血浆miRNA液态活检用于癌症早期诊断的临床应用

杨博钧博士，1999年-2005年在加州大学洛杉矶分校（UCLA）取得生物化学和分子生物学博士学位，曾在哈佛医学院/霍华德休斯研究所担任研究员，主要研究方向是全基因组微阵列实验，寻找参与染色质组蛋白修饰的非编码RNA；非编码RNA和组蛋白修饰在癌症进展等，并在《Cell》、《Molecular and Celluar Biology》等期刊发表研究成果。目前任职Quark Biosciences公司副总经理。

癌症的早期发现及早期治疗是中国大健康板块的主要目标之一，目前除了影像医学及组织活检可以确诊癌症病灶之外，尚无高灵敏度的生物标记可用于癌症早筛。过去研究着重于血液循环肿瘤细胞及肿瘤突变DNA的检测开发，但以miRNA作为癌症早筛临床检测的开发却较少着墨。在过去十年中，大量研究探讨了miRNA及其作为非侵入性生物标志物在癌症疾病中的临床应用性。虽然从常规qPCR到新一代测序仪 (NGS) 的各种平台已被广泛应用于miRNA分析表达谱，但因缺乏临床使用的方便性，所以仍未能有适合癌症早筛的检测套组。本文中介绍一种新型平台PanelChip^® 分析系统，为分析血液中的微量循环miRNA表达水平提供快速、有效、灵敏且适用于临床的解决方案。通过miRNA质量控制研究（miRQC）对PanelChip^® 分析系统进行性能评估，基于滴定应答、重复性、检测率、灵敏度、特异性与动态范围等数据，证实该系统在miRNA液态活检的分析性能上，与其他同样基于纳米级qPCR的阵列技术平台相比具有一定优势。

PanelChip^® 分析系统最大的优势在于只需要极少量的循环miRNA（等同于0.004-0.008ml的血浆）即可进行miRNA表达谱分析，快速筛查癌症患者血浆中潜在的诊断生物标志物。实验流程主要分为三大步骤，包括提取血浆微小RNA（microRNA，miRNA）、合成cDNA，与进行PanelChip^® 分析。使用该平台最大特点为无须对cDNA预扩增即可进行PanelChip^® 分析，每一个芯片可以获得96个miRNA表达水平，能够有效简化实验步骤，操作容易上手，减少人为误差，实现了更短的样本周转时间。

将结合PanelChip^® 分析系统与机器学习演算法，我们开发出通过血浆miRNA表达谱便能区分健康供者与癌症患者的预测模型，准确率高达九成以上，具有极大的临床应用价值。

微小RNA（miRNA）长度为18-25个核苷酸，具高度保守性，参与许多基因调控的非编码RNA。自从1993年在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中发现第一个miRNA以来，已陆续发现更多的miRNA存在于人类和其他多细胞生物中。在人类中目前已发现超过2500种miRNA，miRNA除了参与细胞中多种生理过程的调控外，也涉及许多病理过程，与许多疾病有关，其中包括癌症。

癌症和miRNA之间的联系于2002年首次发现，在50%的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中发现两个miRNA基因缺失，这表明这两个miRNA是参与CLL病理过程的关键因素，具有因果关系。此后，大量报道显示，许多作为致癌和/或肿瘤抑制作用的miRNA在大量人类癌症的病理生理学中起关键作用。miRNA在肿瘤细胞中调节基因表达的精确分子机制仍有待阐明，尽管如此，在各种癌症的形成中具有关键作用的miRNA表达模式的研究已经产生大量数据，皆显示miRNA具有重要的早期诊断、预后评估以及复发监测的应用价值。

