小鼠肠道损伤中的微环境可促进有利修复的菌群产生
摘 要
哺乳动物肠道内有一个影响正常的上皮细胞生长和发育的复杂的微生物群落，对修复受损肠黏膜来说不可或缺。损伤粘膜的恢复包括免疫细胞的聚集、上皮细胞的迁移和增殖。尽管在伤口愈合中已经叙述了微环境的改变，但是外部影响的作用，例如微生物群有哪些，还没有被报道过。本文中我们展示了一个独特的正常黏液相关肠道微生物群亚群的增殖和优先定植受损鼠黏膜部位，以响应局部环境。我们的研究结果表明，甲酰肽受体1 （FPR1）和中性粒细胞NADPH氧化酶（NOX2）是快速消耗微环境中的氧和代偿反应，导致厌氧细菌群落显著聚集所必需的。此外，这种损伤-黏膜相关微生物群的主要成员Akkermansia muciniphila（一种厌氧、嗜黏液菌的肠道共生体）在参与FPR1和肠上皮细胞特异性nox1依赖氧化还原信号的过程中，刺激了结肠伤口附近的肠细胞的增殖和迁移。因此，这些发现证明了伤口微环境是如何诱导“前有机体”的快速出现，从而促进粘膜伤口的修复。可以将这些微生物作为潜在的治疗手段加以开发。
我们可以在炎症性肠病、肠内感染以及外科/机械创伤和毒性/环境损伤中观察到肠道粘膜损伤。为了模拟肠道损伤和修复，我们利用微型内窥镜检查和活检钳来生成定义的野生型小鼠（野生型）远端结肠粘膜创伤 （图1和补充图1）。在这项研究中，我们通过泛细菌荧光原位杂交（FISH）和扫描电子显微镜（Fig.1b c）第一次实现了结肠创面的内生细菌可视化。在体内平衡过程中，结肠内容物中的微生物群主要通过内部黏液层与下面的结肠黏膜分离（图1b和补充图2）。然而，在受伤后第0-2天，损伤的粘膜由于失去了3个关键特征：完全分化的肠细胞、杯状细胞和衍生粘液层（图1b和补充图2）与共生菌群直接接触，并在4-6天内发生逆转。为鉴定与伤口相关微生物群，我们分别于受伤后第0、2、4、6天收集结肠黏膜组织，并从伤口及邻近完整黏膜和局部腔内内容物中纯化总DNA。通过聚合酶链反应（PCR）扩增细菌16S rRNA基因（V4区），采用Illumina Miseq高通量测序（HTS）平台对扩增子进行测序。在门水平层面对微生物组进行的分析显示，与腔内微生物组相比，黏膜相关微生物组的厚壁菌门丰度较高，拟杆菌门丰度较低（图1d）。有趣的是，在第0天的创面中存在的菌门的构成最接近于腔内的含量。然而，活检后第2天及以后再缝合伤口的微生物构成与完整粘膜及结肠腔内含量有较大差异（图1d）。此外，一个主坐标图（PCoA）也表明，活检后2天与伤口相关的微生物群明显地聚集在完整的黏膜上（图1e，环状菌株）。第4天和第6天与再缝合伤口相关的微生物群逐渐聚集到更完整的粘膜。线性判别分析（LDA）发现了7个厌氧和微嗜气共生细菌属（图1f），它们在早期再生黏膜（第2天和第4天）中显著增加。最为显著的是厌氧的mucinophilic Akkermansia，（AKK菌，疣微菌门）的丰度显著升高（图1d，f）。另外，与伤口相关的菌群还包括厌氧粪球菌属、Mucispirillum、odoribacter、Prevotella和颤螺旋菌属（图1f）。有趣的是，伤后2天，耐氧乳酸杆菌的数量减少，但伤后4-6天内又出现增加（补充图3a）。这些结果表明，在肠粘膜损伤修复过程中，伤口局部环境暂时动态条件有利于特定微生物群的生长，并定义了一个与伤口相关的微生物群落，该菌群优先存活数天，并在伤口修复时恢复到初始状态。
图1. 损伤恢复诱导损伤粘膜相关微生物去年的时间和空间变化
A. H&E染色的创面；B. 利用泛细菌探针（红色）进行的粘膜创面FISH分析（每组n=10）；比例尺，50μm。C. 创面的扫描电子显微照片。D. HTS（每组n=5损伤）的细菌门类平均相对丰度。E. 损伤粘膜微生物群结构的PCOA描记。F. 反映粘膜恢复区域细菌门类的正相关的LDA评分。D2和D4分别表示第2和第4天。
