减少心血管事件的Lp-PLA2抑制剂
摘要：有证据表明炎症在动脉粥样硬化病理学中发挥着重要作用。炎症是一种具有高度可调节性的过程，是一类平衡促炎和抗炎反应的冗长机制。炎症的复杂性使其成为鉴别直接导致动脉粥样硬化的关键的酶或特殊途径成为一种挑战，但却是有价值的治疗目标。Lp-PLA2磷脂酶A2家族成员，这类酶有助于动脉粥样硬化斑块的进展，通过促进炎症发生使斑块变得不稳定。大量的流行病学研究已经证明Lp-PLA2水平的升高与不同患者人群心血管疾病风险的升高有关，独立于现有的如低密度脂蛋白胆固醇等既定风险因素。不仅如此，大量的临床前和遗传研究表明Lp-PLA2与动脉粥样硬化形成具有因果关系。能直接抑制Lp-PLA2的新型治疗药物的开发为直接检验抑制炎症酶能改善临床结局的假设提供了唯一的机会。本文中，我们将综述Lp-PLA2与动脉粥样硬化病理学间具有因果关系的证据并讨论将抑制这种酶作为潜在治疗目标的实用性。
Lp-PLA2：生物机制
脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）是一种在血浆内以持续活性形式循环的不依赖钙的酶。它由包括单核细胞衍生的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞在内的炎症细胞分泌，并且主要与低密度脂蛋白（LDL）胆固醇有关。它是磷脂酶A2超级家族的一员，其特点是能够水解磷脂基质的sn-2酯键。Lp-PLA2的催化活性被认为是依赖脂蛋白的，它对小而密集的低密度脂蛋白胆固醇的活性更强，包括脂蛋白（a）颗粒，这些颗粒被认为是最具有致动脉粥样化特性。由于它能够催化血小板活化因子（PAF）的水解作用，Lp-PLA2在采用现在的名字之前最初被称为PAF-乙酰水解酶。除了PAF之外，这种酶还具有多种极性磷脂质的特异性，包括氧化和短链磷脂质。因此Lp-PLA2被认为在与脂蛋白相关的氧化磷脂质（oxPL）的水解和消耗中发挥着关键作用。
在动脉粥样硬化的发病机理中，Lp-PLA2的生物作用仍存在争议。最初的报告表明，Lp-PLA2可能对PAF有降解作用，间接抑制血小板的活化，从而保护心脏。由于它能够在低密度脂蛋白胆固醇上水解oxPL，因此有研究者假设Lp-PLA2有抗动脉粥样硬化作用，因此理论上可以降低氧化的LDL颗粒的致病性。然而，最近的证据并不支持后者的观点，oxPL可能会发挥抗炎作用，而这些脂质的水解可能只会导致炎症进一步加重。
总的来说现有证据倾向于Lp-PLA2具有促动脉粥样硬化作用。在动脉粥样硬化斑块中，Lp-PLA2水解导致溶血磷脂酰胆碱形成的氧化低密度脂蛋白颗粒和氧化的非酯化脂肪酸，这二者是公认的促炎介质。这些产物的形成被认为能通过传播炎症级联促进动脉粥样硬化形成和斑块的不稳定性，导致内皮功能障碍、坏死松解和凋亡。这样的过程可能导致更多的薄帽纤维粥样斑块（TCFA）生成，TCFA是一种不稳定且更易破裂的斑块类型。这些结论得到了组织学染色的支持，组织学染色显示与更小且更稳定的斑块相比，Lp-PLA2蛋白似乎更多地在TCFA内聚集。
此外，生物和动物数据都支持Lp-PLA2酶的促动脉粥样硬化作用。人和兔子的动脉粥样硬化病变的巨噬细胞中都发现了Lp-PLA2 mRNA和蛋白。通过患有高胆固醇血症的猪可以证明较高的Lp-PLA2酶活性、较高的氧化脂类以及动脉粥样硬化加速进展之间存在联系。同时，直接抑制Lp-PLA2的活性也可以抑制冠状动脉粥样硬化的进展。在人体中，随着溶血磷脂酰胆碱浓度的升高，不稳定和破裂的颈动脉斑块中Lp-PLA2的表达被上调。此外颈动脉内膜切除术后重新形成的颈动脉斑块中Lp-PLA2基因的表达已经被证明与未来心血管事件风险升高独立相关。在TCFA中，Lp-PLA2在巨噬细胞中强烈表达，Lp-PLA2蛋白质的沉积优先于纤维帽附近的凋亡巨噬细胞和坏死核心区，这是一个富含脂质和氧化产物的区域。与之相反，在纤维帽较厚的斑块或更稳定的纤维粥样瘤中，Lp-PLA2的活性反而最低。
