化疗或放射治疗，免疫抑制药物或环境致白血病药剂）中衍生而来。这些骨髓恶性肿瘤的特点是在造血祖细胞中获得常见的反复突变。基因改变会导致造血转化中某一些骨髓细胞的增殖优势或调整关键转录目标的表达。

这些突变发生在具有调节染色质的作用和/或甲基化状态的造血祖细胞基因中。（例如混合谱系白血病（MLL）的甲基化状态或发挥改变髓细胞恶性血液病中表观遗传模式（例如TET甲基胞嘧啶加双氧酶2（TET2）、DNA甲基转移酶3（DNMT3A）、性梳样1（ASXL1），异柠檬酸脱氢酶（IDH）1和IDH2））它们对发病机制有影响并可能成为骨髓恶性肿瘤中指导治疗的有吸引力的靶点。

在分子和临床层面上，AML是一种具有高度异质性的疾病；经过良好鉴别的肿瘤基因和细胞畸变与致病性和预后有关。2016年新的WHO分类结合形态学、免疫表型和临床表现的遗传变异定义了6种主要的AML：（i）具有复发遗传异常的AML；（ii）出现骨髓发育不良的AML；（iii）与治疗相关的AML；（iv）无其他说明的AML；（v）骨髓性肉瘤；（vi）与唐氏综合征有关的骨髓增生。在细胞遗传学和分子资料的基础上，可将AML患者分为预后良好、预后一般的和预后不良三个风险组。AML治疗目前主要是对符合条件的患者进行高强度诱导化疗来达到完全缓解（CR），其次是综合方案，包括常规化疗以及造血干细胞移植。但是，由于持续的极小残留疾病（MRD）的存在，实现完全缓解的患者也会出现复发。

值得强调的一点是AML是因少量白血病原始胞或白血病干细胞（LSCs）的持续存在而反复不愈的。这些细胞表现出类似造血干细胞的特征，包括产生相同子代细胞和分化细胞的能力。相反，LSCs具有不同于AML混合细胞群的特性。这些特性使LSC难以提供标准化疗消除，从而导致恶性肿瘤出现耐药性和复发。

微小RNAs（miRNAs）是一类不断进化且具有短非编码单链的RNAs（19-22个核苷酸），能够下调mRNA的稳定性。它们在许多生物学功能如细胞生长、增殖、分化和细胞凋亡中发挥着重要作用。此外，miRNAs可作为癌基因或肿瘤抑制基因，在实体和血液学肿瘤（包括AML）中发挥作用。此外，miRNAs调节不同的mRNA靶点，它们的调节相当于白血病祖细胞和LSCs的潜在治疗靶点。由此可知，需要识别HSC、LSC和白血病祖细胞的miRNA表达模式。

AML中miRNA的表达经常被不同的机制下调，如：（i）拷贝数的变化；（ii）表观遗传变化；（iii）因染色体易位或蛋白编码基因过表达导致miRNA位于邻近致瘤基因组区域的位置；（iv）转录因子或癌基因蛋白发生改变导致miRNA启动子区域的靶向异常；（v）解除miRNA的加工。

在过去的15年中，微阵列芯片广泛用于研究AML中miRNA的表达。许多研究鉴别出不同AML亚型相关的表达特征，尤其是与特异分子和细胞变异相关的表达特征。最近，新型RNA测序技术已经用于评估miRNA数量和寻找AML中的新miRNA。

本文总结了AML亚型、LSCs和HSCs中出现不同表达的miRNA、这些miRNA在AML发病机理中的作用以及它们作为诊断、预后生物标志物以及治疗目标的潜在用途。