图2. 损伤恢复区的微环境变化需要FPR1和NOX2，促进厌氧嗜黏液Akkermansia菌。
a. 哌莫硝唑HCl的免疫荧光染色显示粘膜创面微环境氧气量消耗（每组n=10）。箭头表示缺氧区域。b. a中哌莫硝唑HCl加合物染色的免疫荧光分析的定量显示（Image J软件；以荧光单位表示；平均值±s.e.m）c. 损伤（每组n=11）中反应基因glut1和muc3的粘膜上皮缺氧的实时qPCR分析（平均值±s.e.m）。比例尺，50μm。*P＜0.05；学生t检验。
图3. Akkermansia的富集需要FPR1
a. HTS测定Fpr1-/-小鼠的菌类相对丰度。数据表示的相对丰度。b. HTS测定的野生型和Fpr1-/-小鼠损伤的Akkermansia相对丰度比较；每组n=5损伤。c. Akkermansia特异性相对丰度倍率变化的实时qPCR分析（平均值±s.e.m；每组n=10）。d. FISH分析的创面Akkermansia（绿色）可视图像（每组n=6）。比例尺，50μm；*P＜0.05；学生t检验。
肠粘膜炎症部位及随后的恢复的特征是组织微环境的多重改变，包括促分解介质、细胞因子、黏蛋白类和氧含量的变化。例如，在由三硝基苯磺酸（TNBS）引起的结肠炎期间，炎症上皮内的氧气被聚集的中性粒细胞中的nox2介导的氧爆作用迅速耗尽，同时从肠上皮细胞（IEC）中增加了粘蛋白、MUC3的合成。我们假设这种生理变化在粘膜损伤的微环境中为AKK菌的快速生长创造了有利的条件，AKK菌是一种厌氧和嗜黏液性微生物。为了探究这一假设，我们首先使用盐酸吡莫硝唑对活检伤口的氧消耗进行了研究。这种化合物在低氧环境中减少，形成可免疫检测蛋白加合物。这一分析发现创面在受伤后2天内氧浓度明显下降（图2a和补充图3c），这是伤口相关AKK菌和其他厌氧菌数量最大化（图1d）和中性粒细胞流入最大化的时间点（补充图3d，e）。伤后第4天和第6天，当伤口重新封闭时，缺氧微环境消退（图2a和补充图3c）。由于耗氧量是吞噬细胞呼吸爆发的结果，我们利用去除了FPR1和NOX2的动物评估了局部结肠黏膜缺氧状况。在受伤后的第2和4天，尽管迁移的中性粒细胞数量变化微不足道，但与野生型同窝出生的小鼠幼崽相比，Fpr1-/-和Nox2-/-小鼠创面的氧气耗尽情况显著减少（图2a，b和补充图3d，e）。此外，野生型小鼠粘膜层上皮细胞（glut1和muc3）缺氧反应诱导的基因转录增加了2.5倍，但Fpr1-/-或Nox2-/-的小鼠没有发生此类现象（图2c），这种增加受到HIF1α依赖性转录抑制剂的抑制（补充图3g）。免疫荧光染色也证实野生型小鼠粘膜损伤处的MUC3蛋白的表达增加，但不是Fpr1-/-小鼠没有发生此类现象（补充图3f）。有趣的是，与野生型小鼠相比，Fpr1-/-和Nox2-/-小鼠体内检出的缺氧状况减少一级MUC3表达减少与创面厌氧菌和嗜黏液性Akkermansia的减少有关（Fig，3a-c）。具体来说，野生型小鼠正在恢复中的创面内，微生物群的定量分析表明Akkermansia的相对丰度大约是7.8% （图1d），相比之下，Fpr1-/-小鼠正在恢复的创面内该微生物的相对丰度约为1.2%（图3）。此外，在第2天使用Akkermansia特异性16 s rRNA探针的FISH分析评估和确认了野生型而非Fpr1-/-小鼠的再缝合创面内Akkermansia的相对丰度（图3d）。最后，补充MUC3肽可以增加Akkermansia的相对丰度（补充图3g）。这些数据证实，愈合粘膜伤口的微环境与FPR1/ nox2依赖性氧消耗、MUC3粘蛋白的增加以及嗜黏液性Akkermansia的富集有关。
