白蛋白检测问题

一、白蛋白检测方法回顾

1、上世纪20年代的盐析技术

1921年Howe发表文章，使用硫酸钠沉淀球蛋白，来检测血液中的蛋白。在1938年的Gradwohl的“临床实验室方法和诊断”第二版中，已经采用了该方法原理检测血清中的白蛋白。但是检测蛋白用的是酚试剂。以1.5mol/L的硫酸钠沉淀球蛋白，以Kjeldahl定氮方法或双缩脲方法检测上清液内的白蛋白。盐析方法在国内一直持续到上世纪的70年代。这是一个非常耗时、难以得到可靠结果的方法。临床实验室一直呼吁有直接检测方法。

2、染料结合法

甲基橙是第一个染料，很快有了羟基苯偶氮苯甲酸（HABA），用于与白蛋白结合的检测方法。甲基橙和羟基苯偶氮苯甲酸（HABA）是1950年代最先被引入的用于检测血清白蛋白的染料。甲基橙从来没有被临床实验室接受，因为它的特异性很差，而HABA在1960年代发现有着有限的使用。这些方法一般均依据有机染料与白蛋白结合后使颜色发生变化；染料通常为pH指示剂，所以，必须以缓冲液控制反应混合物的pH[2,3]。HABA在发现被胆红素和各种药物的干扰后名声底下，逐渐被溴甲酚绿（BCG）替代。

Rodkey于1965年推荐了BCG与白蛋白结合的检测方法，但是在pH7.1处试剂空白的吸光度非常高。在BCG的中性缓冲液中，加入白蛋白后因白蛋白与染料的结合使吸光度下降。成为一个方便和直接的检测人血清中的白蛋白方法。将血清用缓冲的BCG溶液进行适当的稀释后，可基本上使吸光度的变化与白蛋白浓度呈线性。在615nm比色，不受胆红素和血红蛋白的干扰。对于极度脂血、混浊的血清亦可以被准确检测。试验说明BCG不与球蛋白结合。磺酞指示剂的阴离子与血清白蛋白结合。在中性pH，白蛋白对BCG的二价阴离子具有高度亲和力，由于从游离的指示剂转换为白蛋白-指示剂的复合物，使615nm处的吸光度有很大的下降。这样可用于成为检测血清中白蛋白的分析方法。本方法较以往的比色方法灵敏得多，对仪器和技术的要求较低。因为白蛋白-BCG复合物有着非常高的结合常数，本方法相对无其他蛋白组分的竞争性干扰。

Bartholomew和Delaney同一年推出应用pH~4。改变了Rodkey的BCG试剂pH，从原pH7.15改为pH3.8。在pH7.15处其吸光度约为2.5。在自动分析仪记录上是一个峰，但重复性很差，因为自动分析仪的管道内被蓝色沉淀覆盖—这是BCG与白蛋白的反应产物，它不是水溶性的。 

Doumas介绍现今BCG方法的产生[5,6]。他说：“1967年，来自巴拿马的Osvaldo Hernandez的培训者，在Alabama医学院的临床病理部门，希望在费城的AACC年会上有一个报告，问我（Doumas）给他一个题目。我告诉他采用Bartholomew和Delaney的溴甲酚绿（BCG）方法，在Technicon的自动分析仪上进行血清白蛋白的检测。为了消除在分析仪中管道内的BCG-白蛋白复合物的沉淀，设想在BCG试剂内加入表面活性剂Brij-35（消除自动分析仪方法的最大问题）。结果表面活性剂却使BCG试剂颜色转变为淡黄色，并消除了蓝色沉淀，但记录的峰依然还在。这就是BCG白蛋白方法的诞生。在AACC会议上的报告得到大家很好的反应，会议主席问‘这个方法真的那样简单？’事实上的确是那样简单。”

BCG对于白蛋白缺少特异性、对血清标本进行两个步骤（快速和缓慢）方法在Doumas等原先文献进行了报道。除了它在特异性上的不利作用外，选择了10分钟反应时间，使BCG方法的结果与电泳接近，当时被考虑为血清白蛋白检测的标准方法。

但该BCG方法缺少特异性，特别在低白蛋白和高白蛋白浓度时，被许多研究者确认；发现因BCG与“急性相反应素”的反应和血清内α-与β-球蛋白组分的反应所致。Gustafsson在血清与试剂混合后的即刻检测吸光度，预防了其他血清蛋白的结合。确实改善了BCG方法的特异性。Gustafsson的发现被多个研究者肯定，用于多个临床实验室的仪器。