2.AML中miRNA的不同模式

根据2016年WHO分类，分子和细胞特征目前被定义为有临床意义的指标并收录在AML诊断标准中。

大量的研究证明不同的AML亚型中存在不同的miRNA，这说明miRNA的特征会影响AML的异质性，并显示其在临床环境中的潜在作用。表1报告了所有比较的AML胚细胞与正常细胞之间的miRNA谱，以及AML与复发性遗传异常之间的关系。大多数报告的研究中AML miRNA显示出很高的一致性。例如，在发送NPM1突变的患者中，不同的研究者发现了miR-10a、miR-10b和miR-196b的上调以及miR-192的下调。在存在t（8；21）的患者中也有一个常见的特征，即显示miR-126和miR-146a的上调，而miR-155的过表达与FLT3-内部串联重复（ITD）的改变密切相关（见表1）。

表1. 具有复发性遗传变异的急性髓细胞白血病（AML）的微小RNA（miRNA）表达

一些研究显示miRNA谱的部分重叠，这可能是因为AML亚型的比较分析中使用的微阵列平台、样品类型不同所致。

根据细胞遗传学和分子的不同，欧洲的白血病网络将AML患者分为3个风险组：预后良好、预后一般和预后不良。每个子类型似乎都具有独特的miRNA特征，并可将之与其他AML子亚型区分开来。例如，Marcucci G等人报告了miR-181家族所有成员在具有良好风险水平的患者中表达的水平升高（具有CEBPA突变的CN-AML），其在高风险亚群中表达的水平下降。同样在其他研究中，miR-181的表达水平也在细胞遗传学出现异常的AML（CA-AML）患者中升高，细胞遗传学异常，如t（15；17）（风险水平良好），在细胞遗传变化不良的CA-AML患者中表达水平下降，如MLL重排（风险水平不良）。Garzon等人将CN-AML与CA-AML患者进行比较，发现CN-AML患者的的10个miRNA出现上调（miR-10a， miR-10b，miR-16-2，miR-21，miR-26a，mir-20c，miR-181b，miR-192，miR-181b，miR-192，miR-368和let-7a-2），13个miRNA（miR-126，miR-145，miR-182，miR-183，miR-191，miR-193，miR-194，miR-196b，miR-199a，miR-200c，miR-203，miR-204，and miR-299 出现下调。miR-139-5p在有FLT3突变的CN-AML中患者中下调，在原发性AML移植模型中作为肿瘤抑制因子。Dixon-McIver等人报告，miR-9和let7b在预后良好组的表达水平为中低，在预后一般和预后不良的AML组表达水平高。他们还发现miR-125b主要在核型正常的AML表达。

miRNA表达也与骨髓（BM）细胞形态学相关。Chen等人证明在BM未分化的祖细胞中可以检测到成熟的miR-181表达。此外，它的表达与AML形态学亚型密切相关，与M4或M5细胞形态学的样品相比，其在M1或M2FAB分类样品中的表达水平升高。相比之下，在正常BM中，miR-181a优先在B细胞、T细胞、单核细胞和粒细胞中表达，与M4和M5亚型的相关性更紧密。另一项研究将M1与M5的miRNA谱进行了对比，研究表明不仅miR-181a和miR-181b的表达水平较高，而且在FAB M1中miR-181a*、miR-181d、miR130a、miR-135b、miR-146a、miR-146b和miR-663的表达水平也较高。相反，miR-21、miR-193a和miR-370在FAB M5样本中过度表达。最近，de Leeuw等人发现了miR-551b在原始细胞群、HSC和多能祖细胞中的表达水平最高；相反，在分化的祖细胞，单核细胞和淋巴细胞中出现表达水平下降和甚至miR-551b的表达缺失。这种表达模式可能表明miR-551b在早期造血干细胞中发挥作用。因此，作者假设其在AML中的表达可能是一种具有干细胞特点的未成熟的白血病细胞。事实上，他们在未分化的AML（FAB M0）中发现了miR-551b的高表达；相反，miR-551b在细胞遗传学良好的患者中没有表达。

Yang等人证明与正常对照组相比，AML患者的miR-122的表达水平下降，与M1-M6亚型相比，miR-122在FAB M7中的表达水平下降现象更为常见。

在最近的研究中我们评估了根据形态学特点分层的AML患者的miR-128a的表达，观测到与健康受试者CD34+相比急性早幼粒细胞白血病案例和伴成熟的AML患者中miR-128a的表达水平高。