我们最近报道了细胞活性氧（ROS）的特异性细菌的刺激增强肠道上皮细胞的增殖和迁移。为了研究AKK菌是否影响这些关键的细胞事件，我们评估了外源性A. muciniphila （ATCC BAA-835）经直肠给药后结肠黏膜的再愈合。在野生型小鼠体内，与对照组（43.7%）相比，使用A. muciniphila处理伤口6天后，粘膜再愈合的情况显著增强（74.14%，P＜0.05）（补充图4）。然而，与正常对照组（57.4%）相比，Fpr1-/-小鼠的伤口再愈合情况没有类似的显著增强。AKK菌还能促进右旋糖酐钠盐（DSS）诱导的结肠炎模型中炎症的恢复作用（补充图4c-e）。值得注意的是，培养的上皮细胞中，单独移植AKK菌加速了体外划痕伤口的重新封闭，表明这种菌株可以单独介导有益事件（补充图4f）。我们之前已经证明了在IEC中选择共生细菌能促进肠上皮特异性NADPH nox1-依赖型ROS的生成作用，而IEC反过来激活ERK-MAPK的下游氧化还原依赖性磷酸化作用和介导FPR1/ nox1 -依赖型上皮细胞伤口闭合的焦点粘连蛋白（如FAK）。事实上，通过使用稳定的、无毒的氧化还原敏感荧光团来检测发现，给野生型小鼠注射更多的A. muciniphila会导致伤口边缘相关ROS相应增加（补充图5），而使用A. muciniphila处理的Fpr1-/-和Nox1-/-IEC小鼠的IEC中仅略微生成了ROS（图4a，b）。相比之下，Nox2-/-小鼠再愈合的上皮创面内检出了野生型小鼠的相当的IEC ROS生成水平。（图4a，b）。此外，与之前的数据一致的是，乳酸菌（鼠李糖乳杆菌GG，或LGG）而非大肠杆菌诱导细胞ROS生成（图4a）。与前文一致的是，采用外源性A. muciniphila增加野生型而非Fpr1-/-或Nox1-/-IEC小鼠结肠上皮细胞可检测的ERK的磷酸化作用（图4 c），表明A. muciniphila需要Fpr1和Nox1调节依赖氧化还原反应的细胞信号。随后，通过测量EdU（5-乙炔基-2-脱氧尿苷）的结合评估A. muciniphila对邻近伤口的上皮细胞的增殖的影响（图4d和补充图6）。使用A. muciniphila治疗伤口能显著增加（1.6倍）野生型而非Fpr1-/-小鼠的四到五结肠隐窝附近的伤口EdU-阳性细胞的数量（图4d，e）。和预期一致，A. muciniphila还以FPR依赖的方式刺激培养模型肠上皮细胞中EdU的结合和增强ERK磷酸作用（补充图6b，c）。这些体外数据还表明，AKK菌诱导的IEC信号传递是上皮细胞的自主过程。
图4. Akkermansia亲黏液菌强化依赖氧化还原反应的伤口的恢复
a. 伤口治疗后正面粘膜损伤中细胞ROS生成，DNA，蓝色；肌动蛋白，绿色。b. a中ROS生成的定量表示（平均值±s.e.m）。c. 结肠损伤（每组n=11）薄截面的P-ERK免疫荧光分析。d. 直肠内使用Akkermansia治疗后肠上皮细胞增殖（EdU阳性细胞为红色）。e. 5种邻近伤口菌群的EdU阳性细胞的定量（每n=12）。f. 野生型和FPR1-/-小鼠EdU标记（红色，追踪试验）的创面的表皮细胞再生（每组n=12）。g. f内伤口表皮细胞再生的定量。比例尺，50μm；*P＜0.05；学生t检验。
我们接下来使用EdU辅助的脉冲追踪标签研究了与伤口相邻的肠细胞的迁移情况（图7）。在受伤后的第1天我们观测到了相邻隐窝的EdU标记的肠细胞的移动。（补充图7b）。此外，在初始损伤和4天的追踪期间，我们在野生型对照组小鼠的完全封闭创面的上皮单层细胞中检测到了EdU阳性细胞（补充图7b）。有趣的是，在相同期间内，与部分上皮重新横长的野生型对照组或采用A. muciniphila治疗的Fpr1-/-小鼠相比，采用A. muciniphila治疗的野生型小鼠体内，2天内伤口上皮重新生长（图4f，g）。AKK菌曾被报道与结肠上皮表面密切相关并影响上皮基因的表达。这些数据证实AKK菌和其他与伤口相关的细菌通过fpr1依赖的氧化还原介导的对上皮细胞增殖和迁移的控制促进粘膜伤口修复（补充图8）。