Lp-PLA2：流行病学和风险分层
Lp-PLA2是一种酶，且可以通过对其质量或活性的评估进行量化。可以通过免疫试验评估Lp-PLA2的质量，量化其在血清或血浆中的浓度。
商购PLACTM 试验（DiaDexus.inc）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于Lp-PLA2定量检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）。该试验可以用于冠心病或缺血性中风风险的辅助评估。由于Lp-PLA2对在sn2位置的极短酰基磷脂具有高度的选择性，因此可以通过定量反应副产物生成率的放射法或测热法试验来检测Lp-PLA2的活性。虽然早期有证据表明这两项测量间存在很高的相关性，但是最近的研究表明仅仅在Lp-PLA2活性和质量之间存在微弱的相关性。由于Lp-PLA2质量试验量化了在脂蛋白表面可触及的主要Lp-PLA2，而活性试验可以在变性条件下完全评估Lp-PLA2的活性，这两种方法提供了互相补充的信息，因此似乎比较可信。
到目前为止，一些研究已经在一级和二级预防患者人群中检验了Lp-PLA2活性和质量在预测CV时间风险方面的预后价值。
西苏格兰冠脉预防研究（WOSCOPS）是一项旨在证明高血脂男性人群中Lp-PLA2质量浓度与后续CV风险之间存在联系的第一个大型分析。重要的是，在这项研究中Lp-PLA2为风险分层提供了增量信息。这些信息不依赖现有的心脏风险因素、低密度脂蛋白胆固醇和其他如C反应蛋白、纤维蛋白原和白细胞计数在内的其他风险标志物。
在WOSCOPS研究结果发表后，一些研究在健康个体和确诊患者中检验了Lp-PLA2活性或质量的预后实用性。尽管一些一级预防研究证实了WOSCOPS观测到的结果，但是其他研究在进行多变量调整后并没有发现Lp-PLA2和CV结局之间存在相关性。在社区动脉粥样硬化风险研究（ARIC）中，仅在低密度脂蛋白胆固醇低于130mg/dl的受试者中证明了Lp-PLA2和未来冠心病风险之间存在相关性。
Lp-PLA2的预后实用性已经在患有冠心病的个体中得到了检验。Lp-PLA2的活性或质量似乎对处于急性阶段的急性冠脉综合征患者的风险分层没有帮助，但是Lp-PLA2与CV事件发生几周后稳定升高的风险有关。在急性冠脉综合征发生后的早期测量中Lp-PLA2的质量或活性与复发型CV事件的风险之间没有相关性的原因尚不明了。相比之下，一项涉及3766名稳定型冠脉疾病（CAD）患者的大型研究表明较高水平的Lp-PLA2与CV事件风险之间存在独立相关性。在稳定型CAD患者以及至少患有ACS一个月的患者中，Lp-PLA2与C反应蛋白之间仅存在极小的相关性并增加了CV事件预后的实用性。Lp-PLA2研究联盟结合了32453名目前患有稳定型CV疾病个体的患者级数据，结果发现Lp-PLA2与冠心病风险的增加以及血管和非血管死亡之间具有独立相关性。