基于FAB分类系统的大部分报告的研究需要根据2016年WHO的分类修订。因此，所有引用的文献数据强调了促进AML多态性的miRNA的异常表达。

3.参与AML发病机制的miRNA

MicroRNAs变异通过多种机制参与AML的发病机制。尤其是文献数据表明miRNAs可以通过改变包括自我更新、存活、增殖、分化和表观遗传学调控在内的多个生物学过程诱导白血病细胞生成。它们与抑制蛋白（致癌基因或肿瘤抑制抑制）一起或通过直接控制蛋白转译，或通过联合促进恶化的方式参与白血病的发展和演进。

为了总结这些概念，我们在表2内总结了大部分在AML中发挥作用的重要miRNA，指出每个miRNA表达发生的变化（上调或下调）、调节异常机制、目标以及对AML病理学的功能效果。但是文献数据揭示AML中调节异常的miRNA基于其表达水平会产生不同的影响。例如，相对于健康对照组miR-155在具有致癌功能的AML FLT3-ITD亚组中就会出现上调；相反在不同的AML亚组中，它还有肿瘤抑制的功能。

Narayan等人证明在三种不同的AML小鼠模型中（HoxA9/Meis1、MLL-ENL、MLL-AF9），miR-155的表达水平都不同。高水平的miR-155抑制克隆增殖，反之中等水平的miR-155则有致癌功能，导致增殖水平升高并促进克隆形成。不仅如此，该小组还确认了中等表达水平的miR-155与儿童AML患者的不良预后有关，表明miR-155在这种血液学肿瘤中具有普遍的致癌功能。

在白血病生成过程中miRNA不论在体内和体外都发挥控制mRNA目标的功能性作用。一般来说，miRNA-mRNA的关系与AML亚型有关，对一些目标发挥的作用大于其他目标，这取决于AML的细胞遗传学和分子特征（见表2）。

表2. 与AML发病机制相关的miRNA

例如，miR-155在AML中得到的研究最为充分，该miRNA对转录因子pu1有下调作用，参与造血细胞决议。Basova等人在AML发病机理中证实了这一数据，并报道了miR-155与Myb联合发挥作用。Myb的作用为细胞增殖和抑制骨髓成熟的激活因子，其分级顺序为Myb/miR-155/PU.1。此外，p53调节了这个分级顺序。p53的缺失导致了两种致癌基因Myb和miR-155的上调，同时导致PU.1下调，导致了AML的侵袭性特征。对致癌基因Myb和miR-155的抑制或通过保护PU.1可促进白血病原始细胞分化。miR-155能够诱导骨髓细胞增殖，导致骨髓祖细胞异常表达后产生骨髓增生综合征。Ghani等人建议，PU.1激活的miR-155表达诱导不活动的HSC进入细胞周期，从而促使它们开始分化成瞬态骨髓原始细胞。当PU.1在pre-miR-155的结合位点上被移除时，miR-155的表达缺失可阻断增殖，防止白血病的发生，并促进最终的骨髓细胞成熟。因此，需要PU.1来初始化这种miRNA的表达，但不需要它维持这种表达。

miR-17多顺反子性miRNA（miR-17-92簇）已被证实在人体MLL重排白血病中高度表达。最近，Wong等人证明了周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21是这一microRNA的重要下游靶点。白血病细胞的miR-17多顺反子表达水平升高显示出更高频率的LSC，增加了与p21表达水平下降相关的增殖。此外，原癌基因被证明是miR-17在MLL转化中一个重要的上游调控因子。值得注意的是，miR-17p-92簇的下调可以促进正常脐带血CD34+HPC的髓系细胞遗传。