对BCG试剂的改良也改善了特异性，现试剂内含有0.3mmol/L BCG、pH4.2的50mmol/L琥珀酸缓冲液、8ml的30%Brij-35、或加入NaCl（0.8mol/L）至BCG试剂。临床仪器校准品的白蛋白值通过与纯人白蛋白得到的标准比较设定。以人血清为基础的校准品内白蛋白值若在BCG试剂的pH或Brij-35的少量变异下没有影响。白蛋白值和BCG试剂内Brij-35浓度间呈反向关系。不可使用牛血清或BSA为基础的校准品。 

BCG被确认对白蛋白不是绝对专一的，因为它也与α1-和α2-球蛋白反应。但若反应时间较短（＜25s），正偏倚在1.5g/L到5.0g/L间，平均为3.7g/L。并在血清白蛋白浓度范围内较恒定。为了改善特异性，许多实验室采纳了溴甲酚紫（BCP），BCP较BCG对白蛋白更特异。Louderback等于1968年短篇报道了检测血清白蛋白的BCP方法；以后1970年由Carter报告了较详细的内容。成为自动化方法并评价它的准确度的报告是1978年的Pinnell和Northampton。因为发现BCG方法对非白蛋白的“缓慢”反应，期望寻找特异的染料结合方法，在此需求下，BCP方法出现了。这样BCP方法应运而生。

今天，依据CAP的临床化学调查资料，有54%报告的结果为BCP方法，47%的为BCG方法。BCP方法的血清白蛋白浓度与Laurell电泳免疫检测间具有很好的一致性，而与BCG比较时，BCG的白蛋白结果约高出6.8g/L（恒定误差）。BCP对白蛋白的特异性被多个研究者确认，虽然报告了方法的数个缺点。但是，似乎被国内很多实验室认为：BCP检测的白蛋白结果要比BCG方法的检测结果要特异和可靠。

3、BCP的问题

BCP低估了与胆红素共价结合的血清白蛋白（δ-胆红素）。对于进行长期血液透析的小儿科病人，BCP的白蛋白值在平均水平上偏低7g/L，这是与免疫电泳检测比较得到的；对于肾功能不良病人的白蛋白也偏低。对于连续腹膜透析（CAPD）的慢性肾衰病人的血清白蛋白浓度，BCP方法可以准确检测；但进行血液透析治疗的病人，其血浆白蛋白浓度被低估了。 对血液透析治疗病人的血清白蛋白浓度低估，是因3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸（CMPF），存在于尿毒症血清内的主要内源性配体物质。进行CAPD或血液透析的病人，具有的血清CMPF水平，相对于健康个体，各自要高出2倍和3.5倍。

4、肝素的干扰问题

肝素也被报告会干扰BCG和BCP方法。BCG方法中血液肝素浓度为90单位/ml的，使血清白蛋白浓度平均减少1.3g/L；当血液收集于7ml肝素化管内，使内含肝素浓度在20单位/ml的，白蛋白不受干扰。该干扰是因使用肝素化血浆替代了血清，形成浊度所致；在BCP方法，可以使乙酸缓冲液摩尔增加至0.25mol/L、或使用含有0.15mol/L NaCl的0.1mmol/L乙酸缓冲液，均可消除干扰。

5、BCG还是BCP？

这两个方法均具有优点和缺点，而BCP方法相对于BCG方法并没有明显的优点。BCP的潜在缺点是不同白蛋白制品的BCP-HSA复合物吸光度的变异超过BCG-HSA复合物的吸光度。在Boumas实验室，不同来源的七个不同HSA制品（所有显示纯度＞98%，电泳法），以总蛋白分析，以BCP和BCG（25s孵育时间）程序分析白蛋白。结果见表1。

表1. BCP方法对于不同来源纯人白蛋白反应结果不一致

上表结果说明HSA制品相对于BCG响应的变异，要好于BCP的响应。可以预期：以BCG为校准品的白蛋白定值不确定度，要小于BCP方法的设定。

表2. CAP室间调查结果

表3. 两个方法参考区间一样

CAP调查资料说明了，1995年的6100个参加实验室的64%使用了BCG、34%使用BCP。由于BCP较佳的特异性，有人估计在调查标本中的白蛋白值，BCP的要低于BCG约3~5g/L。但是，实际不是这样，很惊讶的是BCG的结果均值要比BCP偏低1.9~3.9g/L（见表2）。但是两个方法报告的正常值（参考区间）在许多情况下这两个方法是一样的（见表3）。