总体而言，这些结果表明微生物群能够适应局部环境的变化，形成可定义的、短暂的群落，在小生态中促成可预期的局部生态事件。然而，这个微生物群的成员能够刺激前恢复信号和增加细胞的迁移和增殖，这表明在共同进化过程中，宿主因素能够影响群落结构，选择具有有益的特定生物体，从而将共生关系塑造成互惠关系。虽然有明显的微生物独立环境因素影响伤口愈合，但我们提出了一个术语“前有机体”来描述微生物群成员可以利用小环境扩展来介导有益的影响。在疾病的休养/恢复过程中，集中研究这种以及其他长期建立的宿主-微生物关系，可能是挖掘和发现具有治疗潜力的微生物的有效来源。
方 法
小鼠模型
所有的动物实验都得到了艾莫利大学动物护理和使用机构委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院的指导方针进行。小鼠可以自由选择标准的饮食和水，直到达到预期的年龄和/或体重。在无病原的条件下，动物保持12小时光照/12小时黑暗周期。Fpr-/-小鼠购自Taconic。去除Nox2-/-和相应对照组的野生型小鼠从杰克逊实验室购买。移植Fpr1-/-和Nox1-/-IEC/小鼠源于我们的研究机构，野生型和去除Nox2-/-（纯合子）小鼠为杂合的父体和母体的后代。野生型和Nox2-/-小鼠被安置在相同的无病原体条件下并提供标准的饮食和水。年龄（6-8周）和性别匹配的Nox2-/-小鼠被随机分为不同的组。样本量显示在图片题注中。组织和内窥镜分析以盲法进行，样本量代表生物副本。采用PCR技术对野生型Fpr1等位基因或携带新霉素耐药基因（neor）的突变基因进行基因分型。
菌株
A. muciniphila购自ATCC（BAA-835），按照ATCC培养指南进行培养（http://www.atcc.org/products/all/BAA-835.aspx#generalinformation）。为了进行体内分析，直肠内剂量含有100μl的6×108 c.f.u.ml-1的A. muciniphila悬液（见细菌剂量测定解释中体内ROS试验章节）。根据前述方法培养耐糖鼠李糖乳杆菌（LGG）。
微生物群分析协议
使用MoBio实验室的PowerSoil试剂盒从腔内、粘膜或创面中提取DNA（每组5个创面）；从一只单独的小鼠体内采集粘膜创面DNA。使用复合正向引物和包含唯一12碱基条码的逆向引物，利用PCR扩增16SrRNA，通过Golay误差校正方案进行设计，其用于从相应样品中连接PCR产物。我们使用引物在Illumina平台上使用细菌/古生菌引物515F/806R（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和GGACTACHVGGGT野生型CTAAT）进行双尾16S群落测序。引物专用于16S rRNA基因的V4区域。正向PCR引物序列的序列包含5′Illumina适配器（AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC），正向引物垫（TATGGTAATT），正向引物链接器（GT）和正向引物序列（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）。每个反向PCR引物序列包含3′Illumina适配器（CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT）的反向补充，Golay条形码（每个序列包含不同的条形码），反向引物垫（AGTCAGTCAG），反向引物链接器（CC）和反向引物（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。这些引物的序列已经公布并被不同的实验室广泛使用。