MiR-125b在AML中上调。Chaudhuri等人证实，miR-125b过表达导致引起了一种高度侵袭性的髓细胞白血病的骨髓祖细胞和成熟的髓细胞失控。作者还指出，Lin28A是抑制诱导多能干细胞基因，也是miR-125b在造血细胞中的真正主要靶点。Lin28A下调模拟了miR-125b诱导的前白血病状态。MiR-125b生理功能为调节造血。对多个造血亚群中miRNA表达谱的研究表明，与其他所有祖细胞相比miR-125b是HSC中表达水平最高的miRNA之一。此外，miR-125b在长期HSC群中尤其积聚。虽然其在定向祖细胞中的水平显著下降，但在普通的淋巴样祖细胞中，miR-125b的表达水平高于普通的骨髓祖细胞。

众所周知，白血病细胞通过释放出胞外囊泡（EV）转移它们的代谢、蛋白质和遗传物质，如mRNA、DNA和miRNA，从而改变BM微环境中的目标细胞。EV miRNA的作用是创造一个有利的BM微环境，维持和支持白血病。在这种情况下，Hornick等人发现了对健康造血干细胞和祖细胞（HSPC）造血有直接影响的AML外显子（Exo）miRNA。本研究表明，白血病衍生的Exo足以造成造血系统的损伤，从而证明miR-150和miR-155及其调控网络可以抑制HSPC克隆形成。同样，Razmkhah等人也证明了AML BM微囊（MV）会诱导集落形成，并在健康的HSPC中增加两种白血病致癌miRNA，miR-21和miR-29a的表达。此外，Horiguchi等人还发现AML/骨髓增生异常综合征患者EV中的miR-7977诱导正常BM间质干细胞的造血支持能力下降。

4.HSC和LSC miRNA的差异化表达

众所周知miRNA在正常造血和HSC维持方面发挥重要的调节作用。同样，miRNA可调节LSC的自我更新和发展。实际上，与HSC相比，LSC会更先输出不同的miRNA表达。因此，对LSC内表达异常的miRNA进行调节，以及对miRNA靶标的调节，可以通过诱导凋亡或通过使其对化疗敏感来确定清除抗LSC耐药。

尽管许多研究报告了原发AML细胞群的miRNA谱，但是关于miRNA在LSC内的表达鲜有人知。

最近，de Leeuw等人将来自同一AML BM的LSC（CD34+  CD38-）与HSCs，以及LSCs白血病祖细胞（CD34+ CD38+）进行了比较，鉴定出多个出现差异化表达的miRNA。尤其是，他们发现miR-551b、miR-10a、miR-151-5p、miR-29b和miR-125b在HSCs中的表达高于在LSCs内的表达，而miR-181b、miR-221、miR-21和miR-22在HSCs中表达水平低于LSCs内的表达。有关其在白血病发病机制中的作用的信息详见表2。

据报告称，与白血病祖细胞相比，LSCs和HSC的miR-126表达水平升高，表明miR-126是一种与干细胞相关的miRNA。研究发现，通过调节体内磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素机械靶向（PI3K/AKT/MTOR）信号通路，可抑制细胞周期进展，阻止细胞分化，增强LSC的自我更新和化疗耐药性。有趣的是，与在HSCs中相比，它在LSCs中发挥了相反的功能作用；事实上，miR-126水平的下降导致了体内HSC增强，同时损害LSC的维持能力。最后，miR-126抑制引起细胞凋亡并降低LSCs的克隆生成能力。

其他在LSC中改变的miRNA也参与了白血病的发展。Wong等人发现miR-17多顺反子通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p2的表达，在MLL-AML小鼠模型中维持LSC。此外，在MLL-AML中，miR-196和miR-21的抑制作用降低了体内LSC。

Han等人的报告称，miR-29a在HSC和原发性人体LSC中表达水平高，但在定向祖细胞中被下调；这表明miR-29a在早期造血调控中发挥作用，并通过将骨髓祖细胞转化为可自我更新的LSC来促使AML发生。