6、临床应用上BCP面临问题很大

BCP方法尽管较特异，但对接受血液透析病人的白蛋白检测偏低，由于存在着3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸（CMPF），这是内源性尿毒症的毒素，它存在于连续流动腹膜透析的情况下。这个干扰是严重的缺点；但是CMPF对BCG方法没有干扰。 

在评估病人营养的慢性状态中白蛋白水平值已经不断地被认识到了。即使在将来，白蛋白已经被发现是一个未来健康是否良好的指示。

白蛋白浓度与进行肾透析的病人和肾移植病人的存活长短，以及与老年中风病人康复的进展，与骨髓瘤、肝胆硬化和心脏手术等减少发病率和死亡率有着非常相关的关系。

白蛋白的好处与它的浓度即使在正常范围内也与健康呈比例关系；年龄＞71岁的群体中，具有白蛋白水平在＞43g/L的，与水平在41~43g/L的作比较，死亡率可减少20%~40%。应通过保持血液容量、通过它作为一个抗氧化剂或通过其他代谢功能的保持等的作用，去实现白蛋白对人健康长寿的好处。

上世纪90年代美国对白蛋白的要求：美国健康护理经济行政管理（HCFA）对肾病最后阶段（ESRD）的网络管理部门和“使用ERSRD健康护理专业”组，在他们形成透析机构的质量保证过筛指标中包括了血清白蛋白。腹膜透析病人和所有儿科病人，指标为血清白蛋白＞30g/L。

Blagg等比较了235名随意选定透析病人的血清白蛋白浓度，发现BCG方法均值为38g/L，而BCP和免疫散射比浊方法的均值为33g/L；血清白蛋白在BCG和BCP间的平均差异为5g/L，这是从健康成年人的121个样品得到的。在评审这些发现时，Blagg等相信HCFA指标仅对BCG方法是有效的；建议BCP方法的血清白蛋白浓度指标：对于血液透析病人为30g/L，对于腹膜透析病人为25g/L。

在肾移植后低白蛋白血症被认可为死亡率的独立风险因子。在血液透析下的病人白蛋白浓度，较之尿素减少率是更明确的死亡风险的预示指标，死亡的高可能性与偏低的白蛋白浓度有着高度联系。

二、BCG和BCP的染料结合方法至今不清楚反应原理

至今，这样简单的检测方法，其真实反应原理没有弄清楚过。只知道染料能与白蛋白上的某些位置有结合。再则，至今连一个可以为这样的检测方法使用的参考物质都没有。很长时间都一直在使用ERM 470k/IFCC（原CRM 470）为一级参考物质。2013年国际著名专家做过实验，写了文章。文章认为，在ERM-DA470k/IFCC证书内，白蛋白的确认值和有关的不确定度分别为37.2g/L和1.2g/L。这个参考物质由诊断厂商用于直接为他们的方法校准品定值。但是，这个转换正确度的工作，为了不中断计量溯源性链，只有在展示了物质的互换性下方可实施。近期的工作显示了，被检测白蛋白，ERM-DA470k/IFCC检测白蛋白与天然人血清，使用透射比浊和散射比浊检测具有相同表现，确认这个物质是可互换的。

图1. ERM-DA470k/IFCC在免疫散射比浊和免疫透射比浊方法间，与患者样品具有互换性。

我们评价了Roche的Tina-quant的白蛋白第二代免疫透射比浊检测产品性能为示例，在Roche Cobas c501分析仪上，使用两个不同批号的试剂。注意这是BCG方法对白蛋白的检测。相隔5个月，在两个相同的实验中检测ERM-DA470k/IFCC的白蛋白浓度。十分惊讶的是，检测ERM-DA470k/IFCC得到的值明显低于预期值，实验均值的均值（34.9g/L）和靶值（37.2g/L）的平均偏移为-6.2%。这个示例强烈地说明：在实现临床实验室常规检测的溯源性中，即使有了被确认的参考物资，但是，这样的参考物质在常规检测中，与诸如白蛋白的染料结合方法（BCG、BCP）一起使用时，这些方法的反应原理都不清楚下，又使参考物质与病人新鲜标本间不具有互换性了！如果实现互换性，该参考物质被常规方法检测的白蛋白值与白蛋白批准值（37.2g/L)应该一样，可惜现在差了2.3g/L！没有互换性。还是被测量的不同。