目前液态活检为检测发展的主要趋势，因为取样方便、在疗程中也可持续监控疗效。而循环miRNA拥有极大的潜力可作为一种新型的癌症生物标志物，主要因为其在血液中相对稳定，且除此之外，miRNA还具备了完美生物标志物的三大条件：第一，miRNA在各种癌症类型中具有特异性表达模式，而释放到血液中的循环miRNA，实验证实miRNA除了不易受到内源性核糖核酸酶（RNase）破坏之外，将血浆样本进行多次冷冻/解冻循环或是长期放在室温保存后仍可测得miRNA讯号；第二，基于miRNA涉及多种生理过程与病理过程的独特性，诸多研究表明循环miRNA可以反映宿主与肿瘤及其与微环境间的交互作用，因此可应用在癌症早筛、用药指导、预后评估、复发转移监测等全病程管理环节中；第三，侵入式肿瘤组织活检经常在癌症治疗过程中面临以下问题，例如操作较复杂、有些部位取样困难、局部取样难以呈现肿瘤全貌、有时难以取得足量癌细胞进行多项临床检验、重复取样造成患者极大痛苦、无法随时取样进行实时或定期动态监测等问题；然而液态活检可以随时以非侵入性的方式从人体中采集血液样本进行实时或定期动态监测，不仅取样风险小，也能够克服肿瘤异质性问题以提供更全面的肿瘤资讯。

本文介绍了一种新型多基因表达谱分析系统，PanelChip^® 分析系统，其能够同时分析在一片纳米孔芯片上共96个miRNA生物标志物的个别表达水平。PanelChip^® 是该系统的一个关键组件，为预先加载引物的纳米孔芯片，可扩增待分析的miRNA靶标。我们基于许多标准选择芯片上的miRNA生物标志物，主要是透过大量文献评估这些miRNA对癌症的影响度和血浆中的存在情况而决定。用于检测miRNA信号的引物是使用miPrimers™方法而设计的。该系统的另一个关键组件是PanelStation™，这是在PanelChip^® 上进行qPCR反应的热循环仪（两种关键组件均已获得美国专利：US9,724,692B2和US9,168,533B2）。目前已开发两种用于检测miRNA的PanelChip®，分别为miRSCan™ PanCancer Chip 1与miRSCan™ PanCancer Chip 2，共有164种选自miDatabase™的潜在循环miRNA生物标志物，适用于分析癌症患者miRNA表达水平。

PanelChip^® 分析系统使用qPCR作为潜在检测技术，该系统具有极高的检测灵敏度，非常适合测量各种体液中微量的miRNA表达水平，所需的起始材料量仅为2ng miRNA，用以进行cDNA合成，再以等同于0.2ng miRNA的cDNA（等同于0.004-0.008ml的血浆）进行一片miRSCan™ PanCancer Chip分析。

以miRQC平台基准分析对PanelChip^® 分析系统进行性能评估。

各种类型的平台，从常规qPCR、高密度qPCR阵列技术平台、杂交系统到NGS皆已广泛被用于miRNA的表达分析，从而发现和验证各种与疾病相关的miRNA生物标志物。杂交方法如微阵列芯片和/或NGS在发现生物标志物阶段使用，而常规qPCR则通常用于生物标志物验证阶段。

PanelChip^® 分析系统是一种基于纳米孔qPCR技术的新型多基因表达谱分析平台，我们设计并开发了两种PanelChip^®，分别为miRSCan™ PanCancer Chip 1与miRSCan™ PanCancer Chip 2，共有164个潜在miRNA生物标志物。我们首先在miRSCan™ PanCancer Chip上确定每一个miRNA簇（Cluster）的PCR效率，证明每个miRNA引物的PCR效率在90%~110%的可接受范围内。

因为miRSCan™ PanCancer Chip/PanelChip^® 分析系统是分析miRNA表达模式的新型解决方案，接下来使用Mestdagh等人开发的用于评估miRNA检测平台的miRQC平台基准分析方法，针对PanelChip^® 分析系统评估其性能。我们使用基于miRQC的各种标准样本评估滴定应答、重复性、表达差异的准确性、检测灵敏度和特异性（见表1），表明了PanelChip^® 分析系统在基于miRQC评估方法中的分析性能表现良好。