通过比较LSC和白血病祖细胞，我们发现miR-1274a、miR-886、miR-1305在LSCs中的表达水平较低，而miR-126-5p、miR-126-3p、miR-22、miR-335和mir-150在LSCs中的表达水平比在白血病祖细胞中的表达水平要高。

有趣的是，LSC释放的MVS能够促进细胞增殖和迁移，并抑制AML细胞的凋亡。LSC中miR-34a的恢复不仅可抑制LSC的增殖，而且还生成了了含有高水平miR-34a的MV，逆转LSC- MVS对AML细胞的影响。

总的来说，根据研究报告研究所述，miRNA靶向LSC可能是根除白血病细胞的一种潜在策略，但还需要进一步的研究来进行明确。

5.miRNA作为AML的生物标志物

miRNA具有一些作为良好生物标志物的特点如存在于多种生物液体（例如血清、血浆、尿液、唾液等）中，在人或动物体内的序列稳定保持以及灵敏的测量方法学。

不仅如此，它们的稳定性高，能在不利的条件下如pH极端变化、沸腾、多次冻融循环以及延期保存中幸存下来。

大部分的miRNA位于细胞内；但是他们也可以是无细胞状态：（i）在凋亡小体和EV内得到保护；（ii）与Argonaute （AGO）家族蛋白相关；（iii）能结合高密度脂蛋白。这些miRNA通常定义为循环miRNA。新的证据表明循环miRNA因其具有的稳定性变得十分重要，它们可以作为实体瘤和血液肿瘤灵敏的早期无创生物标志物。尤其是，不同的研究已经鉴别出多种备选特异循环miRNA作为新的AML疾病生物标志物。

如前所述，miRNA的表达谱异常，除了与遗传变异有关，还具有诊断预后相关性。评估一种或一组具有潜在诊断/预后影响的miRNA能获得细胞、基因突变和基因表达谱的数据。

报告的具有诊断能力的细胞内miRNA和循环miRNA见表3，这些miRNA均是从基于ROC曲线分析的最具有显著性的诊断研究中选取。

表3. 可作为AML诊断生物标志物的miRNA

我们的工作证明了与健康受试者相比，EV miR-155在AML患者中表达水平很高，尤其是ROC曲线分析揭示该miRNA可以作为AML的新型潜在生物标志物。我们在表4内总结了与AML恶化有关的的miRNA，报告了这些miRNA的表达水平、来源以及预测复发或预后的效果，还有其与总存活（OS）和无复发存活（RFS）之间的关系（见表4）。

值得注意的是，新发现的具有灵敏性和特异性的生物标志物在临床上可用于对MRD的监测。尤其是循环miRNAs可能在这方面发挥重要的作用，它们的量化可能比传统的生物标志物更准确。在这种情况下，Hornick等人研究了可作为AML微创生物标志物的外显子miRNA。他们开发了一种针对高危AML患者的异种移植模型。他们在小鼠血清外显子中检测到一组生物标志物，miR-150、miR-155和miR-1246，与常规的免疫表型细胞评估相比，这些miRNA对MRD的检测具有同等的灵敏度。

尽管循环miRNA作为新型生物标志物很有吸引力，但还需要对其的纯化和定量进行优化及标准化，从而将基础研究转化为临床实践。未来还需要进一步的研究来促进EV分析在临床应用中的使用。准确的程序如样本收集、EV分离和存储以及EV-miRNA的定量检测是提高EV作为生物标志物价值的必要条件。

6.miRNA作为治疗目标

药物耐药性是AML治疗失败的主要原因之一。目前，AML的治疗方法能够快速地靶定根据原始细胞划分的不同组群，但其能力有限且无法根除功能明显的LSCs，导致疾病出现耐药和复发。因此，在AML中确定新的治疗策略至关重要。在这种情况下，基于miRNA的治疗方法可能开辟一条有前途的新途径。

miRNA靶向治疗的主要途径是对其表达的调控，原理是替代癌症抑制miRNAs或抑制过度表达的致癌基因。替代疗法使用了模拟的miRNA（双链寡核苷酸），并通过病毒或合成载体如脂质纳米载体、两亲性星型共聚物、无机纳米粒子聚合体和基于树状大分子等载体运载。这些载体对于避免降解和增加细胞对合成miRNA的吸收至关重要。

