室温下硫氰酸胍溶液内粪便微生物群的高稳定性和结肠镜检查期间的鲁棒性

Jalanka等人检验了利用系统基因芯片技术和定量PCR分析冷冻样品的方法对肠道准备期间微生物群影响。粪便样品采集后立即置于干冰或冷藏器（-80℃）中进行冷冻是传统做法。Jalanka等人也是采用这类方法。因为在室温（RT）下放置15分钟菌群就会发生明显变化。但是在日常临床环境中，立即冷冻甚为不便，我们希望在室温下将样品简单地储存在包含4M硫氰酸胍溶液的检测试管中并获得等效结果。硫氰酸胍是一种常见的蛋白质变性剂并能抑制细菌增殖。我们在结肠镜检查前后采集了粪便样品并将之分为两部分：一部分冷冻储藏，另一部分在室温下储藏。通过16S核糖体RNA测序分析确定菌群分类，并比较2部分的结果。我们检测了粪便微生物群的稳定性，Jalanka发现在全肠道灌肠之后肠道菌群会发生变化并在14天内复原。

在结肠镜检查的前一天。排便后立即采集第一份样品并立即使用干冰冷冻（样品D0_F）或储存在室温下的检测试管中（D0_R）（图1）。检测试管置于室温下并包含100mM的Tris-HCl（pH 9）、40mM EDTA、4M硫氰酸胍和0.001%溴百里酚。在检测的当天早上排便后立即采集第二份粪便样品，并同样用干冰冷冻（D1-1_F）或储存在室温下（D1-1_R）。在检测的当天，在医院内口服清肠药物期间首次排便后立即采集第二份样品并立即使用干冰冷冻（D1-2_F）或储存在室温下（D1-2_R）。结肠镜检查期间采集肠液样品并使用干冰冷冻（D1-3_F）。结肠镜检查60天以后，在排便后立即采集最后的粪便样品并使用干冰冷冻（D6_F）。

图1. 8种不同采样和储存条件肠道菌群的皮尔森成对相关性（D0_F、D0_R、D1-1_F、D1-1_R、D1-2_F、D1-2_R、D1-3_F和D60_F，详见下文）。值为8名受试者的中值。

为了比较不同采样环境中的菌群组成，我们采用皮尔森成对相关系数，利用8个个体的中值对菌群图谱进行比较。不同时间定的冷冻样品之间显示出高相关性（ρ≥0.88，p＜0.01）。显而易见，样品D60_F与结肠镜检查前的样品之前的相关性高。肠液（D1-3_F）与粪便样品的相关性低，在相同时间点采集并以不同条件储存的样品之间的相关性高（ρ≥0.88，p＜0.01）。

为了检验储存温度对每个菌群的影响，我们计算了冷冻样品和室温储存的样品中20种显著占优势的菌群丰度倍率变化（图2，中），没有发现显著的区别。我们的结果表明在室温下储存在包含4M硫氰酸胍试管中的粪便样品在菌群检测中可以实际替代冷冻样品。

图2. 左侧为20种显著占优的菌群的丰度倍率变化。中间为结肠镜检测前（蓝色）、检查当天（红色）和清肠当天早晨（黄色）储存在冷冻和室温环境中的样品的比较。右侧为基线样品（D0_F）和检测当天早晨（蓝色）、清肠期间（红色）以及结肠镜检查2个月后（黄色）的样品之间的比较。

我们接下来检查了采样时间点（结肠镜检查前后）对菌群丰度的影响（图2，右），并比较了D1-1_F vs.D0_F（蓝色）；D1-2_F vs. D0_F（红色）和D60_F vs. D0_F的菌群丰度倍率变化。没有发现显著区别。这些发现表明肠道微生物在结肠镜检查期间具有鲁棒性，与Jalanka等人利用不同方法学的发现一致。