滴定应答。

为评估滴定应答，首先将通用人miRNA参考RNA标准品（UHmiRR；miRQC A）和人脑RNA（HBR；miRQC B）混合以产生4种不同滴定浓度的样本（A：100%的UHmiRR；B：100% HBR；C：75% UHmiRR+25% HBR；D：25% UHmiRR+75%HBR）。如果miRNAx在样本A中的表达高于B（Ax＞Bx），则Ax＞Cx＞Dx＞Bx。相反，如果miRNAx在样本B中的表达高于A（Bx＞Ax），则Bx＞Dx＞Cx＞Ax。正确确定顺序的能力定义为滴定应答。我们使用Mestdagh等人的分析方法分析了miRSCan™ PanCancer Chips 1&2上164种miRNA的滴定应答，以确定AUC值（表1）。通过计算理论累积分布与PanelChip® 分析系统的累积分布之间的面积来定量滴定应答。高滴定应答代表平台检测小幅表达变化的能力。PanelChip® 的AUC滴定应答为0.75，为纳米级qPCR芯片技术中一个不错的数据。

重复性。

分析两组重复的miRQC样本以评估PanelChip^® 分析系统的重复性。比较miRQC A-D重复样本的表达相关性可分为两种分群：（1）双阳性，其中在两个重复样本中确定miRNA的表达，和（2）单阳性，其中仅在一个重复样本中确定miRNA的表达。两组miRQC重复样本之间的决定系数（coefficient of determination，R2）为0.91，呈现强相关性，显示出系统的高度重复性。利用检测到的双阳性表达值，确定该系统的表达范围为18.64 log2单位，说明了系统检测广泛模板浓度的能力（表1）。

评估PanelChip^® 分析系统的参数，包括再现性、滴定、特异性、无模板对照、血浆miRNA的检测总数。群组（Cluster），miRSCan™ PanCancer Chip 1&2上的miRNA单位。截点 (Cutoff)，除去Cq值大于34的miRNA。再现性，能够在两个重复样本中检测到相同数量的miRNA的能力。独特双阳性，两个重复样本皆可检测到的miRNA百分比。单阳性分数，在两个重复样本中的一个样本中检测到的miRNA百分比。表达范围，可检测的独特双阳性miRNA的表达范围。ALC，累积分布曲线左侧的面积，其中较低的ALC表示较高的再现性。滴定，基于miRNA表达水平以正确预测miRQC A、B、C和D顺序的能力。AUC，曲线下面积，是平台滴定响应的单一坐标恒定测量指标。特异性，miRNA引物对的特异性。无模板对照，仅使用MS2噬菌体RNA。血浆miRNA，平台可检测到的miRNA总数。

检测率和灵敏度。

基于在重复样本中检测到的双阳性数目来评估检测灵敏度，PanelChip^® 分析系统检测到94.93%的双阳性率，相当于截点（Cutoff）后保留的138个miRNA中的131个。该系统的优势之一是能够检测极少量的循环miRNA（表1），使用约0.2ng miRNA即可研究健康供者（Healthy donor，HD）的表达谱。使用血浆作为样本，我们检测到78个循环miRNA（表1），说明PanelChip^® 与其他现有的qPCR平台相比，检测灵敏度较高（＞48%）。此外，与多基因qPCR阵列平台（如OpenArray^®）相比，PanelChip^® 分析系统不需要预扩增步骤，操作更为简便。

特异性。

使用不含任何miRNA的MS2-噬菌体RNA评估系统以检测特异性。系统检测显示在无模板对照反应中有10%的阳性信号，这与在其他现有的小体积qPCR平台中观察到的6.79%至10.79%的范围一致。为进一步评估特异性，将let-7家族的3种合成miRNA（let-7a-5p、let-7b-5p和let-7c-5p）掺入MS2-噬菌体RNA中。三个let-7家族成员的序列仅相差一或两个核苷酸。在cDNA合成和扩增后，PanelChip^® 分析系统显示出优异的特异性，对至少3个let-7家族成员之间皆没有交叉反应性（表1）。