表4. 可作为AML预后生物标志物的miRNAmiRNA 表达预后影响

报告显示不论在体外和体内，基于miRNA的治疗方法结果都令人鼓舞。例如，miR-29b——一种在AML原始细胞中过度表达AML肿瘤抑制因子，该miRNA通过纳米颗粒的传递可减少白血病细胞的增殖，改善AML异体移植小鼠模型的存活率。这些数据在另一项体内研究中也得到证实，其中miR-29 miRNA的恢复显著减少了小鼠BM的AML移植，且与缓解脾肿大、减少肿瘤浸润、减少细胞增殖和增加脾脏内的细胞凋亡活动有关。而Xu等人则证明了miR-150在体外的过表达抑制了增殖和克隆生长，并降低了LSCs的致瘤活性，降低了肿瘤干细胞因子如Nanog、Notch2和CTNNB1的表达水平。此外，一项体内研究证实，miR-150过表达可逐渐抑制肿瘤生长。miR-22和miR-193a的强制表达也证明了其可抑制白血病的进展。特别是，Jiang等人证明了miR-22通过纳米颗粒的过度表达，显著抑制了白血病细胞的细胞活性和体外生长，并抑制了白血病的发展和体内白血病的维持。相反，Li等人指出，合成miRNA使miR-193a的表达得到恢复，对t（8;21）AML异种移植模型的恶性肿瘤细胞增殖有一定的阻碍作用。Yang等人将miR-122描述为儿童AML的肿瘤抑制miRNA，并表明合成miR-122能有效抑制HL-60 AML细胞系的细胞增殖和细胞周期。AML患者miRNA治疗的另一个潜在备选目标是miR-34。Wang等人的研究表明，在AML细胞系中，这种miRNA的过表达降低了PD-L1的mRNA和细胞表面蛋白的表达，是一种抑制免疫检查点的分子，表明miR-34a在AML免疫治疗中具有潜在作用。

第二种基于miRNA的治疗方法是使用抗miRNA寡核苷酸（AMOs）、miRNA海绵或miRNA掩蔽来沉默表达异常的miRNA。这些合成的寡核苷酸具有与内源性成熟的miRNA互补的序列，竞争性地阻止miRNA与它们的靶标之间的相互作用。例如，MiR-126在CN-AML中表达水平高，在体内模型被沉默后可导致LSCs减少，所以对正常造血功能没有毒性作用。在本研究中，Dorrance等人发现了一种能治疗AML患者且可防止复发的新型潜在治疗方法。文献资料也表明，miR-181抑制可以为AML治疗提供一种新的策略，可以增加骨髓祖细胞的分化，减少移植和白血病HSPCs在BM和脾脏的浸润，改善AML CD34+ HSPC异种移植小鼠白血病的症状。另一个与白血病有关的miRNA是miR-9；Tian等人证实其能在体内抑制恶性细胞增殖，减少血液和BM中白血病细胞计数，并缓解脾肿大。Velu等人研究了miR-21和miR-196b沉默在MLL-AF9白血病小鼠模型中的联合作用。他们证实，将其与两种拮抗剂联合治疗可以改善MLL-AF9白血病结局，并且在体内没有毒性。在这项研究中，他们测试了含有或不含胆固醇修饰的两种抗氧化剂，证明在体内含脂蛋白颗粒（商购型）的抗氧化剂的抗miRNA效果最好。