还是2013年，著名的美国专家Miller WG、Doumas BT、和Lo SF，对美国临床病理学会的室间质量评估中，使用了可以互换的样品检测白蛋白和总蛋白的结果，进行了评估。

结论是，依据生物变异的指标，无论BCG还是BCP的白蛋白方法仅因变异系数值均不具有满意性能。CLIA指标仅考虑不精密度，看来在目前现状下较合适；因为缺少血清白蛋白的协同参考物质和参考物质。由此，现今认识常规的染料结合方法的BCG或BCG白蛋白检测具有溯源性，根本是虚假的。

三、白蛋白检测的前景

目前，世界上越来越重视肾病的透析病人、晚期的肾衰病人、重症监护病人、老年病人等的预后。观察他们血液内白蛋白浓度的含量，是非常重要的指标。可惜文献报道认为，只有使用免疫透射比浊或免疫散射比浊的方法，方可正确了解他们的真实白蛋白浓度。

IFCC的报告充分说明了，现有的染料结合方法尽管使用了国际认可的ERM-DA470k/IFCC（原CRM 470）为参考物质，但因该参考物质只是为免疫方法可提供参考作用；对于使用染料结合方法的白蛋白检测，从“被测量”的认识上，它们从本质上完全与染料结合方法是两个被测量，不可通用ERM470k！换言之，至今国际上尚无适用于染料结合方法的白蛋白参考物质和参考方法。现有的各个公司声明，叙述BCG和BCP方法具有溯源性均为虚假！因此，临床期望得到可靠白蛋白结果，看来将会逐渐考虑采用免疫方法检测人血清白蛋白。

四、最新的报道[9]

白蛋白是血浆的主要成分，约占总蛋白的60%。它是一个非常重要的临床生物标志物，特别在低值时。所以，检测必须准确和稳定。经常使用染料结合方法，如BCG或BCP检测血浆/血清的白蛋白。许多厂商和实验室使用了WHO发表的清单。该清单建议，常规临床生物化学分析物在分析物本身的是固有的，与材料、使用的管子或分析方法无关。我们怀疑这是问题，我们进行了研究储存于第二试管中血浆白蛋白稳定性。对实验室这是一个重要的问题，使用第二试管转运血浆。正如我们实验室一致在做的。

样品收集和准备：静脉全血收集于门诊患者，由经验丰富的采血者采集。对非空腹成年人10人进行静脉采集全血，置于10ml的肝素锂真空采血管内，共两支。初始样品仅离心并在90min内分析。为确保样品均匀，各个患者血浆倒于11.5ml的第二试管混匀，即刻对这个第二试管内样品进行分析。然后，将血浆分为11份，置于3.5ml的第二试管内。试管储存于5℃或21℃，直至分析（5个患者样品置于每个温度）。

在c702 Cobas 8000的临床化学module（Roche）上进行白蛋白的BCP和BCG检测。为了避免分析变异，每个样品进行4次检测使用均值。仪器在该阶段的标准变异为BCP 1.2%和BCG 1.3%。

图1A为BCP检测白蛋白随时间在增加。在21℃下1天或5℃下3天，会增加高于2.15%（消除偏移的目标）。约5天储存后增量达到表现最大，21℃下增量＞7%；5℃下增量＞5%。比较之下，图1B显示了BCG的白蛋白结果。发现没有显著的变化。图1C概括地显示了，五个各个样品在21℃的实施非常相似。

为了说明问题，作者回顾性地收集以往检测白蛋白结果进行分析。

白蛋白检测均值来自实验室信息系统（2012.1~2014.11）。数据被限制在所有门诊患者，这样预期是均匀的。一部分样品在门诊收集，一部分来自私人医生诊所（GP）。实验室对门诊患者收集的样品，在90min内对原始管经离心和分析。收集GP的样品送到实验室，通过两个不同类型；由GP分装在第二试管的血浆经普通邮件或全血运送服务（21℃）送达。普通邮件约存放在室温16个小时，运送服务则离心和分析＜6小时。在评审阶段，使用两个不同分析方法：BCG和BCP（Roche）。