Lp-PLA2研究联盟共报告了一级预防和二级预防环境中32项前瞻性研究中79000多名受试者的综合数据，证明Lp-PLA2活性和质量都与CHD和血管死亡风险之间存在连续的相关性，可与非高密度脂蛋白胆固醇和血压等独立的传统风险因素相比。当综合跨研究数据时，Lp-PLA2活性和LDL替代物如非高密度脂蛋白胆固醇（r=0.49）、载脂蛋白B（r=0.45）和直接测量的低密度脂蛋白胆固醇（r=0.48）之间存在很强的相关性。Lp-PLA2活性与对数甘油三脂浓度相关（r=0.22），与高密度脂蛋白胆固醇之间呈负相关（r=0.24）。男性的Lp-PLA2活性高于女性。但是Lp-PLA2活性与年龄、收缩压、体重指数、吸烟状况和CRP之间只存在微弱或不显著的相关性。总而言之，Lp-PLA2与基线协变量之间也观测到相似的相关性。Lp-PLA2与脂质参数之间的相关性略弱，而Lp-PLA2质量与吸烟之间的相关性较强。
Lp-PLA2：遗传多态性和冠心病风险
虽然有几项研究表明较高的Lp-PLA2水平与较高的CV时间风险有关，但是此类研究不能证明二者之间存在因果关系。导致Lp-PLA2活性自然变化的遗传变异提供了一个评估这种酶是否可能在CV疾病发展中发挥因果作用的独特机会。编码Lp-PLA2蛋白（PLA2G7）的基因包含12个外显子，并位于染色体6p21.2-12上。Lp-PLA2编码基因常见的功能缺失（LOF）突变（V279F等位基因）已经在日本、中国和韩国被发现，该突变能导致Lp-PLA2活性的自然下降或缺失。对于既有两个LOF等位基因（纯合子）的人体内的Lp-PLA2完全没有活性，而只是拥有一个LOF等位基因（杂合子）的人体内的Lp-PLA2活性也比没有这个变体（野生型）的人低50%。
尽管小型研究的最初报告相互矛盾，但是关于V279F功能缺失多态性的较大规模研究支持了Lp-PLA2酶会有促动脉粥样硬化的作用。该研究由韩国的2项大型案例对照研究组成，研究人群为韩国男性，研究证明由于携带V279F等位基因导致Lp-PLA2活性遗传缺陷与较低的冠心病几率有关。基因剂量效应为携带一种V279F等位基因的拷贝与冠心病几率降低21%有关，而携带两种V279F等位基因拷贝与冠心病几率降低31%有关。反之，冠心病几率降低的程度与我们从Lp-PLA2研究合作项目收集的流行病学数据所预测的结果相符。
达拉地（darapladib，Lp-PLA2抑制剂）：临床前研究
由于越来越多的证据支持Lp-PLA2有促动脉粥样硬化的作用。目前许多研究正在探讨其作为治疗目标的实用性。由于Lp-PLA2循环主要与低密度脂蛋白胆固醇结合，能对低密度脂蛋白胆固醇产生影响的药物已经被证实能够影响Lp-PLA2的水平，包括他汀类药物、烟酸、非诺贝特和吉非罗齐。II期试验显示与安慰剂相比胆固醇酯转移蛋白（CETP）抑制剂达塞曲匹（不在研发中）能增加17%的Lp-PLA2质量。由于Lp-PLA2与高密度脂蛋白胆固醇部分结合。这种效应可以通过使用CRTP抑制剂后观测到的高密度脂蛋白胆固醇显著升高来解释。目前还不清楚对Lp-PLA2的这种影响是一种等级效应还是仅仅针对达塞曲匹。
与脂质改良剂不同，达拉地是一种口服型活性Lp-PLA2酶直接抑制剂，且抑制效果可逆。达拉地虽然其他Lp-PLA2直接抑制剂也在研发中，但是唯一一个III期检验的直接Lp-PLA2抑制剂。在患有糖尿病和高胆固醇血症的猪的临床前研究中，达拉地减少了坏死核心区域和内侧破坏，减少了不稳定表型。重要的是达拉地在血浆和动脉粥样硬化斑块中都直接抑制了Lp-PLA2的活性，可减少斑块内的溶血磷脂酰胆碱。达拉地还导致了包括24种与T淋巴细胞和巨噬细胞功能相关的致炎基因表达的下调，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）趋化因子受体CCR2——一种动脉粥样硬化病变中积累的促炎性巨噬细胞标志物（M1亚型）也减少了。从这些基因表达的结果可以看出，达拉地降低了斑块中巨噬细胞的含量。达拉地没有改变血浆脂质水平，证明了通过抑制不影响胆固醇浓度的炎症，可以减少炎症并延缓不稳定动脉粥样硬化病变的发展。