动态范围。

为了确定检测的动态范围，选定参考miRNA中仅含有极微量可忽略的内源性miR-10a-5p，将合成的miR-10a-5p连续稀释后掺入在20ng通用人类miRNA参考RNA（UHmiRR；miRQC A）中进行分析。结果显示，系统能够检测至少7个数量级的合成miR-10a-5p，检测范围为每纳米孔80至8×10⁷个拷贝（图1）。动态范围再次证明了该分析系统在检测各种miRNA浓度的灵敏度。

图1. 掺入已知浓度的合成hsa-miR-10a-5p的动态范围。将一组10倍连续稀释的合成hsa-miR-10a-5p miRNA掺入相同量（20ng）的通用人类miRNA参考RNA（样本16-22，miRQC A）中，以产生用于qPCR分析的cDNA。qPCR结果表明动态范围至少为7个数量级，范围从每纳米孔80至8×10⁷个拷贝。

miRNA表达谱分析平台的最终目标是确定癌症与健康供者血浆样本之间的表达差异。为了说明这一点，接下来使用了PanelChip^® 分析系统和miRSCan™ PanCancer Chip 1&2来比较健康供者和癌症患者之间的血浆miRNA 表达模式。

为确定是否可以使用PanelChip^® 分析系统发现癌症患者的特异性血浆miRNA生物标志物，我们首先招募38名口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者和84名健康供者进行研究。从血浆样本中分离总小RNA并合成cDNA，用在miRSCan™ PanCancer Chip 1&2上分析，以获得OSCC患者与健康供者的miRNA表达谱。支持向量机（SVM）在多项研究报导中已被用于开发癌症/疾病分类器，我们决定利用它来建构基于血浆样本中miRNA表达谱的OSCC分类器。给定的数据集（包含从OSCC患者和健康供者中获得的两个类别）被分成训练集（90%的数据集）和测试集（10%的数据集）。基于10倍交叉验证，训练集用于训练OSCC分类器，测试集用于评估OSCC分类器的性能。根据分析结果，OSCC分类器对OSCC预测的灵敏度为81.6%，特异性为98.8%（表2）。由于目前没有用于筛选OSCC的分子生物标志物，我们的分类器对于OSCC的诊断具有潜在价值。由于分类器特异性高，也适用于鉴定健康个体。

HD，健康供者。OSCC，口腔鳞状细胞癌患者。正确类别，受试者的实际临床状态。预测类别，使用算法预测的受试者的临床状态。TP，真阳性。FP，假阳性。FN，假阴性。TN，真阴性。灵敏度，TP/（TP+FN）=81.6%。特异性，TN/（TN+FP）=98.8%。精度或阳性预测值（PPV），TP/（TP+FP）=96.9%。阴性预测值（NPV），TN/（TN+FN）=92.2%。ACC，（TP+TN）/（TP+FP+FN+TN）=93.4%。

出于本研究目的，OSCC分类器的诊断性能没有考虑诸如肿瘤的临床病理状态和患者年龄、性别、种族或槟榔咀嚼/吸烟习惯等因素。OSCC分类器由134个miRNA组成。我们接下来确定了健康供者和OSCC患者血浆中检测到的miRNA（134个之中）的平均数量。我们仅使用0.2ng miRNA作为模板，分别在健康供者和OSCC患者中检测到93和97个miRNA（表3）。与组织样本相比，血浆中miRNA的表达水平通常较低，但PanelChip^® 能够检测到大量血浆miRNA，表明该系统非常灵敏，适合检测循环miRNA。

HD，健康者。OSCC，口腔鳞状细胞癌患者。正确类别，受试者的实际临床状态。预测类别，使用算法预测的受试者的临床状态。TP，真阳性。检测数量，在血浆中检测到的miRNA平均数量。