分别对每个样品执行3次独立的PCR反应，与Ampure磁性纯化珠（Agencourt）结合纯化，使用凝胶电泳进行可视化。将纯化后的产物进行定量，以等摩尔比率生成主DNA池。在埃默里大学的整合基因组学核心（EIGC）的基础上，我们使用Illumina Miseq测序平台对混合产物进行测序。使用QIIME（微生物生态学的定量研究）进行生物信息学分析。使用UPARSE，利用97%的双特性将序列分配到操作分类单元（OTU），使用RDP分类器进行分类。剔除嵌合体后，每个样本的平均读数为19721。使用PyNAST对每个OTU的单个代表序列进行对齐，然后使用FastTree构建系统发育树。用系统演化树计算UniFrac距离。所示的PCoA分析没有加权。利用属名、术语以及厌氧菌或粘蛋白以及糖基化基团进行文献检索确定包括厌氧菌在内的细菌特征以及AKK菌、粪球菌属、Mucispirillum,、Odoribacter、普氏菌属颤螺旋菌属和乳酸菌的粘蛋白。判定线性判别分析（LDA）评分。
FISH分析
Carnoy固定的和石蜡包埋结肠组织切片经溶菌酶处理和洗净。用一种具有16s rRNA基因（GCTGCCTCCCGTAGGAGT）特异性的通用细菌探针进行杂交。控制非特异性探针的序列为ACTCCTACGGGAGGCAGC27。AKK菌特有的探针序列是CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT。在本研究中，根据Pernthaler及其同事的协议，在结合了明胶的多孔玻璃玻片上通过FISH分析。针对肠源杆菌数量的纯培养物检测AKK菌特异性探针（补充图2g）。简单地说，在玻片上发现了收获的和固定的纯细菌培养物，用上面描述的FISH探针杂交并清洗。对具有FISH毒株特异性探针或通用探针使用Cy3或Cy5贴上5’标签。
活鼠内窥镜检查
为了在小鼠结肠中形成离散黏膜损伤并监测其再生，我们采用了高分辨率微型化结肠镜系统（Coloview兽医内窥镜，Karl Stortz）。简单地说，这个系统由一个微型硬内窥镜（1.9毫米外径），一个氙气光源，一个三片式高分辨率电荷耦合装置摄像机，一个带有仪器通道的操作套和一个用于调节小鼠结肠膨胀的空气/水注入灯泡（全部来自Karl Storz）组成。将外置手术套的内窥镜置入降结肠中段，观察黏膜至直肠肛门交界处。采用柔性活检钳（diameter，French size 3）取出整个粘膜和粘膜下的全厚度单层区域。利用平板彩色监视器呈现内窥镜程序和高分辨率（1024×768像素）图像。我们的内窥镜程序能够拍摄视频和静态图像。我们使用一个0.5毫米棒校准我们的技术测量伤口大小，根据Seno及其同事的方法。采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析伤口大小。两个独立的操作员以盲法方式获得了数据。用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠。我们特别注意避免进入固有肌层。
创面组织准备
以最佳的切割温度（OCT）介质将包含创面的粘膜组织被储存在-20℃环境中最佳切削温度（10月）并冷冻来执行免疫荧光显微镜和病理分析。对于组织学分析，调整伤口并以最邻近末端的切割方式，使用7μm的增量制备截面。创面最大的截面被考虑置于伤口中间并用于免疫荧光染色。根据Johansson等人的协议，使用Carnoy定色剂作为标准方法保存伤口组织粘蛋白并随后用于微生物群的FISH分析以及粘蛋白检测。使用解剖显微镜研究创面总形态学。
细胞在体内的迁移
采用EdU追踪法测定创面的上皮细胞迁移情况。在组织活检损伤时，小鼠腹腔注射EdU（I.P.），并在2-4天后处死小鼠（即2-4天的追踪化验）。补充图7a解释了这种方法。在上述十年内直肠内剂量包含100μl体积的6×108 c.f.u.ml-1 A. muciniphila悬液。