DARAPLAPIB：临床研究
在适用阿托伐他汀治疗（每天20mg或80mg）稳定性CHD的剂量估算II期试验中，每天使用160mg达拉地可以持续抑制Lp-PLA2的活性，在12周的治疗中抑制的平均水平达到了66%，不用考虑极限脂质水平。在该研究中达拉地减少了12.3%的白介素-6，但没有影响C反应蛋白或脂蛋白的浓度。尽管Lp-PLA2的命名最初基于其水解血小板活化因子的能力，但抑制Lp-PLA2酶对血小板功能没有影响。
整合的生物标志物和成像研究2（IBIS-2）试验是一项随机、双盲、安慰剂对照的达拉地II期试验，对高风险患者每天使用160mg达拉地。所有患者在治疗之初和治疗12个月后进行血管内超声检查并通过虚拟组织学（IVUS-VH）进行额外评估。作为研究设计的一部分，研究使用了加强型他汀治疗的背景。和剂量估计研究取得的结果相一致，达拉地降低了59%的Lp-PLA2活性，但并没有降低C反应蛋白的浓度。在12个月治疗的末期阶段，达拉地阻止了斑块坏死核心的扩张，但在他汀治疗的背景下使用安慰剂治疗的患者中，斑块坏死核心继续扩张。与安慰剂相比，达拉地没有达到减小总动脉粥样瘤体积这一主要终点。在II期试验中，除了腹泻、味觉异常（味觉失真）和粪便尿液异味的发生率较高外，达拉地的耐受良好。总而言之，这些临床前和临床试验支持了将Lp-PLA2作为动脉粥样硬化患者治疗目标的概念。
目前有两项大规模、多中心、双盲、安慰剂对照随机III期临床试验在患有稳定和不稳定型冠状动脉疾病的受试者中评估达拉地的有效性和安全性（见表1）。“稳定性”试验（使用达拉地稳定动脉粥样硬化斑块）正在循证疗法背景下评估15800多名受试者使用达拉地（每天160mg）的效果和安全性。使用达拉地溶栓稳定斑块的心梗52（SOLID-TIMI52）研究正在超过13000名受试者中评估达拉地（160mg每天）的效果和安全性，这些患者包括因急性冠脉综合征住院30天内的患者，包括非ST段升高不稳定心绞痛、心梗和ST段升高心梗患者。这两项研究均为事件驱动研究，治疗的中值持续时间为2到3年。这两项试验均已完成患者招募，预计在2014年获得首批试验结果。综上所述，这些试验将直接检验Lp-PLA2在动脉粥样硬化中发挥的因果作用，因此Lp-PLA2可能成为稳定或不稳定型动脉粥样硬化疾病患者的一个有价值的治疗靶点。
结 论
炎症在动脉粥样硬化中发挥着关键作用，假设Lp-PLA2酶在动脉粥样硬化发病中发挥着因果作用。流行病学研究和遗传学数据目前支持的概念是Lp-PLA2可能确实是动脉粥样硬化疾病进展的危险因素。达拉地是Lp-PLA2的选择性抑制剂，该药物正在接受两项大型III期临床试验的评估。这些试验结果将检验直接抑Lp-PLA2是否有助于阻止动脉粥样硬化的进展并将对动脉粥样硬化时间和斑块破裂的潜在病理生物学提供有价值的见解，同时评估Lp-PLA2抑制的效果。
图1. Lp-PLA2对动脉粥样硬化进展的作用
Lp-PLA2在循环中主要与低密度脂蛋白胆固醇结合，在小而密集的LDL颗粒上的聚集程度最高。在动脉粥样硬化斑块中，Lp-PLA2水解氧化的LDL颗粒上的磷脂质形成溶血磷脂酰胆碱（lysoPC和氧化的非酯化游离脂肪酸（NEFA）。这些化合物的体外效果包括内皮功能紊乱、趋药性、细胞因子活化和毒性效应。这些炎症介质有助于动脉粥样硬化斑块炎症的发生和稳定，并导致进一步的疾病进展和斑块不稳定性。