图2：第二试管储存在5℃（-*-）或21℃（-θ-）的检测白蛋白浓度图示。

图A和图B中，是在每个时间点下五个血浆样品normalised标准化至原始管的均值。每一点以均值与均值标准误表示。（A）是BCP方法，（B）是BCG方法。（C）在21℃储存后，五个样品患者血浆BCP均值（每个样品四次检测）。asterisk星号表示该时间点的差异超出了相对于原始管的2.15%（p＜0.05），这是由配对t-检验确定的。白蛋白浓度的初始范围为：25~43g/L（BCP）和33~49g/L（BCG）。

表1显示了临床数据。对两个相似患者群体的白蛋白进行了比较；样品收集在GP或样品收集在实验室门诊的。这些数据展示了BCP方法对白蛋白检测，对储存/运送的第二试管内的血浆较灵敏。所有三个年龄区间展示了在均值上的差异＞0.7g/L（~2%）（p＜0.05），将实验室对门诊患者收集的样品，与GP收集的样品、并转送到实验室的在第二试管内的血浆进行比较。在GP收集的样品以全血（转送服务＜6h、21℃）、或样品以BCP方法检测，列出的年龄区间均值间差异，与最小的偏移目标比较不显著。

我们以两个不同方法和两个不同温度下，检查了血浆白蛋白的稳定性。当样品储存在第二试管内，我们发现两个广泛使用的方法（BCP和BCG）间的差异。在考虑以生物变异导出的最小性能指标2.15%[5]下，使偏移超出这个指标的时间限值（显著水平p＜0.05）的是：21℃为1天；5℃为3天。在这个检测阶段，BCG给出稳定的结果。来自实验室信息系统限制的患者均值，支持了观察的稳定性结果。BCP方法对储存于第二试管敏感，而BCG则显示稳定的结果。

作为常规的生物化学分析物，白蛋白的稳定性会被经常考虑为在分析物本身是固有的，或至少在方法的供应者那里是这样考虑的。我们发现即使相似的方法也不是的。样品或分析物稳定性，由于良好原因，经常关心于全血和分析前阶段。多个研究了全血运送对常规分析物的影响。与我们的研究相反，一些研究已经展示了，分离了细胞的白蛋白可稳定1周。但是，许多上述研究，没有注意对于白蛋白的方法是BCG还是BCP。

我们也实验了原始管和第二试管（供应者和材料）、管塞、水平和垂直保存等的各种组合。但是，经储存后观察到BCP的白蛋白升高是不可避免的（数据没有展示）。因此，依赖于方法的白蛋白偏移，应是非添加剂所致干扰的因素。

总之，我们的研究显示了，在第二试管内白蛋白的稳定性，取决于使用的方法。血浆的储存和以BCP方法的检测，引起白蛋白值的升高。在21℃下的储存的1天后、在5℃下的储存的3天后，会超过最低性能指标，这是与储存于原始管内样品比较的结果。即使仅仅一个白蛋白检测，具有很小或没有影响患者的诊断和治疗，但是，在血浆储存后观察到的偏移太大不可忽视。

总 结

一个简单的白蛋白检测，却会引出这么多的问题，令人惊叹。离奇的是，连一个样品在运送过程中，还会出现BCG和BCP方法间检测结果的差异！但这又是实验室经常会遇到和发生的！由此，我呼吁临床实验室要像丹麦的实验室那样时刻关心着患者的结果；因为，结果的高低尽管不大，但是从统计学上已经是显著的。对于某个肾病患者来说，高一点或低一点也许会严重影响他的情绪，甚至他的生命。务请关注每个检测结果的可靠性！

文献

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Rutstain DD, Ingenito EF, Reynolds WE, Burke JM. The determination of albumin in human blood plasma and serum. A method based on the interaction of albumin with an anionic dye-2-(4'-hydroxybenzeneazo)-benzoic acid. J Clin Invest 1954;33:211-221.

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Doumas BT，Watson WA，Biggs HG. Albumin standards and measurement of serum albumin with bromcresol green. Clin Chim Acta 1971;31:87-96.

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Lo SF, Miller WG, Doumas BT. Laboratory performance in albumin and total protein measurement using a commutable specimen. Results of a College of American Pathologist Study. Arch Pathol Lab Med.2013;137:912.

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