质谱技术 在非小细胞肺癌诊疗中的作用
精准医疗是一个目前最受临床关注的概念，其整体思路是通过临床生物信息学将基因组特征（如SNP，突变，表观遗传学）等临床大数据与疾病表型进行关联，从而得到一系列可用于患病风险预测、诊断、治疗、复发监控及预后判断等多方面的新型分子标志物组合，最终为患者实现个体化医疗。
目前，基于个人基因水平的精准医疗正逐渐成为临床上肿瘤预防和治疗的主流。个体化医疗、伴随诊断（Companion Diagnosis，CDx）是实现精准医疗的关键。伴随诊断通过在DNA、RNA和蛋白水平上检测蛋白、基因异常，从而精确寻找到疾病的原因和治疗靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确分类，确定最佳用药人群，识别患者对某种治疗方式（产品）可能增加的风险及副作用，控制患者对特定药品的治疗反应，并及时调整治疗方式以改善产品安全性和提高产品有效性，最终实现对于疾病和特定患者进行个体化精准治疗的目的，避免不获益者潜在毒性和不必要的用药不良反应及医疗费用支出。通过伴随诊断，对肺癌尤其是非小细胞肺癌（NSCLC）进行分类诊断和个体化治疗是实现精准医疗的典型。2011年至今，美国FDA已批准了7种NSCLC靶向治疗药物伴随诊断试剂盒，对识别络氨酸激酶抑制剂、ALK抑制剂和PD-1免疫疗法受益人群起到了极其重要的作用。
除了具有突出的优势以外，这些预测性的诊断测试目前也存在着明显不足，首先，它们主要依赖于基于组织学标本的基因突变或蛋白表达，对于没有组织标本或没有足够的组织标本的部分患者并无法发挥其应用的作用。其次，靶向治疗耐药后机制复杂，而重复活检和动态检测困难，且多次检测周期长，无法全面预测用药疗效。另外，随着患者靶向用药选择越来越多样化，不同药物需使用不同的伴随诊断试剂进行检测，如何为病人有效匹配一个正确的测试将是未来医生可能会面临的挑战。因此寻找微创、便捷、实时监测多靶点的伴随诊断方法是目前临床亟需解决的问题。
近几年出现的“液体活检”或可为上述问题提供了一个新的解决途径。“液体活检”技术可通过血液中的循环肿瘤DNA、蛋白等新型标志物获取关于肿瘤或潜藏肿瘤的信息。研究表明循环肿瘤DNA含有与肿瘤组织类似的基因突变信息，可部分替代组织标本检测，并可将其应用于遗传易感性检查、靶向药物伴随诊断、以及肿瘤复发和转移监测。现有主流的ctDNA检测方法主要有ARMS-PCR、高通量测序、和数字PCR三种。其中，ARMS-PCR是目前在实验室使用最广泛的技术，但其检测灵敏度较低且只能进行定性检测，因此无法适应未来ctDNA检测的发展。而高通量测序和数字PCR的出现在一定程度上提高了ctDNA检测的灵敏度，但是上述两种方法目前还存在明显不足。以数字PCR为例，虽有报道称其检测灵敏度可达0.04%，但由于受到荧光检测通道的限制（一次只能检测2到3个位点），无法满足多位点同时检测的需求，无法实现广泛应用；而高通量测序方法实验流程耗时长，数据量庞大，需要经过系统训练的专门人员才能完成分析，限制了其在普通实验室的开展。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）是近年来应用于临床检测的新型软电离生物质谱，主要用于核酸、蛋白、多肽等生物大分子检测。基本原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程，然后在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，最后将飞行时间转化为分子量并通过分析软件得出检测结果。
在核酸水平，MALDI-TOF质谱可在pmol级别上鉴定仅1个碱基差别的不同DNA片段，其检测灵敏度可达0.1%-0.5%，可用于肿瘤组织、胸水及循环肿瘤DNA等多种样品类型的肿瘤相关基因突变定量检测，其检出率比传统非定量的ARMS-PCR法高20%左右。另外，MALDI-TOF质谱完整的核酸检测流程只需8小时，与高通量测序一次检测耗时2～5天相比大大缩短了检测时间，而且还可根据需求自由选择芯片规格，适和低、中、高等多种不同通量的科研和临床应用。在蛋白、多肽水平，MALDI-TOF质谱可通过VeriStrat检测在EGFR突变的非小细胞肺癌患者中筛选出可从EGFR-TKI靶向药物治疗中获益的人群。该方法首先检测全血样本中8种不同分子量的标记蛋白信号峰值，然后通过K-nearest算法构建的预测模型将患者分为VeriStart Good（VS-G）或VeriStrat Poor（VS-P）组。既往研究证实，VeriStrat的分类结果与EGFR-TKI治疗的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）有关，埃克替尼、吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治疗组中VeriStrat分类为Good的患者的PFS和OS均由于其分类为Poor的患者，因此VeriStrat检测可用于区分TKI类靶向药物治疗获益人群。此方法已于2013年被写入美国国立综合癌症网络（NCCN）的非小细胞肺癌治疗指南，并已经在美国及欧洲完成了数万人次的检测。
综上所述，MALDI-TOF质谱是一种具备核酸和蛋白双重检测功能的工具，应用前景广泛。其本质是检测物质的物理特性——分子量，因此在核酸检测方面与荧光定量PCR、数字PCR、测序等其它方法相比不涉及荧光干扰，准确性高，可应用于循环肿瘤DNA检测。在蛋白、多肽检测方面，其在NSCLC一线、二线及其他肿瘤个体化治疗中已获初步验证，能够将可获益的患者区分出来，未来开展的大样本前瞻性研究将会进一步证实该方法的准确性。
北京毅新博创生物科技有限公司 供稿
