恒温核酸扩增技术在分子诊断领域的应用

摘要：随着分子诊断技术的蓬勃发展，PCR已无法满足市场对方便，简单，易操作的诊断仪器与试剂盒的需求。以恒温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是未来一，二十年的方向。本文总结了目前应用最广最有前景的恒温核酸扩增技术：LAMP，RPA和NEAR。同时对PCR和几种恒温核酸扩增技术进行了比较。

关键词：PCR，恒温核酸扩增，LAMP，RPA，NEAR

聚合酶链式反应（PCR）是1983年出现的一种对已知DNA片段进行体外扩增的技术。它利用耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶），将模板DNA，引物，脱氧核苷三磷酸（dNTP）和缓冲液等在不同温度间循环，从而达到双链DNA分离，引物粘合到模板上的互补区间，最后在DNA聚合酶作用下脱氧核苷三磷酸逐个添加到新合成的DNA链上的过程。通过PCR技术，特定DNA片段可以达到指数级别的扩增，从原来的少量DNA分子扩增到可以用仪器检测的水平，利用这一特点可以对一些特异的病原或疾病标志物进行诊断。近几年，由于PCR技术的不断成熟，特别是实时荧光定量PCR（qPCR）的出现，使得基于qPCR的分子诊断产品日渐成为主流。但常规的PCR技术由于热循环的需要，使这一技术完全依赖于电源和昂贵的PCR仪器，从而限制了这一技术在实验室之外的应用。由于这些缺点，科学界一直在试图发展不需要使用PCR仪器的核酸扩增方法，恒温核酸扩增技术的发展成为一个不可逆转的趋势。

恒温核酸扩增技术是利用各种酶，引物，脱氧核苷三磷酸（dNTP），模板DNA以及缓冲液的混合物在同一温度下温浴一定时间，让不同的酶与DNA进行反应，从而达到特定DNA片段的扩增。与传统的PCR核酸扩增相比，恒温核酸扩增不需要在不同温度之间的转换，只要保持酶反应的最佳温度，37℃、42℃、56℃或65℃即可完成DNA片段的扩增。与PCR核酸扩增的温度循环相比，恒温核酸扩增仪的温度控制更容易实现。所以，基于恒温核酸扩增仪器更简单，更便宜，加热耗能更少（见表1）。

与PCR相比，恒温核酸扩增的原理是这种技术带有一些与生俱来的特点（见表2）。

★ 对引物的高需求

自80年代PCR技术发明以来，PCR引物的设计已经相当成熟，市场上有很多关于PCR引物设计的软件可供使用。所以设计一对好的PCR的引物并不困难。恒温核酸扩增刚好相反。一对或者几对好的引物对任何一种恒温核酸扩增技术都是相当关键的，可是由于恒温核酸扩增技术各不相同，引物设计方法很难相互借鉴。目前虽然针对环介导恒温核酸扩增的引物设计有软件可供使用，但是设计出来引物效果还是参差不齐，同时由于恒温核酸扩增是利用酶和DNA之间的反应进行扩增，所以，针对某些目标基因的特定序列，恒温核酸扩增并不容易拿到扩增片段，需要经过反复优化反应条件不停实验才会得到一个好的反应体系。

★ 扩增速度

由于恒温核酸扩增只需要在一个温度下进行，相比较于PCR不同温度之间的循环，恒温扩增不需要反复的升温降温过程，有些恒温扩增的速度是快于PCR的扩增速度的。例如：环介导恒温核酸扩增（LAMP），重组聚合酶扩增法（RPA）以及切刻内切酶恒温扩增（NEAR）。目前英国公司optigene已经成功的改造了传统的核酸置换酶，使有些LAMP为基础的恒温扩增试剂盒可以在15分钟内完成检测。

★ 扩增特异性

由于恒温核酸扩增的整个反应是没有温度的变化，模板DNA双链的打开，引物与互补片段的链接以及新片段的合成都是在同一温度下进行的。这就造成某些情况下的反应体系里引物之间形成非特异性互补，扩增，最后造成假阳性的结果。与PCR相比，恒温核酸扩增更易出现假阳性的结果。

★ 对抑制剂的敏感度

目前大多数恒温核酸扩增对抑制剂的敏感度都要低于PCR对抑制剂的敏感度。这就意味着用于恒温核酸扩增的模板DNA不需要非常高的纯度，含有些许杂质并不会影响核酸的扩增，这一特性会大大减少扩增前模板纯化的工作。

★ 通 量

在实际的产业化中，分子诊断仪器的通量往往至关重要。对于qPCR而言，由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性，往往可以比较好的实现高通量检测。由于恒温核酸扩增技术引物设计较为困难，单一的反应温度会造成引物和模板，引物与引物之间的非特异性链接和扩增，使得恒温扩增的检测通量受到限制。但同时也得益于反应温度的单一化，我们可以通过设计多个反应槽来弥补通量不足的遗憾。