透过上述结果证实了结合PanelChip^® 分析系统与支援向量机可建构OSCC诊断的预测模型，我们进一步将此技术用于分析多种癌症患者在治疗前与治疗后的血浆miRNA表达谱，建构出多种癌症诊断的预测模型。如表4，基于10倍交叉验证的结果，癌症分类器对多种癌症诊断的灵敏度为93.8%，特异性为84.2%，准确率达90.2%，显示此模型有极佳的预测能力区分癌症患者与健康供者的血浆miRNA表达谱。基于这些结果，我们所开发的血浆miRNA液态活检技术平台，对于多种癌症筛查具有极大的临床应用价值，目前正进行大规模临床试验，以验证该模型的预测能力，同时透过大量临床试验数据不断进行优化，以提高模型的预测能力与稳定性。

HD，健康者。Cancer，癌症患者。正确类别，受试者的实际临床状态。预测类别，使用算法预测的受试者的临床状态。TP，真阳性。FP，假阳性。FN，假阴性。TN，真阴性。灵敏度，TP/（TP+FN）=93.8%。特异性，TN/（TN+FP）=84.2%。精度或阳性预测值（PPV），TP/（TP+FP）=91%。阴性预测值（NPV），TN/（TN+FN）=88.9%。ACC，（TP+TN）/（TP+FP+FN+TN）=90.2%。

近年来，miRNA与癌症相关性的研究进展迅速，已累积许多重要研究成果与技术。其中，越来越多研究证实了循环miRNA在癌症早筛、用药指导、预后评估及复发转移监测等方面具有相当显著的临床应用优势。

然而，循环miRNA在进入临床实践中，仍面临许多技术上的问题与挑战：第一，血液中循环miRNA的含量较低，需要高灵敏度的检测平台，同时要有严谨的品质规范，避免假阳性或假阴性反应；第二，液态活检项目的成本偏高，若要普及化需要开发新技术以降低检测成本；第三，液态活检目前缺乏统一的检测技术与标准，由于各实验室使用的检测手段不同，可能产生不同的检测结果。因此，各机构检测结果的通用性、可重复性与分析有效性仍需进一步验证；第四，样本收集过程包括抽血细节、使用的采血管、血浆分离方法、样本保存方式、核酸提取方式、操作人员素质差异等因素，都会造成误差而影响实验结果。因此，建立一套严谨的标准操作流程为必要条件，才能产生可靠的分析结果，提高检测准确性。

综上所述，若能结合适合的高灵敏检测技术平台并解决目前面临的问题，循环miRNA在临床应用中非常有潜力成为新一代的生物标志物。本文所介绍的PanelChip^® 分析系统，为一种新型、灵敏度高的中密度分析平台，除了操作容易上手之外，同时简化了人工操作步骤以缩短样本周转时间，可有效降低检测成本，为发现与验证生物标志物提供了快速的解决方案。透过该系统开发的血浆miRNA检测平台，从血液采集、血浆分离到PanelChip^® 分析等所有步骤，均透过一套严谨的标准操作流程加以控管。我们已证明了PanelChip^® 分析系统用于检测微量循环miRNA的优越性能，仅需微小起始量的miRNA（0.2ng）即可发现具有癌症特异性的miRNA表达模式。该系统在miRQC平台基准评估中显示分析性能良好。最后，透过癌症患者与健康供者的血浆样本再次证明了该系统在癌症诊断用途的能力。结合机器学习算法与该分析系统能够以高达九成以上的准确度预测个体健康状态。从其在miRNA表达分析中的表现来看，我们认为PanelChip^® 分析系统可以在癌症中发现具有特异性的miRNA表达模式，加速建立癌症分类器，实现对无症状人群进行早期癌症筛查的检测需求，以达到早期诊断、早期治疗的最终目标，大幅提升癌症治愈率。