“即刻法”和“双质控法”质控 在ELISA法中的应用

ELISA检测方法是免疫学诊断中一项常用技术，但是受加样、温度、孵育时间、洗板、显色等因素的影响，导致有一定的假阳性或假阴性，给结果判读带来一定的干扰；因此，在实际工作中要进行质量控制。

对于检测样品数量少或检测次数少的基层初筛实验室，采用在常规条件下连续测定外部对照质控血清20次（天）后，绘制Levery-Jennings质控图进行质控，存在一定的难度。并且在质控图未做出前，不能即时进行实验监控，这就失去了质控意义。对样品检测的同时进行“即刻法”室内质控，此方法只需连续检测3次，即可对第3次检测结果进行质控，有效弥补了上述不足。但在实际工作中发现“即刻法”也有其局限性，所以采用“即刻法”结合“双质控法”对感染性标志物检测结果进行质控。

一、检测方法：采用ELISA法检测，设阴性、阳性对照，测定质控血清，严格按试剂盒说明书操作，以双波长（450nm，630nm）比色，临界值cut-off值（CO）计算方法按说明书，并以S／CO值表示室内质控值，从第3次检测开始使用“即刻法”对结果进行质控，先计算3次S／CO值的均值（ ）和标准差（s），再计算SI上限，SI下限，查SI值表判断质控结果有无失控，若结果处于“告警”或“失控”状态应舍去，并重新测定质控血清和样本；若结果处于控制范围内，继续检测并计算。其具体做法如下：

1. 将连续的质控测定值按从小到大x1，x2，x3……xn（x1为最小值，xn为最大值)。

2. 计算均值（ ）和标准差（s）。

3. 按下述公式计算SI上限和SI下限：SI上限 =（xmax-  ）/s；SI下限 =（  -xmin）/s。

4. 将SI上限，SI下限与SI值表中的数字进行比较：

1）当SI上限和S下限均小于n2s时，表示处于在控，可以继续测定；

2）当SI上限或SI下限均处于n2s和n3s之间时，即处于“告警”；

3）当SI上限或SI下限均大于n3s时，即为“失控”;

4）对处于“告警”或“失控”状态的数值，应当剔除最大偏离值而不是剔除末次测定值（从“即刻法”的计算公式也可看出SI上限和SI下限分别代表最大值和最小值，而不是代表末次测定值。在出现SI上限或SI下限值＞n2s值时，说明该组测定值中最大值或最小值告警，而不是末次测定值告警）。

二、双质控法：当新旧试剂批号更换时，在旧试剂结束前，将新批号试剂2列（16孔）与旧试剂酶标反应孔适量卡入常规8排96孔的空酶标板，构成1个新旧试剂组合的酶标反应板。2种批号试剂的酶标反应孔均加入同一质控血清和部分同样样本，新旧批号试剂的酶、底物、终止液等相关试剂不可混用。同板检测3次。旧试剂质控的OD值纳入原数据组继续用“即刻法”分析。新批号的质控OD值纳入旧批号质控数据组用“即刻法”分析的同时，进入新一组数据按“即刻法”分析，但在第3次检测及以后，新批号试剂质控OD值只在新组数据分析。更换质控血清时，用试剂同板检测3次，按上述方法随数据进行分析即可。

三、注意事项：

1、即刻法其结果易受前3个质控数据的影响：在统计学中样本量少时容易出现抽样误差，当前3个质控值的CV值在10～15，第4个质控值CV允许＜41，不满足临床实验室要求CV值＜20，所以前3次的质控结果对于“即刻法”就显得尤为重要。

2、由于即刻法是从当天以前（含当天）的所有测定值中找出最大值和最小值，因此用“即刻法”进行室内质控时，在测定次数较少时有些离群值可能不一定会显示失控，但随着测定次数的增加，测定值逐渐趋于稳定，这时以前的离群值将“暴露”出来显示为失控，将这些离群值称为“迟后异常值”。迟后异常值就是某一测定值当天用即刻法判断为极值，在控，但随着数据的增加，后来判断为异常值，属于“告警”或“失控”。这一现象也称为“回顾性失控检出”，为该方法的一大不足之处。

3、实际工作中发现ELISA试剂盒效期短，更换试剂盒批号后无法对第1次和第2次结果进行监控，即“即刻法”无法对新批次的第1次和第2次结果质控，所以采用“双质控法”对新批次前2次检测结果进行了质控。

应用“双质控法”来加强和完善“即刻法”室内质控，并在数据满20次后结合L-J图，建立一个全面的质量管理体系，进行回顾性分析，为以后质控积累经验。

附SI值表：