过去几十年间，若干恒温核酸扩增技术发展迅速，如环介导恒温扩增（LAMP）技术，链置换（SDA）恒温扩增，解旋酶（HDA）DNA 恒温扩增，重组酶聚合酶（RPA）扩增和切刻内切酶（NEAR）恒温扩增。

★ 环介导恒温核酸扩增（LAMP）

环介导恒温核酸扩增（LAMP）是日本学者Notomi等在2000年发表的一种核酸扩增的方法，他利用特殊的引物设计方法和恒温核酸链置换酶将少量目标DNA在60分钟内扩增到千百万份。LAMP反应中需要4-6个引物，这些引物特异性的识别模板DNA的6-8个DNA区间。在每一套LAMP的引物中，包括两个外部引物（F3和B3），两个内部引物（FIP和BIP）以及两个环导引物（loop F和loop B）。LAMP引物设计和反应原理如图1所示。

图1. LAMP 引物设计和反应原理

LAMP的反应混合物由dNTPs，链置换聚合酶，荧光染料，引物和DNA模板组成。用于LAMP反应的引物设计，其特征在于使用四种不同的引物，这些引物是专门设计用于识别靶DNA的六个不同区域的。前内引物（FIP）由3' 末端的F2区和5' 末端的F1c区组成；正向外引物（F3引物）由F3区组成，其与模板序列的F3c区互补；向后内部引物（BIP）由3' 末端的B2区域和5' 末端的B1c区域组成。向后外引物（B3引物）由B3区组成，其与模板序列的B3c区互补。当FIP的F2区与靶DNA的F2c区杂交并启动互补链合成时，扩增开始，然后F3引物与靶DNA的F3c区域杂交并延伸，取代FIP连接的互补链。该置换链在5' 末端形成环，这种在5' 末端具有环的单链DNA然后用作BIP的模板，B2与模板DNA的B2c区域杂交，启动DNA合成，导致形成互补链并打开5' -末端环，随后，B3与靶DNA的B3c区域杂交并延伸，置换BIP连接的互补链，这导致形成哑铃形DNA。通过Bst DNA聚合酶将核苷酸添加到F1的3' 末端，其在5' 末端延伸并打开环，哑铃形DNA现在转变为茎环结构（参见a和b）。该结构用作LAMP循环的引发剂，其是LAMP反应的第二阶段。也可以添加环引物用于LAMP的指数扩增，获得的最终产品是具有不同茎长度的茎环DNA和具有多个环的各种类似于菜花的结构的混合物（Wong等，2018）。

自2000年Notomi等人发现LAMP以来，作为分子扩增的技术LAMP在各方面都取得了许多进展。如，LAMP的实时检测，以探针为检测手段的多重LAMP也有些许的进展；传统LAMP以DNA为模板进行扩增，以RNA为模板的逆转录LAMP（RT-LAMP）也已广泛应用。 

通常，LAMP产物的检测依赖于终点分析并且需要扩增后处理，可能导致交叉污染或检测到非特异性LAMP扩增产物。这些方法包括：琼脂糖凝胶电泳上分析扩增产物（Notomi等，2000），由于焦磷酸镁（Mg₂P₂O₇）的累积导致的阳性反应浊度分析（Mori，2001），在核酸嵌入染料如SYBR Green I或EvaGreen（Parida，2005）存在下在紫外光下检测双链DNA和添加金属离子指示剂，如钙黄绿素／Mn²⁺和羟基萘酚蓝染料（HNB）（Goto，2009）。其中，SYBR Green和EvaGreen的使用有利于临床诊断，因为它们对不透明物质如蛋白质更敏感而且相对耐受，而这些物质会影响比浊信号。然而，使用非特异性检测方法的主要缺点是检测到假阳性的可能性增加。虽然LAMP依赖于4-6种不同的引物来独立地识别目标序列上的6-8个独立区间，理论上LAMP比双引物PCR具有更高的特异性。但反应体系中过多的引物DNA，而且过长的引物片段 （FIP和BIP）有可能会形成引物间的非特异性互补而形成假阳性。因此，间接检测扩增产物仍然是LAMP技术的主要缺点之一。

使用荧光探针标记核酸扩征产物的方法大量使用在qPCR中。因为荧光强度可以直接反映出产物量的多少，但由于LAMP扩增产物并不单一，使荧光探针检测扩增产物变得困难。但是，一直有学者不断创新，尝试不同方法将荧光探针的方法应用到LAMP核酸扩增产物的检测中（Vijay，2018）。Vijay等在2018年初开发出直接用荧光探针检测LAMP产物的方法，其中被标记的环状探针在其未结合状态下猝灭，仅在与其靶标（扩增子）结合时发出荧光。 所以，这种自我解链-LAMP（FLOS-LAMP）的环引物荧光，它允许LAMP扩增子的序列特异性检测 （Vajay，2018）。

逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）是一步法核酸扩增技术，通过采用LAMP和逆转录酶进行RNA检测（Notomi等，2000）。与RT-PCR一样，RT-LAMP使用逆转录酶从RNA制备互补DNA，并通过使用DNA聚合酶进一步扩增。 这种方法通过将所有引物和酶（Bst聚合酶和逆转录酶）在恒温下一起温育，可以在一个步骤中完成测定（Notomi等，2015；Mori等，2013）。 这在用RNA基因组检测病毒方面非常有效。RT-LAMP用于登革热病毒（Hu等人2015），流感病毒（Bao等人2015），丙型肝炎（Nyan和Swinson 2016），埃博拉病毒（Oloniniyi等2017），呼吸道合胞病毒（Hoos等2017）和寨卡病毒（Tian等2016）除了帮助诊断外，RT-LAMP还可用作人类病毒感染的流行病学监测系统。

目前，RT-LAMP最成功的应用之一是HIV病毒的诊断。Damhorst等人近期的研究（2015）将数字设备与RT-LAMP相结合，提供从全血中检测出HIV-1阳性的RT-LAMP智能手机图像。 该测定的敏感性为每微升全血可检测670个病毒。 数字RT-LAMP方法可用于保健机构和临床实验室的HIV阳性个体简单的手指血液中病毒检测（Damhorst等，2015）。

市场上有几种可供购买的LAMP试剂，如Loopamp TB检测试剂盒，布氏锥虫试剂盒，单核细胞增生李斯特菌检测试剂盒，用于环境检测的军团菌筛选试剂盒E，疟疾试剂盒，SARS冠状病毒检测试剂盒，弯曲杆菌检测试剂盒，肺炎支原体检测试剂盒，大肠杆菌O157检测试剂盒，隐孢子虫检测试剂盒和牛胚胎性别分型试剂盒目前均可从Eiken Chemical Co.，Ltd获得。2010年，Meridian Bioscience USA开发了另一种用于检测C.difficile的LAMP检测方法，称为illumigene® C. difficile。由于它的高灵敏度，产品一上市就颇受欢迎（Pancholi等，2012）。

★ 重组酶聚合酶扩增（RPA）

重组酶聚合酶扩增（RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件（见图2）。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物 （Piepenburg等，2006）。

图2. RPA反应过程和重组酶和引物复合物的形成

重组酶/引物复合物寻找模板DNA的同源序列（红色/蓝色）。链交换后，置换的链由gp32（绿色）结合，引物通过Bst聚合酶（蓝色）延伸。两个引物结合/延伸最终产生一个完整的扩增拷贝。重复该过程导DNA指数扩增。（Piepenburg等，2006）

RPA不但可以快速扩增，还支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量（nmol）最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光物质的兼容性都需要提前考虑。RPA还可以对模板进行定量。因为扩增产物达到可检出水平的时间，是依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增产物就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。目前大多数RPA相关产品还是由英国的Twist Dx开发的。

★ 切刻内切酶（NEAR）恒温扩增

切刻内切酶（NEAR）恒温扩增是目前相关研究最少的一种恒温核酸扩增技术。它是在2008年由Ionian科技公司的研究人员开发并申请专利的（Brain等2009）。除了链置换酶（Bst）外，NEAR反应中还需添加一个切刻内切酶。NEAR反应的引物设计需要将所使用的切刻内切酶的DNA作为序列加在引物的5' 端。NEAR反应可以分为两步，第一步，Bst和模板DNA进行反应生成含有切刻内切酶识别序列的少量DNA。这些DNA在第二步作为模板，切刻内切酶先将单链切断，Bst在进行新链合成。基本上在5-10分钟就可以形成大量新合成DNA可以进行检测。NEAR产物的检测基本上和PCR一样。可以使用SYBR Green，可以使用荧光探针，也可以使用分子探针（molecular beacon）。目前Alere是唯一一家使用NEAR技术开发人类疾病诊断试剂盒及仪器的公司。Alere的Influenza A和B的检测试剂盒基本上在13分钟内可以完成检测。另一个关于StrepA的检测试剂盒基本上在8分钟可以完成对病原菌的检测。这是关于Flu和StrepA最快的分子的检测试剂盒。

和传统的PCR技术相比，恒温核酸扩增不仅仅是缩短了核酸扩增的时间，更重要的是核酸扩增摆脱了对硬件的束缚。PCR技术原理是利用94℃高温使DNA双链解开，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下扩增DNA片段。PCR反应至少需要2个不同的温度使DNA片段得到特异性的扩增。恒温核酸扩增是利用各种酶与DNA之间的反应使核酸在同一温度下得到扩增。同时由于恒温扩增反应对扩增抑制剂的耐受性大大降低了对DNA模板的纯化的需求。这些都是恒温核酸扩增技术在分子诊断领域迅猛发展的必要因素。未来，我们期待通过更多科研工作者的不断努力，恒温核酸扩增技术可以像PCR一样具备引物设计简单，可以进行多重检测。而且也期待更多以恒温核酸扩增技术为基石诊断试剂盒不断被开发出来。

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