使用EdU Alexa Fluor显像试剂盒（Invitrogen公司）进行EdU标记（红色，图4f）细胞的免疫组织化学定位。截面也采用β连环蛋白免疫染色（绿色，图4f）来识别肠上皮细胞。
体外细胞迁移
在A. muciniphila存在的情况下对SK-CO15单分子层进行划伤实验，每2小时接种一次，在第0和第6小时测定伤口面积。使用Akkermansia和NAC（20mM）或BOC2（1μg ml-1）S孵育K-CO15单层细胞。
体内的细胞增殖
在小鼠组织活检损伤后的不同时间点（第0、1和2天）分别给予EdU。上述时间内直肠内剂量包含100μl体积的6×108 c.f.u.ml-1 A. muciniphila悬液。在给予小鼠EdU（追踪， 2h）后处死，在OCT培养基中收集含有创面的组织切片并冷冻。使用Click-iT EdU Alexa Fluor显像试剂盒（Invitrogen公司），对免疫组织化学方法定位进行标记，检测s期细胞。
免疫荧光
为了确定ERK在上皮细胞中激活磷酸化作用，我们对麻醉小鼠进行了肠内HBSS（Hank's buffer salt solution）或A. muciniphila（ATCC BAA835）注射。一个包含100μl 直肠内剂量体积的6×108 c.f.u.ml-1 A. muciniphila悬液。小鼠执行安乐死，沿着肠系膜边界打开结肠。以最佳的切割温度（OCT）介质将包含创面的粘膜组织被储存在-20℃环境中最佳切削温度（10月）并冷冻。得到抗体如下：anti-ERK，phospho-ERK（细胞信号），anti-MUC3（Santa Cruz），anti-MUC2（Thermo Scientific），β-actin（Sigma-Aldrich），荧光素（FITC）结合的山羊抗兔免疫球蛋白（Jackson ImmunoResearch）和HRP集合驴抗兔或山羊抗小鼠二级抗体（GE Healthcare）。如前所述，执行免疫印迹和免疫荧光标记。用碘化钾（分子探针）染色细胞核。用激光共聚焦显微镜获得荧光图像。
ROS体内检测
为了测定小鼠活检损伤模型中的细胞ROS，我们使用了一种ROS敏感的染料-氢氰酸3。氢氰酸3在体内稳定无毒，被活性氧氧化时发出荧光。小鼠麻醉后，经直肠注射氢氰酸3。注射水cy3 30分钟后，造成活检损伤，执行HBSS，A. muciniphila LGG或大肠杆菌管理15分钟。为了确定剂量反应（补充图5所示），直肠内包含100μl的量包含不同浓度剂量的a muciniphila（2.5×107-2.5×109 c.f.u.ml-1）悬液。一剂100μl 6×108 c.f.u.ml-1的A. muciniphila悬液生成最大的ROS，并用于随后的体内分析。
处死小鼠，沿肠系膜边界打开结肠收集组织。在玻片上安装后，用共聚焦激光扫描显微镜检查样品。使用535nm激光消除和560nm发射滤波器捕捉图像。使用ImageJ软件（国立卫生研究院）分析和测量荧光强度，并以荧光单位表示。
细胞培养
细胞培养方法见前文。确定上皮细胞自制作用，生长在薄膜上的人类肠道上皮细胞系SK-CO15插入37℃ 4%CO2的培养箱内补充了10%FBS、100单位每ml青霉素，100μgml-1链霉素，15mMHEPES（pH7.4），2mML谷氨酰胺和1%非必要氨基酸的高糖（4.5g-1）DMEM内。
Akkermansia特异性qPCR