有新的证据显示，miRNA表达水平的改变可以提高对化疗或其他药物的敏感性。在此背景下，Chen等人证实使用原发性人AML细胞进行异种移植小鼠体内的let-7a出现过表达，提高了阿糖孢苷（Ara-C）单药化疗治疗的效果，延长小鼠的生存期。此外，体外miR-150的过表达也降低了用Ara-C治疗的两个AML细胞系的细胞活性。此外，Lu等人的报告称体外miR-181b的表达使白血病细胞对多柔比星（doxorubicin）和Ara-C更加敏感。Gao等人则证明了5-氮杂胞苷和模拟miR-193a的组合在AML细胞系（Kasumi-1）中的协同凋亡效果，表明miR-193a的恢复可以作为c-KIT阳性AML的潜在辅助疗法。最近的一项研究也证明了miR-217的上调在AML有肿瘤抑制作用，在体外可诱导对多柔比星的化学敏感性。此外，据报告称miR-133（一种EVI1过表达的AML细胞的肿瘤抑制因子）的异位表达增加了这个AML亚组的药物敏感性。

Lechman等人的研究表明抑制miR-126可以作为克服LSC化疗耐药性的策略，增加对抗恶性细胞增生药物的敏感性。不仅如此，靶定miR-21和miR-196b增加了MLL白血病同种异体移植模型诱导化疗的效果。

另一个有趣的概念是关于现有药物对miRNA表达的影响。例如，来那度胺—一种被批准用于治疗多发性骨髓瘤和MDS的药物可以诱导miR-181内源性表达，在AML异种移植小鼠模型中具有显著的肿瘤生长抑制作用。此外，Khalife等人的报告称MLN4924药物（Pevonedistat），能降低NF-B活化作用，下调FLT3-ITD+ AML细胞系中有致癌作用的miR-155的水平，并在体内和体内模型中减少了白血病表型。

识别miRNA的目标基因可以帮助我们了解AML的多种相关机制，并可以成为另一种提供靶向AML治疗策略的重要工具。例如，可以通过阻断其对目标mRNA的访问来调节miRNA的活性。最近的一项研究表明，可以通过诱导两种RNA结合蛋白RBM38和DND1引起对两种致癌miR-9和miR-17的活性的拮抗，RBM38和DND1的功能是保护mRNA免于miRNA介导的裂解。

MVS是另一种重要的miRNA肿瘤抑制载体。在最近的一项研究中，有人假设LSC衍生的MVs（LMVs）的miRNA含量可以被重新设定，从而改变LMVs对癌细胞的影响。特别是一种从人体AML细胞系KG-la分离的MVs（以前是通过合成miR-34a转染），可通过调节caspase-3和Tim3水平来抑制AML细胞的增殖和迁移。

尽管上述miRNA治疗方法具有各种优势，但在将其引入临床之前仍有许多挑战需要解决。此外，尽管文献表明在不同的模型系统中某些miRNA的毒性有限，但是必须进行临床试验以评估临床前效果是否会在人类患者身上重现。同样，需要评估计划浓度和剂量的有效性和毒性，并且必须评估miRNA治疗后的长期影响。此外，随着对不同miRNA的治疗潜力的研究，可以将多个miRNA的组合作为AML中可能的miRNA疗法。

尽管如此，目前开发基于miRNA疗法的最主要的限制是难以将药物送达BM，因此需要更高剂量的才能达到治疗效果。

7.长链非编码RNA可以干扰AML miRNA的功能

虽然已经发现了大量的非编码RNA，但是miRNA和长链非编码RNA（lncRNA）得到的研究最为充分。lncRNA是长度超过200个核苷酸的RNA。基于lncRNA转录的基因组位置，它们可以按意义分为不同类别，如与同一链中另一个基因的至少一部分重叠；反义，与相反的链的另一种基因的至少一部分重叠；内含子，起源于另一个基因的内含子；基因间，不与任何基因重叠；嵌合体，染色体重组的融合产物。

lncRNA可提高特异增强启动子循环的强度，促进基因活化。

它们的表达受到严格控制，表现出比蛋白质更高的细胞特异性。LncRNA在细胞发育、分化、增殖、侵袭和迁移等多种生物学过程中发挥着重要作用。LncRNA调节表观遗传、转录和转录后层面的基因表达。

miRNA和lncRNA的异常表达在所有类型的癌症中均有出现。

在AML中，lncRNA的异常表达促进白血病的发生、持续和发展。它们通过多种与染色质相关的机制，并通过与其他种类的RNA的交流参与染色质重塑以及转录和转录后调控。lncRNA有诱饵、支架的功能和增强RNAs的功能，不仅如此，AML中的IncRNA与内源miRNA存在竞争。

例如，lncRNA CCAT1在AML中被发现存在过度表达；它抑制单核细胞分化并通过抑制miR-155促进AML细胞生长。Palma的研究以及chen的研究表明存在FLT3野生型的AML细胞中miR-155具有促进分化和抗增殖作用，与其在出现FLT3- ITD突变的AML中的致癌作用相反。这些数据表明miR-155的基因调控是复杂多变的，因为它可以是靶向肿瘤抑制基因亦是致癌基因，其在AML的特定亚型中的功能可能受制于疾病的环境和细胞类型。

HOTAIR显示了lncRNA的致癌性，其竞争性地与miR-193a——一种重要的抑癌miRNA结合，从而调节AML细胞中c-Kit的表达。而lncRNA HOTAIRM1则与骨髓分化有关；此外，它还在肿瘤蛋白PML-RARA的降解中发挥了重要的microRNA海绵作用，可将以自体吞噬相关基因为目标的miR-106b、miR-125b和miR-20a阻断。

此外，Mangiavacchi等人发现miR-223、linc-223的宿主非编码转录物是一种通过结合miR-125-5p来控制AML细胞增殖和分化的功能性lncRNA。是一种在linc-223被下调的原发AML中被上调致癌的miRNA。

综上所述，lncRNA的功能在miRNA-靶向网络中引入了一层额外的复杂性，这使得有必要研究miRNA与lncRNA之间的相互作用，这两方面都有助于阐明AML发病机制并有助于治疗。

8. 结 论

miRNA已经成为一类与AML发病机制相关的基因表达关键调节因子，并可以作为潜在的生物标志物。实际上，miRNA分析尚未纳入AML临床实践中。特异性miRNA表达可以帮助临床医生对AML亚型进行分类，用来确定预后并预测AML治疗的反应。

应该特别注意的是循环miRNA，无论是游离的miRNA还是包含在EVS中的miRNA，都可以很容易地利用非侵入性外周血样本进行采集。此外，虽然恶性细胞在治疗后通常会减少，但是仍可检测到相关的循环RNA。最后，通过先进的第二代测序执行的miRNA分析将提供更多的关于miRNA以及参与白血病发病和进展的lncRNA的细节。这些信息支持了循环miRNA的概念。除了目前的AML临床参数外，新型AML生物标志物的重要价值是监测疾病的进展。它们也可以作为治疗反应的指标并在未来的临床实践中用于MRD的检测。

另一种改善AML结局的方法可能是利用miRNA作为治疗目标。利用miRNA抑制剂或模拟的新策略可以进行miRNA调节。

此外，miRNA治疗结合目前的化疗有可能可以根除LSCs。

实际上，发展miRNA治疗的主要问题是识别最好的备选miRNA，和设计具有更高稳定性miRNA运载工具用以向治疗目标运载药物，避免潜在的毒性和偏离目标。miRNA生物学中存在许多复杂和神秘的现象；miRNA的研究将是我们了解在AML临床环境中改善其使用的方法的关键。AML中miRNAs的作用的图示见图1。

图1. miRNA在AML中的作用

微小RNA参与发病机理，可作为AML的生物标志物和治疗目标。红色箭头表示致癌miRNA过表达和肿瘤抑制miRNA表达

水平下降引起AML；黄色闪电状标志和双头箭头分别表示靶定和恢复；绿色箭头表示致癌miRNA水平下降或肿瘤抑制

miRNA水平升高；红叉表示AML阻断。

摘自《International Journal of  Molecular Sciences》

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编译：张凯

审校：姜妤 魏冰