为了量化AKK菌的丰度，我们使用了确认的A. muciniphila的特异引物：正向A. muciniphila，CAGCACGTGAAGGTGGGGAC，逆向A. muciniphila，CTTGCGGTTGGCTTCAGAT。对引物进行扩增，单个扩增子长度为328，随后进行测序验证。为了进行定量，采用了总微生物DNA和通用细菌引物组515F和806R（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和根据制造商的说明，使用FAST SYBR Green Master mix进行检测。连续稀释两倍纯培养A. muciniphila基因组DNA得到标准曲线。对于AKK菌特异性引物，标准曲线使用基因组DNA，每个反应的数量如下（pg）：400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56，以及无DNA对照（R2=0.9934）。对于具有通用引物集的qPCR，标准曲线采用基因组DNA，每次反应量（ng）分别为：10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16和0.08，无DNA对照（R2=0.9961）。逆转录-PCR（rt-pcr）协议如下：95℃运行15分钟，40个15秒95℃周期，66℃（AKK菌）和50℃（通用）40秒，72℃30秒。扩增后融合曲线，区分靶向和非靶向PCR产物。所有反应都是重复进行的。按基因组等价物分析细菌丰度，基于其基因组大小（2.66 Mbp；ATCC baa -835），A. muciniphila指定乘数为3.42×105基因组等价物/ng DNA。此外，基于基因组的大小4.50Mbp，肠道微生物群落作为一个整体被指定的乘数为2.03×105。在qPCR分析中，将A. muciniphila的样品特异性相对丰度确定为AKK菌特异性引物扩增的基因组等价物除以通用引物扩增的基因组等价物。通过调整DNA提取、归一和qPCR建立过程中的稀释度，并将此浓度除以原DNA提取所用组织的总克数，确定每克组织的绝对丰度。最后，将来自不同小鼠的伤口组织的数据表达为与野生型小鼠完整粘膜相比的倍数变化。
定量基因表达的qRT-PCR
用Qiagen RNeasy RNA分离试剂盒从小肠远端分离出总RNA并合成cDNA。使用SYBR Green Master Mix（Invitrogen）和先前验证过的特异引物组（glut1 TGCCTTGGATGTCCTATCTG and ACCAGGGCCTACTTCAAAGA；muc2 CCCAGAAGGGACTGTGTATG and TTGTGTTCGCTCTTGGTCAG；muc3 TGGTCAACTGCGAGAATGGA and TACGCTCTCCACCAGTTCCT）进行qPCR分析。每个样本的信号归一到18SrRNA的水平，使用ΔΔCt分析，利用标准化的数据计算基因表达的相对水平。引物效率在104-108%之间。最后，将来自不同小鼠的伤口组织的倍率变化与野生型小鼠的完整粘膜进行比较。在直肠内采用特殊的和强力的HIF1α抑制剂（BAY87-2243；Selectchem）（4mg kg-1体重）或MUC3肽（~Asp2236-Val2356；100μl PBS剂量，1或5μg肽μl PBS剂量每天/小鼠；Cloud-clone corp.）。
DSS结肠炎
小鼠可以自由获得含有3%（野生型/vol）DSS的食物和饮用水6天，恢复时间延长6天。如前所述，每天进行临床评估和组织学分析。使用苏木精和伊红（H&E）染色的组织学切片对小鼠全结肠（Swiss role）进行扫描显微分析，并测量溃疡（剥离的黏膜）区域，比较每只小鼠的结肠长度。
统计数据
每个治疗组的定量数据表示为均值±s.e.m.或s.d。每个实验重复三次以上。使用双尾学生t检验或方差分析（ANOVA）以及Tukey的多重比较后检验（GraphPad Prism）进行统计比较（GraphPad software）。P值＜0.05定义为显著（*P＜0.05）；**P＜0.01）。
